阿尔茨海默病埋线针灸治疗的手术程序及注意事项

摘要

本研究提出了一种对阿尔茨海默病样大鼠进行线嵌入针灸治疗的方案。

摘要

埋线疗法 （TEAT） 是一种通过将可生物降解的缝合线插入穴位来预防和管理疾病的治疗方法，提供持久的刺激。TEAT 是一种简单的方法，可以避免常规针灸的不适并提供持续的治疗效果。本文讨论了 TEAT 对具有阿尔茨海默病样症状的大鼠学习和记忆能力的潜在影响。由于化学诱导的大鼠神经元变性和认知障碍并不完全反映在阿尔茨海默病中观察到的真实病理变化。因此，我们的研究小组将这些表现指定为阿尔茨海默病样症状。已经制定了一份协议来概述穴位的选择、手术过程以及头部和下背部的必要预防措施。实验分为 3 组：对照组、模型组和 TEAT 组，每组 6 只大鼠。为了诱发阿尔茨海默病样症状，大鼠腹膜内注射 D-半乳糖 7 周 （49 天）。TEAT 组大鼠接受穴位肠埋伏治疗。干预期结束后，进行了莫里斯水迷宫 （MWM） 以评估大鼠的学习和记忆能力。随后，处死大鼠，检查它们的脑组织。进行组织学检查以了解 TEAT 对表现出阿尔茨海默病症状的大鼠病理的影响。这项研究表明，TEAT 可能会改善具有阿尔茨海默病样症状的大鼠的学习和记忆，这表明这种神经退行性疾病可能是一种有前途的新治疗方法。

引言

埋线针灸 （TEA） 涉及使用特殊针头将肠线或可吸收缝合线嵌入穴位。这种技术具有持久的效果，直到缝合线被吸收和降解。它为穴位提供持续和持续的刺激一周或更长时间¹，无需每天重复手术即可达到可比的结果²。这减少了就医的患者数量，从而在一定程度上节省了医疗资源。近年来，TEAT 在中国的各个医学领域得到了越来越多的应用，包括内科、外科、皮肤病学、五官、妇科和儿科³。研究表明，它对某些慢性和复杂疾病，如癫痫⁴ （epilepsy）和面神经麻痹⁵（facial nerve paralysis））产生长期可靠的效果是有效的。具有创伤小、操作简单⁶.此外，据报道，TEAT 的治疗费用低于电针 （EA）⁷。因此，TEAT 在临床和科学研究中越来越受到重视。

阿尔茨海默病 （AD） 是一种随着时间的推移而进展的神经退行性疾病。它的病理生理过程在临床症状出现前大约 20 年开始积累，但其机制仍未完全清楚⁸。鉴于治疗 AD 的有效药物有限，研究越来越关注该疾病的前驱期和临床前阶段⁹。预防是解决 AD 发展和进展的关键策略 ^9,10。近年来，中医 （TCM） 取得了重大进展，有望为预防和治疗 AD 提供新的可能性^11,12。作为针灸的一种亚型，TEAT 因其治疗范围广、创伤小、手术简单、治疗频率低和疗效持久而优于其他疗法⁶。新出现的文献表明，TEAT 可能对肥胖^13,14、糖尿病¹⁵、失眠¹⁶、绝经后骨质疏松症¹⁷ 和抑郁症¹⁸ 的个体有益，所有这些都是 AD 的危险因素。它还通过调节线粒体自噬² 改善衰老大鼠的衰老，改善空间学习和记忆障碍，减轻海马体的病理损伤，并抑制血管性痴呆 （VD） 大鼠的炎症反应¹⁹。弄清楚 TEAT 是否也可以作用于 AD 期间的病理过程似乎很有吸引力。

目前的研究在 TEAT 操作的几个关键要素上缺乏统一性和标准化，包括嵌入方法、嵌入工具、线程和嵌入间隔周期。这种缺乏标准化影响了对治疗效果的评价和相关机制的探索，并限制了外部推广和交流。先前的研究 ^20,21 已经证明，腹膜内注射 D-半乳糖 （D-gal） 可诱导大鼠出现阿尔茨海默病样病理变化，包括神经元变性和认知障碍。此外，百会 （GV20） 和神枢 （BL23） 的电针已被证明可有效改善认知能力下降、减轻神经炎症和减少神经元损伤。本研究以阿尔茨海默病样模型大鼠为例，介绍了该模型下 TEAT 的穴位选择及操作过程和注意事项。它讨论了 TEAT 在实验研究中的关键操作要素，为未来的研究提供参考。

