使用 LC-TIMS-TOF MS/MS 进行芬太尼类似物筛选

摘要

一种根据芬太尼类似物的保留时间、迁移率和质谱碎裂模式筛选芬太尼类似物的方法。

摘要

近几十年来，芬太尼的使用和芬太尼类似物的出现已成为整个社区越来越关注的问题。芬太尼及其类似物是美国致命和非致命过量服用的主要因素。最近与芬太尼相关的过量病例与非法制造的芬太尼及其相关的极端效力有关。在本工作中，我们描述了一种用于筛选芬太尼类似物的高通量分析方案。使用互补液相色谱法、捕获离子淌度质谱法和串联质谱法，可以在一次扫描中从单个样品中分离和分配数百种芬太尼类似物。所描述的方法利用了最近发展的数据依赖性采集和数据非依赖性采集，使用迁移阱中的平行积累，然后使用碰撞诱导解离进行顺序碎裂。芬太尼类似物的保留时间、淌度和 MS 碎裂模式可可靠分配。

引言

芬太尼及其类似物是美国致命和非致命过量服用的主要因素 ^1,2。疾病控制和预防中心 （CDC） 报告称，从 2013 年到 2021 年，与合成阿片类药物相关的过量死亡人数超过 258,000 人。仅在 2021 年，就有超过 68,000 人因合成阿片类药物过量死亡，占全国所有与过量相关的死亡人数的 82%³。自 2013 年以来，已鉴定出数百种芬太尼类似物，具有不同的效力⁴。随着非法制造的芬太尼类似物的出现，附表 II 合成阿片类药物本身仍然是美国最受欢迎的合成阿片类药物³。根据法医科学研究和教育中心 （CFSRE） 的数据，2022 年报告最多的芬太尼类似物是氟芬太尼，其他非芬太尼相关的合成阿片类药物现在正以快速的速度引入不稳定的药物市场供应⁵。

由于药物市场上流通的芬太尼和芬太尼相关类似物数量庞大，DEA 实施了一项名为"死亡龙行动"的芬太尼特征分析计划，以跟踪用于合成这些化合物的方法，希望将药物缉获追溯到其来源⁶。2018 年，94% 的药物缉获被确定为由 Janssen 方法合成，而其余 6% 是用 Siegfried 方法合成^{的 6}。两种方法之间的主要区别在于芬太尼类似物苄基芬太尼的存在，在 Janssen 方法中被检测为杂质，而去丙酰芬太尼 （4-ANPP）（芬太尼的代谢物/前体）的存在是用齐格弗里德方法合成时检测到的杂质⁷。

毒理学实验室定期使用气相色谱和液相色谱与质谱（分别为 GC-MS 和 LC-MS）对合成阿片类药物进行靶向筛查和定量。GC-MS 被认为是检测生物样本中滥用药物的金标准。获得公开的质谱库⁸ 和以即插即用系统⁹ 形式销售的仪器是 GC-MS 在实验室中成为全面筛查和靶向定量不可或缺的一部分 ^9,10 的一些原因。然而，文献中目前的 GC-MS 定量方法往往分析物范围有限¹¹，并且很快就会过时，不适用于当前的案件。更重要的是，其检测限和定量限无法与 LC-MS 方法相媲美 （< 1 ng/mL）¹²，因此增加了假阴性结果的可能性。GC-MS 和 LC-MS 之间的一项此类比较研究了尸检标本，指出在 134 例卡芬太尼（迄今为止最有效的合成阿片类药物之一）的阳性病例中，其中 104 例使用 GC-MS¹³ 筛查出卡芬太尼阴性。在药物分析实验室中，由于分析样品的浓度较高，GC-MS 更频繁地用于合成阿片类药物，并且可对其进行修改。然而，GC-MS 仍与傅里叶变换红外光谱 （FT-IR） 和扫描电子显微镜 （SEM） 等其他技术结合使用，以确认这些化合物¹⁴。在法医毒理学中，将 GC-MS 应用于生物标本分析，需要采用样品制备方法，包括使用液液萃取 （LLE） 或固相萃取 （SPE） 萃取这些化合物¹⁵。LLE 可以使用多种溶剂进行，但在高产量实验室中，LLE 可能不具有成本效益或不及时。LLE 消耗大量溶剂和样品量，而替代方案 SPE 可以自动化，并且需要最少样品量¹⁶。最近的一项 GC-MS 研究报告了使用三个独立的 GC 热程序分离 20 种不同的芬太尼异构体类似物¹⁷。虽然异构体之间的基线分离是成功的，但该方法对相关法医案件和工作流程的适用性有限。

