Identificación de péptidos de pequeñas vesículas extracelulares a partir de macrófagos derivados de la médula ósea

Resumen

Este protocolo describe un procedimiento para aislar pequeñas vesículas extracelulares de macrófagos mediante ultracentrifugación diferencial y extraer el peptidomo para su identificación por espectrometría de masas.

Resumen

Las pequeñas vesículas extracelulares (sEV) suelen ser secretadas por la exocitosis de los cuerpos multivesiculares (MVB). Estas nanovesículas con un diámetro de <200 nm están presentes en diversos fluidos corporales. Estos sEV regulan diversos procesos biológicos como la transcripción y traducción de genes, la proliferación y supervivencia celular, la inmunidad y la inflamación a través de sus cargas, como proteínas, ADN, ARN y metabolitos. En la actualidad, se han desarrollado diversas técnicas para el aislamiento de los sEV. Entre ellos, el método basado en ultracentrifugación se considera el estándar de oro y se usa ampliamente para el aislamiento de vehículos eléctricos. Los péptidos son naturalmente biomacromoléculas con menos de 50 aminoácidos de longitud. Estos péptidos participan en una variedad de procesos biológicos con actividad biológica, como hormonas, neurotransmisores y factores de crecimiento celular. El peptidomo está destinado a analizar sistemáticamente péptidos endógenos en muestras biológicas específicas mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS). Aquí, introdujimos un protocolo para aislar sEVs por ultracentrifugación diferencial y extrajimos peptidoma para su identificación por LC-MS/MS. Este método identificó cientos de péptidos derivados de sEVs de macrófagos derivados de la médula ósea.

Introducción

Las pequeñas vesículas extracelulares (sEV) con un diámetro inferior a 200 nm están presentes en casi todos los tipos de fluidos corporales y son secretadas por todo tipo de células, incluyendo la orina, el sudor, las lágrimas, el líquido cefalorraquídeo y el líquido amniótico¹. Inicialmente, los vehículos eléctricos se consideraron como receptáculos para la eliminación de desechos celulares, lo que llevó a una investigación mínima en la década siguiente². Recientemente, cada vez hay más pruebas de que los sEV contienen proteínas, lípidos, ácidos nucleicos y otros metabolitos específicos. Estas moléculas son transportada....

Protocolo

1. Aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares

NOTA: Realice toda la centrifugación en los pasos 1.1-1.11 a 4 °C.

1. Preparación de suero fetal bovino (FBS) libre de sEVs: Centrifugar FBS durante la noche a 110.000 × g a 4 °C a través de una ultracentrífuga (ver Tabla de Materiales) para eliminar los sEVs endógenos. Recoja el sobrenadante, filtre, esterilícelo con una membrana de ultrafiltración de 0,2 μm y guárdelo a -20 °C.
2. Coloque aproximadamente 3 x 10⁷ macrófagos inmortalizados derivados de la médula ósea (iBMDM) en una placa de cultivo de 150 mm y agregue 20 m....

Discusión

Al investigar la función de los sEV, es imperativo obtener sEV de alta pureza a partir de muestras biológicas complejas para evitar cualquier contaminación potencial. Se han desarrollado una variedad de métodos para el aislamiento de los sEV¹³, y entre estos métodos, los métodos basados en la ultracentrifugación diferencial han demostrado una pureza relativamente alta de los sEV. En este estudio, se recolectaron 200 mL de sobrenadante celular durante 6 h, y se obtuvieron alrededor de 200-30.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA Protein Assay Kit	Beyotime Technology	P0012
CD9	Beyotime Technology	AF1192
Centrifugal filter tube	Millipore	UFC5010BK
Centrifuge bottles polypropylene	Beckman Coulter	357003	High-speed centrifuge
Chemiluminescent substrate	Thermo Fisher Scientific	34580
Dithiothreitol	Solarbio	D8220	100 g
DMEM culture medium	Cell World	N?A
GRP94	Cell Signaling Technology	20292
High-speed centrifuge	Beckman Coulter	Avanti JXN-26	Centrifuge rotor (JA-25.50)
Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM)	National Institute of Biological Sciences, China		Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China)
Iodoacetamide	Sigma	l1149	5 g
Microfuge tube polypropylene	Beckman Coulter	357448	1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge
nano-high-performance LC system	Thermo Fisher Scientific	EASY-nLC 1000
Nanoparticle tracking analysis	Malvern Panalytical	NanoSight LM10	NanoSight NTA3.4
Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific	N/A
Phosphate-buffered saline	Solarbio	P1020
Polyallomer centrifuge tubes	Beckman Coulter	326823	Ultracentrifuge
Protease inhibitor	Bimake	B14002
SpeedVac vacuum concentrator	Eppendorf	Concentrator plus
Tabletop ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima MAX-XP	Ultracentrifuge rotor (TLA 55)
Transmission electron microscope	HITACHI	H-7650B
TSG101	Sigma	AF8258
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima XPN-100	Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti)
Ultrasonic cell disruptor	Scientz	SCIENTZ-IID
Western Blot imager	Bio-Rad	ChemiDocXRs	Image lab 4.0 (beta 7)
β-actin	Sigma	A3853