研究方案

所有实验均按照《美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南》进行，并经湖北省疾病预防控制中心实验动物管理和使用委员会批准。共 18 只 3 月龄雌性 Sprague-Dawley （SD） 大鼠，体重 220-250 g。所有大鼠均在 23 ± 1 °C 和 40%-50% 湿度下维持 12 小时的光照/黑暗循环，可自由获取食物和水。在为期一周的适应期之后，在此期间让大鼠适应实验室条件，开始实验。

1. 模型开发

1. 实验设计如图 1 所示。将 18 只体重 220-250 g 的 Sprague-Dawley 3 个月大雌性大鼠随机分为对照组、模型组和 TEAT 组。每组由 6 只大鼠组成。
2. 模型组和 TEAT 组每天注射 D-半乳糖 （D-gal;120 mg/kg/天），而对照组接受生理盐水注射（120 mg/kg/天），持续 7 周（49 天）在下腹区²²。注射应在每天上午 8：00 至 9：00 之间进行。
3. 在每周的第 7 天上午 9：00 至 10：00 之间对大鼠进行称重。实验持续了 49 天。每 14 天在 14^日、28^日和 42 日埋线。将每个线程嵌入的时间固定在上午 9：00-12：00 之间。
4. 继续腹膜内给予 D-半乳糖 7 周，以诱导大鼠阿尔茨海默病相关的病理表现²²。

2. 准备 TEAT

1. 对眼科剪刀、托盘和镊子等手术器械进行消毒和消毒。彻底清洁手术室环境中的表面并消毒。
2. 通过将小动物加热垫平放在表面上，然后用无菌毛巾悬垂来准备手术平台。随后，将清洁和消毒的操作板平稳地放在顶部，粗糙的一面朝上。然后，打开加热垫并将温度设置为 32 °C。
3. 对于该程序，选择直径为 6 毫米的 0.6 号一次性埋线针和长度为 5 厘米的 0-2 可吸收手术缝合线（胶原蛋白缝合线）。使用眼科剪刀将 2 厘米 5-0 可吸收手术缝合线剪成 0.5 厘米和 0.2 厘米的小块。将剪断的线浸泡在 0.9% 的盐水中，放在一边。
4. 用肥皂和水洗手 20 秒，然后擦干。之后，戴无菌手套。
5. 在下腹区注射水合氯醛 （300 mg/kg） 对大鼠进行麻醉，确保在动物在手术平面上无反应时确认麻醉，基于脚趾捏试验缺乏反应，并保持稳定的生理状态。此外，为了防止大鼠在麻醉期间角膜干燥和潜在损伤，请在眼睛上涂抹大量兽用软膏，确保它们在整个手术过程中保持润滑。
   注意：建议对大鼠进行麻醉，因为穿刺会让它们感到痛苦。

3. 百惠的线程嵌入操作 （GV 20）

1. 将大鼠的穴位百会 （GV 20） 定位在顶骨的右中点（图 2A）。将大鼠放置在完全暴露头部的位置，将耳朵向前拉，以接近人类用于连接耳尖线的方法。通过触诊颅骨的中央纵脊并大致在其中点精确定位位置，确定百会 （GV 20） 点。在平放时耳朵与头部接触的水平进一步确认这个穴位，与矢状缝和顶骨的交点对齐。使用记号笔标记百汇 （GV 20）。
2. 使用修剪器（通常是电动男士胡须修剪器）剃掉大鼠穴周围的头部区域。
3. 手术前，以圆周运动涂抹 0.5% 碘溶液，从中心开始，向外移动，对穴位和周围皮肤进行消毒。随后，执行三重消毒过程：使用 iodophor 3 次，每次使用酒精以确保适当净化并为无菌技术准备现场。
4. 用镊子夹出浸泡在盐水中的 0.2 厘米可吸收手术缝合线，并将其放在针管的前端。然后，将其连接到针芯。
5. 一只手用拇指和食指捏住百惠 （GV 20） 周围的区域，另一只手握住针头。
6. 将针头以 15° 角水平快速插入皮肤表面，在百会 （GV 20） 点下方 0.1 厘米处，同时捏住皮肤（图 3A）。
7. 当针尖达到百惠 （GV 20） 点上方 0.1 厘米后，在缩回针管的同时推动针芯，将 0.2 厘米的可吸收手术缝合线完全植入穴位的皮下组织（图 3B）。
8. 慢慢取下针头，确保没有缝合线暴露。用无菌干棉按压针孔 10 秒以防止出血。如果线嵌入穴位后线在体外，请将其拔出并重新手术。