LC-MS 在法医检测中越来越受欢迎，特别是由于 GC-MS 在处理非挥发性和热敏性化合物方面的局限性^18,19。使用三重四极杆 （QQQ） 和离子阱仪器的 LC-MS 筛查已成功检测低浓度 （<1 ng/mL） 的合成阿片类药物12,20,21,22,23,24。通常，这些 LC-MS 方法用作免疫测定和/或 GC-MS 结果的补充的二级确认方法。2017 年，迈阿密戴德县法医部门 （MDME） 毒理学实验室的 Shoff 等人开发了一种使用超高压液相色谱 （UHPLC）-离子阱-MS^{n 44 对 13} 种阿片类药物相关化合物进行综合筛选的方法。与靶向MRM方法类似，该离子阱方法采用预定的母离子列表（SPL），其中包含保留时间、母离子目标离子以及MS³谱图碎裂的初级子离子（尽可能）。这种筛选方法与在三重四极杆和线性四极杆离子阱上开发的方法的不同之处在于光谱数据中提供的额外细节。这种筛查方法无法提供定量分析（这在离子阱仪器上很少开发）以及未知物的鉴定¹³。合成阿片类药物的 LC-QQQ 方法可以同时筛选和定量预定义的目标列表。使用多反应监测 （MRM） 离子对化合物进行鉴定和定量是一种值得信赖的数据采集技术，也是文献中用于合成阿片类药物检测的最常见技术^12,20。据报道，一系列合成阿片类药物定量的线性范围为 0.01-100 ng/mL，更有效的合成阿片类药物，如卡芬太尼，在亚 ng/mL 范围内检测到¹ 1,24,25,26,27。

LC-MS 方法解决了合成阿片类药物的异构体分离问题。一种这样的方法使用联苯柱 28 在 16 min 运行时间内分离了¹⁷⁴ 个芬太尼异构体类似物。此外，色谱柱效、流动相 pH 值和压力变化等液相色谱相关参数的波动会产生保留时间漂移，在具有一致监测和更大收集窗口（>0.4 min）的靶向分析中必须考虑到这些保留时间漂移，这可能会导致这些一旦分离的异构体出现重叠。已经探索了用于分离异构体的其他色谱技术，包括使用 2 维液相色谱 （2D-LC）²⁹;虽然该技术确实能够提供化合物的正交分离，但与其他分离方法相比，其缺点包括运行时间过长、成本高、方法开发难度大和有用性³⁰。

高分辨率质谱 （HRMS） 在鉴定合成阿片类药物方面越来越可靠。几家仪器公司已经销售了为鉴定复杂生物基质中的广泛合成阿片类药物而开发的靶向方法 19,28,31。与前面讨论的方法不同，这些方法可以存储分析数据以进行追溯分析。因此，以前分析但结果不确定的标本可以在以后重新访问以发现新鉴定的化合物。HRMS 与 QQQ 的区别在于准确的质量数鉴定。虽然两种 MS 技术都可以在低浓度下准确定量，但 HRMS 已被证明对未知化合物的初始筛选和发现更有效 32,33,34。HRMS，特别是飞行时间 （TOF） MS 分析仪，一直处于 NPS 发现的最前沿，使法医检测实验室能够向执法部门和科学界提供新化合物的时间敏感数据，以扩大其中一些化合物的传播，同时提高认识和教育³³。TOF 在检测滥用药物中的应用已变得非常全面，在 10 min 色谱程序中分离出 600 多种化合物的方法。以前的研究报道了囚禁离子淌度质谱 （TIMS） 与 TOF 联用在检测和分离异构体阿片类药物方面的优势³⁵。

