Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.
Méthode de criblage d’analogues du fentanyl en fonction de leur temps de rétention, de leur mobilité et de leur profil de fragmentation par spectrométrie de masse.
L’utilisation du fentanyl et l’émergence d’analogues du fentanyl au cours des dernières décennies sont devenues une préoccupation croissante pour la communauté dans son ensemble. Le fentanyl et ses analogues sont les principaux facteurs contribuant aux surdoses mortelles et non mortelles aux États-Unis. Les cas les plus récents de surdose liée au fentanyl sont liés au fentanyl fabriqué illégalement et à sa puissance extrême. Dans le présent travail, nous décrivons un protocole analytique à haut débit pour le dépistage des analogues du fentanyl. L’utilisation de la chromatographie liquide complémentaire, de la spectrométrie de mobilité des ions piégés et de la spectrométrie de masse en tandem permet de séparer et d’attribuer des centaines d’analogues du fentanyl à partir d’un seul échantillon en un seul balayage. L’approche décrite tire parti du développement récent de l’acquisition dépendante des données et de l’acquisition indépendante des données utilisant l’accumulation parallèle dans le piège de la mobilité, suivie d’une fragmentation séquentielle utilisant la dissociation induite par la collision. Les analogues du fentanyl sont attribués avec certitude en fonction de leur temps de rétention, de leur mobilité et de leur profil de fragmentation de la MS.
Le fentanyl et ses analogues sont les principaux facteurs de surdoses mortelles et non mortelles aux États-Unis 1,2. Le Center for Disease Control and Prevention (CDC) a indiqué que le nombre de décès par surdose liés aux opioïdes synthétiques de 2013 à 2021 était supérieur à 258 000. Rien qu’en 2021, plus de 68 000 décès par surdose ont pu être attribués aux opioïdes synthétiques, soit 82 % de tous les décès par surdose dans le pays3. Depuis 2013, des centaines d’analogues du fentanyl ont été identifiés, avec une puissance variable4. Avec l’émergence d’analogues du fentanyl fabriqués illégalement, l’opioïde synthétique de l’annexe II lui-même reste l’opioïde synthétique le plus populaire disponible aux États-Unis3. Selon le Center for Forensic Science Research and Education (CFSRE), le fluorofentanyl était le fluorofentanyl, et d’autres opioïdes synthétiques non liés au fentanyl sont désormais introduits à un rythme rapide sur le marché volatile des drogues5.
En raison du volume écrasant de fentanyl et d’analogues apparentés au fentanyl circulant sur le marché de la drogue, la DEA a mis en œuvre un programme de profilage de la signature du fentanyl intitulé Operation Death Dragon, afin de suivre la méthodologie utilisée pour synthétiser ces composés dans l’espoir de relier les saisies de drogue à leur origine6. En 2018, 94 % des saisies de drogue ont été identifiées comme étant synthétisées par la méthode Janssen, tandis que les 6 % restants ont été synthétisés par la méthode Siegfried6. La principale différence entre les deux méthodes est la présence de l’analogue du fentanyl, le benzyl fentanyl, détecté comme une impureté dans la méthode Janssen, tandis que la présence de despropionyl fentanyl (4-ANPP), un métabolite/précurseur du fentanyl, est une impureté détectée lors de la synthèse avec la méthode Siegfried7.
L’utilisation de la chromatographie en phase gazeuse et liquide en tandem avec la spectrométrie de masse (GC-MS et LC-MS, respectivement) pour le dépistage et la quantification ciblés des opioïdes synthétiques est régulièrement mise en œuvre dans les laboratoires de toxicologie. La GC-MS a été considérée comme l’étalon-or pour la détection des drogues d’abus dans les échantillons biologiques. L’accès à des bibliothèques spectrales de masse accessibles aupublic8 et à des instruments commercialisés sous forme de systèmes prêts à l’emploi9 sont quelques-unes des raisons pour lesquelles la GC-MS est restée une partie intégrante des laboratoires, tant pour le dépistage complet que pour la quantification ciblée 9,10. Cependant, les méthodes actuelles de quantification de la GC-MS dans la littérature ont tendance à avoir une portée limitée des analytes11 et deviennent rapidement obsolètes et non applicables aux cas actuels. Plus important encore, les limites de détection et de quantification ne sont pas comparables à celles des méthodes LC-MS (< 1 ng/mL)12, ce qui augmente le risque de résultats faussement négatifs. L’une de ces comparaisons entre la GC-MS et la LC-MS, qui a porté sur des échantillons post-mortem, a révélé que sur 134 cas de carfentanil identifiés positivement, l’un des opioïdes synthétiques les plus puissants à ce jour, 104 de ces cas ont été testés négatifs pour le carfentanil à l’aide de la GC-MS13. Dans les laboratoires d’analyse de drogues, la GC-MS est plus fréquemment utilisée et modifiable pour les opioïdes synthétiques en raison de la forte concentration des échantillons analysés. Pourtant, la GC-MS est toujours utilisée en conjonction avec des techniques supplémentaires telles que la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FT-IR) et la microscopie électronique à balayage (MEB) pour la confirmation de ces composés14. L’application de la GC-MS à l’analyse d’échantillons biologiques en toxicologie médico-légale nécessite des méthodes de préparation d’échantillons qui incluent l’extraction de ces composés par extraction liquide-liquide (LLE) ou extraction en phase solide (SPE)15. La LLE peut être réalisée avec une variété de solvants, mais dans un laboratoire à haute production, la LLE peut ne pas être rentable ou rapide. La LLE consomme de grandes quantités de solvants ainsi que le volume d’échantillons, tandis que l’alternative, SPE, peut être automatisée et nécessite un volume d’échantillon minimumde 16. Une étude récente de GC-MS a révélé la séparation de 20 analogues isomères différents du fentanyl à l’aide de trois programmes thermiques GCdistincts17. Bien que la séparation de référence entre les isomères ait été couronnée de succès, l’applicabilité de cette méthode aux dossiers et aux flux de travail médico-légaux pertinents est limitée.