4. 神书的线程嵌入操作 （BL 23）

1. 大鼠的穴神书 （BL 23） 位于^第 2 腰椎外侧 5 毫米处（图 2B）。首先，根据大鼠的臀部结节定位^第 6 腰椎。然后通过向上数四个椎体来定位^第 2 个腰椎。神树 （BL 23） 将位于其²³ 的外侧 5 毫米处。
   注：百会 （GV 20） 和神数 （BL 23） 穴位的组合是中医 （TCM） 理论中经常使用的一套，用于预防和治疗脑部疾病。正如之前的研究^20,21 所证实的那样^，这种穴位配对已经因其功效而被确立。
2. 用记号笔标记《神书》（BL 23）。使用修剪器（通常是电动胡须修剪器）剃掉大鼠穴周围的背部和腰部区域。
3. 手术前，从中心开始向外移动，以圆周运动涂抹 0.5% 碘溶液，对穴位和周围皮肤进行消毒。随后，执行三重消毒过程：使用 iodophor 3 次，每次使用酒精，以确保适当的去污并为无菌技术准备场地。
4. 用镊子夹出浸泡在生理盐水中的 0.5 cm 可吸收手术缝合线，并将其放在针管的前端。然后，将其连接到针芯。
5. 用按压手的食指和中指或拇指和食指拉伸皮肤。用穿刺的手握住针头。
6. 快速将针头垂直插入神书 （BL 23） 下方 0.25 厘米的针尖。参见 图 4A。
7. 针尖达到皮下 0.5 cm 后，调整针尖，使插入方向向心，与皮肤表面形成 45° 角，倾斜插入 0.5 cm（图 4B）。
   注意： 针刺位于肾脏附近的神书 （BL 23） 时要小心。针头的深度插入或反复提起和刺入可能会造成损坏。因此，我们建议插入深度约为 0.3-0.6 cm。
8. 在缩回管子的同时推动针芯，将 0.5 厘米的可吸收手术缝合线完全植入穴位的肌肉组织中（图 4C）。
9. 慢慢拉出针头，确保没有缝合线暴露。然后，用无菌干棉按压针孔 10 秒以防止出血。如果线嵌入穴位后线在体外，请将其拔出并重新手术。

5. 术后护理

1. 术后，将大鼠放在温度为 32°C 的小动物加热垫上，以促进麻醉恢复。在将其放回笼子之前，请确保动物完全清醒且状况令人满意。
2. 手术后，在一周内观察到受影响区域无菌炎症反应的迹象。这些迹象可能包括发红、肿胀或脓样分泌物。通常，这些症状不需要任何治疗。但是，如果渗出液过多，请对患处进行排空和消毒。在这种情况下，涂抹红霉素软膏，直到伤口完全恢复。