利用液相色谱、捕获离子淌度质谱和质谱之间的正交性，该方法基于保留时间、同位素模式、淌度和碎裂模式提供了芬太尼类似物的广泛表征。

研究方案

1. 样品制备

1. 收到芬太尼类似物筛选试剂盒后，将其储存在 -20 °C。加入 500 μL 纯 LC/MS 级甲醇，将每个样品重悬至终浓度为 400 μg/mL。
2. 使用平板混合器或涡旋器以 400 rpm 混合 1 小时或以中速涡旋 15 分钟。重悬后，将小瓶储存在 -20 °C。
3. 使用纯 LC/MS 级甲醇将每种标准品稀释至终浓度为 1 ng/mL。
4. 将标准品分组为多个组，以便每个组不包含任何异构体标准品。有关 14 组芬太尼标准的细分，请参见 补充表 1 。

2. HPLC 流动相制备

1. 使用 5 mM/L 甲酸铵 （NH₄HCO₂） 在 H₂O 中加入 0.05% 甲酸 （85%） 制备流动相 A （MPA）。
   1. 称取 0.078 g NH₄HCO₂，倒入 250 mL 容量瓶中，加水至约 2/3^rd。旋转以充分混合。
   2. 完全溶解后，加入 0.125 mL 甲酸 （85%）。加水至填充线 （250 mL） 并混合。
2. 使用 0.05% 甲酸在 1:1 甲醇乙腈混合物中制备流动相 B （MPB）。
   1. 将 125 mL 乙腈倒入容量瓶中，加入甲醇直至达到填充线。
   2. 旋转以充分混合。向培养瓶中加入 0.125 mL 的 0.05% 甲酸并混合以均质化。

3. HPLC 方法开发

1. 将 LC 软件打开到主屏幕。在位于窗口中央的 sample 表中，创建新协议。
   1. 用样品位置注释样品瓶柱。使用格式 YYYYMMDD_NAME （代表性描述符） 注释样品 ID 列。用所需的进样体积 （15 μL） 注释体积柱。
2. 使用数据将保存到的位置注释数据路径列。
3. HPLC 方法输入
   1. 从屏幕中间的样品表中的栏中选择 New 。在分差方法下，选择 下拉箭头 并单击 新建方法 在弹出窗口中。
   2. 将弹出一个标有 separation method 的新窗口，此处编辑采集时间或仪器控制框架 （ICF） 系统方法。
   3. 双击 ICF 系统的 Edit Method 按钮以打开弹出窗口以编辑二进制梯度，如图 1 所示。
   4. 在二进制梯度选项卡下，梯度的可视化表示在左侧，梯度的细分在右侧，设置时间戳、流速以及 MPA 和 MPB 浓度。
   5. 确保停止时间设置为 18 min，流速设置为 0.400 mL/min，并在 0 psi 和 6000 psi 处设置最小和最大压力限值。
   6. 按如下方式设置时间戳浓度:
      在 0.00 分钟时，将 B 浓度设置为 20.0。
      在 1.50 分钟时，将 B 浓度设置为 25.0。
      在 3.00 分钟时，将 B 浓度设置为 27.0。
      在 6.00 分钟时，将 B 浓度设置为 27.0。
      在 6.50 分钟时，将 B 浓度设置为 30.0。
      在 7.00 分钟时，将 B 浓度设置为 95.0。
      在 16.00 分钟时，将 B 浓度设置为 95.0。
      在 16.50 分钟时，将 B 浓度设置为 20.0。