La LC-MS a gagné en popularité dans les tests médico-légaux, notamment en raison des limites de la GC-MS lorsqu’il s’agit de composés non volatils et sensibles à la chaleur18,19. Le dépistage par LC-MS à l’aide de triples quadripôles (QQQ) et d’instruments de piège à ions a permis de détecter les opioïdes synthétiques à de faibles concentrations (<1 ng/mL)12,20,21,22,23,24. En règle générale, ces méthodes LC-MS sont utilisées comme méthodes de confirmation secondaire pour compléter les résultats de l’immunodosage et/ou de la GC-MS. En 2017, Shoff et al. du laboratoire de toxicologie du département du médecin légiste du comté de Miami-Dade (MDME) ont développé une méthode de dépistage complète pour 44 composés liés aux opioïdes à l’aide de la chromatographie liquide à ultra haute pression (UHPLC)-piège à ions MSn 13. Semblable aux méthodes MRM ciblées, cette méthode de piège à ions utilisait une liste de précurseurs programmés (SPL) contenant les temps de rétention, les ions cibles précurseurs, ainsi que les ions filles primaires pour la fragmentation spectrale de MS3 lorsque cela était possible. Ce qui distingue cette méthode de criblage des méthodes développées sur les triples quadripôles et les pièges à ions quadripolaires linéaires, c’est le détail supplémentaire fourni dans les données spectrales. Ce que cette méthode de criblage ne peut pas fournir, c’est l’analyse quantitative, qui est rarement développée sur l’instrumentation des pièges à ions, ainsi que l’identification d’inconnues13. Les méthodes LC-QQQ pour les opioïdes synthétiques permettent de dépister et de quantifier simultanément une liste de cibles prédéfinies. L’utilisation de transitions de surveillance des réactions multiples (MRM) pour l’identification et la quantification des composés est une technique d’acquisition de données fiable et la technique la plus couramment utilisée dans la littérature pour la détection des opioïdes synthétiques12,20. Les plages linéaires rapportées pour la quantification d’un éventail d’opioïdes synthétiques vont de 0,01 à 100 ng/mL, tandis que les opioïdes synthétiques plus puissants, tels que le carfentanil, sont détectés dans la plage inférieure à ng/mL1, 1, 24, 25, 26, 27.
La séparation des opioïdes synthétiques isomères a été abordée dans les méthodes LC-MS. L’une de ces méthodes a permis de séparer 174 analogues isomères du fentanyl en 16 minutes à l’aide d’une colonne de biphényle28. De plus, les fluctuations des paramètres dépendants de la LC, tels que l’efficacité de la colonne, le pH de la phase mobile et les changements de pression, créent des décalages du temps de rétention qui doivent être pris en compte dans des essais ciblés avec une surveillance cohérente et des fenêtres de collecte plus grandes (>0,4 min), ce qui peut entraîner un chevauchement potentiel de ces isomères une fois résolus. D’autres techniques chromatographiques pour la séparation des isomères ont été explorées, notamment l’utilisation de la chromatographie liquide bidimensionnelle (2D-LC)29 ; Et bien que cette technique ait la capacité de fournir une séparation orthogonale des composés, les inconvénients l’emportent sur les avantages, notamment les temps d’exécution excessifs, le coût, la difficulté de développement de la méthode et l’utilité par rapport aux séparations alternatives30.
La spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS) devient de plus en plus fiable pour l’identification des opioïdes synthétiques. Plusieurs sociétés d’instrumentation ont commercialisé des méthodes ciblées développées dans le but d’identifier une large gamme d’opioïdes synthétiques dans des matrices biologiques complexes 19,28,31. Ces méthodes, contrairement aux méthodes décrites précédemment, peuvent stocker des données analytiques pour une analyse rétroactive. Ainsi, les spécimens qui ont déjà été analysés avec des résultats indéterminés peuvent être revisités plus tard pour la découverte de composés nouvellement identifiés. Ce qui distingue le HRMS du QQQ, c’est l’identification précise des masses. Bien que les deux techniques de MS puissent quantifier avec précision à de faibles concentrations, la HRMS s’est avérée plus efficace pour le dépistage initial et la découverte de composés inconnus 32,33,34. La HRMS, en particulier les analyseurs de MS à temps de vol (TOF), a été à l’avant-garde de la découverte des NPS, permettant aux laboratoires d’analyses médico-légales de fournir des données urgentes sur de nouveaux composés aux forces de l’ordre et à la communauté scientifique afin d’étendre la propagation de certains de ces composés tout en augmentant la sensibilisation et l’éducation33. L’utilisation du TOF pour la détection des stupéfiants est devenue extrêmement répandue, avec des méthodes contenant plus de 600 composés séparés dans un programme chromatographique de 10 minutes. Des études antérieures ont rapporté les avantages de la spectroscopie de mobilité des ions piégés (TIMS) couplée à la TOF pour la détection et la séparation des opioïdes isomères35.
Tirant parti de l’orthogonalité entre la chromatographie liquide, la spectrométrie de mobilité des ions piégés et la spectrométrie de masse, la méthode présentée fournit une large caractérisation des analogues du fentanyl en fonction du temps de rétention, du profil isotopique, de la mobilité et du modèle de fragmentation.
1. Préparation de l’échantillon
2. Préparation des phases mobiles HPLC
3. Développement de méthodes HPLC
4. Initialisation de la HPLC
5. Développement de la méthode timsTOF MS/MS
6. Étalonnage de la mobilité et de la masse
7. Création d’une méthode d’acquisition indépendante des données (dia) d’accumulation parallèle et de fragmentation en série
8. Mobilité ionique HPLC Traitement des données TOF
Le kit de dépistage analogique du fentanyl composé de 250 étalons analogues a été divisé en 14 groupes : 12 groupes de 17 analogues et 2 groupes de 16 analogues, afin d’éviter les interférences m/z. Chaque analogue est en outre caractérisé par son m/z, son temps de rétention (RT), sa mobilité (K) et son modèle de fragmentation MS/MS.
Des exemples de séparations isomériques sont illustrés à la figure 3 et à la
La séparation analytique d’échantillons biologiques contenant une teneur isomérique élevée peut être difficile sur le plan analytique. Dans cet article, la méthode décrite vise à caractériser 29 ensembles d’isomères, pour un total de 185 analogues à partir d’un kit standard de 250 opioïdes. Lors de la préparation du groupe d’essai, il est important de s’assurer qu’il n’y a pas deux analogues avec m/z qui ne peuvent pas être distingués expérimentalement. Les...
Matthew Willetts et Melvin A. Park sont des employés de Bruker Daltonics Inc., le fabricant de l’instrument commercial timsTOF Pro2. Tous les autres auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
L’auteur tient à souligner le soutien initial du Dr Cesar Ramirez lors du développement initial de la méthode.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ammonium formate for HPLC | Fluka | 17843-50G | |
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock Tubes | Fisher | 05-402-25 | |
ESI-L Low Concentration Tuning mix | Agilent | G1969-85000 | |
Fentanyl Analog Screening (FAS) Kit | Cayman Chemical | 9003237, 9003286, 9003380, 9003381 | kit of 250 snthetic opioids, 210 fentanyl analogs, broken up into one kit and emergent panel versions 1-4 |
Formic acid Optima LC/MS | Fisher | A117-50 | |
Onyx guard column (5 x 4.6 mm) | Phenomenex | CHO-7649 | guard column for C18 columns |
Onyx monolithic C18 HPLC column (100 x 4.6 mm) | Phenomenex | CHO-7643 | reverse phase C18 LC column |
Optima grade acetonitrile | Fisher | A996-4 | |
Optima grade methanol | Fisher | A454-4 | |
Optima grade water | Fisher | W7-4 | |
Pipette | Fisher | 05-719-510 | kit of 1-10 µL, 10-100 µL, and 100-1000 µL pipette |
Pipette tips 10µL | Fisher | 94060100 | |
Pipette tips 1000µL | Fisher | 94056710 | |
Pipette tips 200µL | Fisher | 94060310 | |
Plate mixer | IKA | MS 3 D S1 | IKA MS 3 digtital |
Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph | Shimadzu, Japan | equiped with DGU-20A5, LC-20AD, SIL-20AC, CTO-20A, SPD-M20A, CBM-20A, SPD-20A | |
timsTOF Pro | Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA | timsTOF instrument with PASEF |
Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE
Demande d’autorisationThis article has been published
Video Coming Soon