4. HPLC 的初始化

1. 在 HPLC 色谱柱部分，插入 LC 色谱柱（整体式 C18 HPLC 色谱柱 100 mm x 4.6 mm）和色谱柱保护柱（保护柱 5 mm x 4.6 mm）。注意最小和最大柱压。
2. 运行空白样品（相同的缓冲液）以检测是否有任何泄漏并创建基线。寻找泄漏。可以通过柱压波动观察到泄漏。如果有泄漏，请确定泄漏的来源并拧紧连接。
3. 使用所需的 LC 程序运行样品空白样（相同的缓冲液），以对色谱柱进行预处理。

5. timsTOF MS/MS 方法开发

1. 打开 timsControl 应用程序。窗口左侧是 MS 和 TIMS 设置。
   1. 在 MS 设置下，将扫描开始和结束分别设置为 50 m/z 和 1800 m/z。为离子极性选择正模式，为扫描模式选择平行累积-连续碎裂。
   2. 在"TIMS 设置"下，将"模式"设置为自定义，1/K0 开始为 0.40 Vs/cm^2,1/K0 结束为 1.85 Vs/cm²，斜坡时间设置为 150.0 ms，MS 平均设置为 1。
2. 在 Source 下的选项卡下部选择中，在两个设置框中执行以下更改。
   1. 在离子源中，将端板偏移设置为 500 V，毛细管设置为 4500 V，雾化器设置为 3.0 bar，干燥气体设置为 10.0 L/min，干燥温度设置为 200 °C。
   2. 在注射泵设置中，确保注射器为 Hamilton 1 mL，启用主动，并将流速设置为 80.0 μL/h。
3. 在 Tune （调谐） 选项卡中，在 General （常规）、Processing （处理） 和 TIMS （TIMS） 的设置选项卡中执行以下更改。
   1. 在 general settings 选项卡下，设置以下部分:transfer、collision cell、quadrupole、focus pre TOF 和 detection。
      1. 在传输设置下，将偏转 1 delta 设置为 70.0 V，漏斗 1 RF 设置为 341.0 Vpp，CID 能量设置为 0.0 eV，漏斗 2 RF 设置为 300.0 Vpp，多极 RF 设置为 300.0 Vpp。
      2. 在碰撞单元设置下，确保碰撞能量设置为 6.0 eV，碰撞 RF 设置为 1200.0 Vpp。
      3. 在四极杆设置下，确保离子能量设置为 6.0 eV，将低质量设置为 250.00 m/z。
      4. 在聚焦预 TOF 设置下，将传输时间设置为 75.0 μs，预脉冲存储设置为 5.0 μs。
   2. 在 Processing settings（处理设置）选项卡下，设置以下部分:质谱峰检测和迁移谱峰检测。
      1. 在质谱峰设置中，取消选择强度总和（面积）并将绝对阈值设置为 667。
   3. 在 TIMS 选项卡下，设置以下部分:偏移、离子变化控制和高级参数。
      1. 在偏移设置下，将 Δt1 设置为 -20.0 V，将 Δt2 设置为 -100.0 V，将 Δt3 设置为 40.0 V，将 Δt4 设置为 80.0 V，将 Δt5 设置为 0.0 V，将 Δt6 设置为 120.0，并将碰撞池设置为 250.0 V。
      2. 在离子电荷控制设置下，单击框以启用并将目标强度设置为 5.00 M。
      3. 在高级参数下，启用 lock accumulation to mobility range。
4. 在 MS/MS 选项卡中，将扫描模式设置为平行累积 - 连续碎裂，并设置以下部分:母离子、调度、主动排斥、碰撞能量设置、隔离宽度设置和 TIMS 步进。
   1. 在母离子下，将平行累积-连续碎裂斜坡的数量设置为 8，最小电荷为 1，最大电荷为 5。
   2. 在 Scheduling settings （调度设置） 下，启用 precursor 重复。在 active exclusion 下，选中复选框以启用并将发布时间设置为 0.40 分钟后。
   3. 请勿调整碰撞能量设置和隔离宽度设置。单击 TIMS 步进框 以启用。

6. 迁移率和质量校准

1. 对 m/z 和迁移率域执行校准。在 m/z 校准设置下，在下拉菜单中显示的参考列表框中选择一个预加载的调谐混音配置文件。
2. 要校准，请在 TOF 注射器中加入调谐混合物溶液。在窗口右侧，使用标题为 calibration mode 的设置来设置各种校准类型，以获得最高分。
3. 确保分数尽可能接近 100%。在线性、二次方和增强二次之间切换以获得最佳分数。
4. 按照用于校准 m/z 的步骤 6.1-6.3 校准迁移率。
5. 校准后，通过选择顶部栏上的 Method （方法 ） 选项卡来保存 MS 方法。在下拉菜单中，选择 Save As （另存为 ） 以生成新的 MS 方法文件。

7. 创建数据非依赖型采集 （DIA） 并行累积-串行碎裂方法

1. 在数据依赖性采集 （dda） 平行累积-连续碎裂中收集到数据集后，在 dia 中运行实验。打开 Ion Mobility 软件应用程序并加载步骤 6.5 中保存的 dda 方法。
2. 保持 MS 设置的所有设置相同，将其从平行累积-连续碎裂更改为平行累积-连续碎裂。
3. 在面板底部，选择 MSMS 选项卡，然后单击 Window Editor 以打开 dia 窗口弹出窗口，如图 2 所示。
4. 使用弹出窗口顶部的 Open analysis 按钮加载以前保存的 dda 数据集（.m 文件）。
5. 热图显示在左下角，显示窗口，其中窗口多边形在图表中沿对角线延伸。单击并拖动以调整多边形的大小，使其适合热图中的数据（可以通过双击侧线来选择角，将出现一个可以拖动和调整大小的点）。
6. 窗口右侧是窗口设置。设置质量宽度（50 为转到）并设置水平重叠，两者均在 Da 中。
7. 设置每个质量宽度和垂直重叠的移动窗口数。
8. 单击弹出窗口右下角的 Calculate Windows （计算窗口 ） 以查看使用新设置显示的窗口。合适后，单击 Apply dia-PASEF Windows to Method。这将关闭弹出窗口，将其带回主屏幕。

8. HPLC 离子淌度 TOF 数据处理

1. 打开数据分析软件。在左上角，单击 文件 选项卡，然后选择 可选 从下拉列表中。在 New files （新建文件） 窗口中，选择所选文件，然后单击 Open （打开）。
2. 检查校准。右键单击分析框下的文件名，然后选择 Properties （属性）。将出现一个标记为 file name_analysis properties 的窗口。选择 Calibration Status （校准状态）。
3. 从下拉框中，为 质谱仪选择 Instrument Calibration（仪器校准）。确认误差不大于 1 μg/mL。选择 "初始淌度校正 "，确认误差不超过 1 μg/mL。
4. 如下所述在数据分析软件中准备色谱图。
   1. 右键单击文件名下的 Chromatogram（色谱图 ），选择 Edit Chromatogram（编辑色谱图）。在类型中，单击下拉框并选择 提取离子色谱图。
   2. 在过滤器下，选择 所有 MS ，在扫描模式下选择 全部。这是为了查看目标分子的峰，而不仅仅是其片段。
   3. 在此下方，查找用于分子选择的两个过滤器选项:masses 或 formula（分子式），以蓝色突出显示。
   4. 如果使用质量数提取离子，请插入目标分子的理论 m/z。对于这种情况，请选择 （质量数为代表结果） m/z。
   5. 如果使用公式提取离子，请插入分子的公式以及色谱图中感兴趣的离子形式。在这种情况下，选择 质子化离子 [M+H]⁺。
   6. 将极性设置为正模式。
5. 质谱
   1. 右键单击化合物峰的基线，然后拖动到峰的另一条边缘。这将在该保留时间内产生片段的质谱图。
6. Mobilogram 的生成
   1. 右键单击标题为 mobilogram 的左侧选项卡，然后选择 Edit Mobilogram。将出现一个名为 edit mobilogram traces 的窗口。按照步骤 8.4.2-8.4.7 编辑色谱图。
   2. 在 retention time input（保留时间输入）中，添加目标峰的保留时间范围。
   3. 选择参数后，单击 Add （ 添加 ），然后单击 Ok （确定 ） 在 edit mobilogram traces （编辑动图轨迹） 窗口的右上角。
   4. 片刻之后，软件将处理所需的选择并输出色谱图。对混合物中的所有离子重复步骤 8.6.1-8.6.3。
   5. 生成化合物谱图
      1. 在谱图视图窗口的底部，选择 Profile MS （分析 MS ） 和 Fragment MS（片段 MS）。这将允许包括来自全扫描和 PASEF 的离子。
      2. 在谱图视图中，右键单击并选择 Copy Compound Spectra（复制化合物谱图）。使用右侧显示的谱图数据，查找有关化合物的更多信息，例如分辨率、分辨能力、强度和信噪比 （S/N）。
   6. 数据处理
      1. 要处理数据，请手动积分色谱图和淌度峰，以产生有关目标分子的重要信息。
      2. 右键单击 "查找 "，然后选择 "仅整合 色谱图或动能图"。左键单击并拖动以突出显示所需的峰值。将显示信息，包括保留时间、面积、S/N 和移动性。

结果

将 250 种类似物标准品的芬太尼类似物筛选试剂盒分为 14 组:12 组 17 种类似物和 2 组 16 种类似物，以避免 m/z 干扰。每种类似物的 m/z、保留时间 （RT）、淌度 （K） 和 MS/MS 碎裂模式进一步表征。

图 3 和图 4 分别显示了 C₂₂H₂₈N₂O₂ 和 C₂₁H₂₈N₂

讨论

对含有高异构体含量的生物样品进行分析分离可能具有挑战性。在本文中，所描述的方法旨在表征 29 种异构体组，来自 250 种阿片类药物标准试剂盒的总共 185 种类似物。在测试组准备过程中，重要的是要确保没有两个无法通过实验区分的 m/z 类似物。此处描述的数据使用的标准品不是来自基于人类的基质，如果要在现场实验中使用这种方法;为确保方法的适用性，有必要?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium formate for HPLC	Fluka	17843-50G
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock Tubes	Fisher	05-402-25
ESI-L Low Concentration Tuning mix	Agilent	G1969-85000
Fentanyl Analog Screening (FAS) Kit	Cayman Chemical	9003237, 9003286, 9003380, 9003381	kit of 250 snthetic opioids, 210 fentanyl analogs, broken up into one kit and emergent panel versions 1-4
Formic acid Optima LC/MS	Fisher	A117-50
Onyx guard column (5 x 4.6 mm)	Phenomenex	CHO-7649	guard column for C18 columns
Onyx monolithic C18 HPLC column (100 x 4.6 mm)	Phenomenex	CHO-7643	reverse phase C18 LC column
Optima grade acetonitrile	Fisher	A996-4
Optima grade methanol	Fisher	A454-4
Optima grade water	Fisher	W7-4
Pipette	Fisher	05-719-510	kit of 1-10 µL, 10-100 µL, and 100-1000 µL pipette
Pipette tips 10µL	Fisher	94060100
Pipette tips 1000µL	Fisher	94056710
Pipette tips 200µL	Fisher	94060310
Plate mixer	IKA	MS 3 D S1	IKA MS 3 digtital
Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph	Shimadzu, Japan		equiped with DGU-20A5, LC-20AD, SIL-20AC, CTO-20A, SPD-M20A, CBM-20A, SPD-20A
timsTOF Pro	Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA		timsTOF instrument with PASEF