6. 行为测试和组织学检查

1. 干预后，在第 8 周，进行莫里斯水迷宫 （MWM） 实验 ^2,24 以评估他们的学习和记忆能力。在 5 天内执行学习试用，每天 4 次试用。然后在最后一个采集日起 24 小时后进行探针试验。
2. 使用统计分析软件进行统计比较。通过单因素方差分析 （ANOVA） 和事后 Tukey 检验分析学习能力的行为数据。通过双向重复测量方差分析 （ANOVA） 然后进行事后 Bonferroni 检验来评估逃逸潜伏期数据的重要性。在所有测试中，p <0.05 的值都被视为显著。
3. 行为评估后，如上所述麻醉大鼠，并通过腹膜内注射 150 mg/kg 体重的戊巴比妥钠实施安乐死。
4. 通过使用通过血管系统灌注的 4% 多聚甲醛灌注来固定大鼠的大脑²⁵。
   1. 管饲针的插入和固定
      1. 准备一根 12G 针头，确保其笔直且适合穿过大鼠的心室。找到大鼠的心室，通常是左心室，然后将针头穿过它插入升主动脉。此步骤需要精确和对大鼠解剖结构的良好理解。
      2. 针头就位后，使用止血钳将管饲针夹在进入主动脉的点附近。这将有助于固定针头并防止其移动。
      3. 确保夹子足够紧以牢固地固定针头，但不要太紧以至于损坏主动脉或阻碍血液流动。在整个手术过程中，管饲针应保持在升主动脉中，以保持适当的灌注。
   2. 生理盐水灌注
      1. 准备一个不带针头的 50cc 注射器进行灌注。将管饲针的另一端（位于大鼠体外）连接到装满生理盐水的注射器上。
      2. 做一个小切口，切开右心耳，让血液流出心脏。此步骤可确保血液在灌注过程中被盐水置换。
      3. 开始以稳定和恒定的速度将生理盐水注射到升主动脉中。这将冲洗血液并准备固定组织。
      4. 监测从右心耳流出的液体，并准备好根据需要更换注射器，以维持新鲜盐水的持续灌注。
         放置，准备用固定剂灌注。
      5. 将含有生理盐水的注射器更换为含有 4% 多聚甲醛的注射器，多聚甲醛是组织学中常用的固定剂。使用多聚甲醛进行灌注，将组织固定在适当的位置，以便进行后续处理和分析。
         注意：在整个过程中，保持无菌技术以防止感染并轻柔处理大鼠以尽量减少伤害至关重要。此外，所有相关人员都应接受该技术方面的培训，以确保一致性和有效性。
5. 取出大鼠大脑，将其置于含有4%多聚甲醛的标本瓶中，在4°C下^25,26小时^24-48小时。逐步进行乙醇脱水和二甲苯处理，然后进行常规连续冠状切片 （4-5 μm） 进行测量。使用苏木精和伊红 （H&E） 染色 （200x） 评估每组中海马神经元的形态和丢失。
   注意：由于在整个实验期间没有指示胃肠道 （GI） 紊乱的临床体征，因此未对啮齿动物进行评估胃肠道 （GI） 病变的尸检。这些动物没有表现出明显的不良反应，这表明存在此类病理。

结果

本文介绍了 TEAT 在阿尔茨海默病样大鼠中的具体操作方法。它讨论了 TEAT 在实验研究中的关键操作要素，为未来的研究提供参考。

TEAT 改善阿尔茨海默病样大鼠的学习
如流程图（图 5）所示，在适应性训练期间，观察到每组中的大鼠在游泳时观察周围环境。游泳速度分析（图 6）显示各组之间没有显着差异，表明运?...

讨论

干预时间
AD 的病因很复杂，其发病机制仍不确定。目前，该病尚无有效的治疗方法，其病程不可逆。因此，学术界已就关注 AD 预防和治疗的重要性达成共识。AD 的预防和治疗策略强调早期干预，遵循中医的理念，即在疾病发生之前进行治疗，强调在疾病发作、传播和复发之前进行治疗。对人类^29,30 和啮齿动物^31,32

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline, 4% paraformaldehyde, Hematoxylin, Eosin Y (water-soluble), absolute ethanol, 0.01M PBS powder, xylene, hydrochloric acid, embedded paraffin, neutral gum	sinopharm (www.sinopharm.com)
5-0 absorbable surgical suture	bodamedical (www.bodamedical.com)
70% alcohol, iodophor, cotton ball			Used for disinfection.
chloral hydrate	sigma	C8383
coverslips, glass slides	Guangzhou Wuqiang Experimental Equipment Co., Ltd
Dehydrator	Wuhan Junjie JT-12J Computerized Biological Tissue Dehydrator
DELUXE THERMOSTAT HEAT MAT	Zhenhua Instruments		For maintaining the body temperature of rats.
D-galactose	sigma	G0750
electric men's beard trimmer			Used for shaving rats.
Electronic scale for small animals (ZK-DST)	Henan Zhike Information Technology Co., Ltd
erythromycin ointment	frontpharm
glass dish			Used to place cut absorbable sutures.
High-Pressure Steam Sterilization Pot (YM100Z)	Shanghai Sanshen medical equipment factory		For sterilization of surgical instruments.
Ice Maker (CMB40)	Shanghai Sheyan Instrument Co., Ltd.
Microscope (BX-53)	OLYMPUS
milk powder			Used for the MWM test.
Morris Water Maze Video Tracking System & Data Analysis Software (Version: Watermaze 2.0)	Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd
No.6 thread-embedding needle	bodamedical (www.bodamedical.com)
ophthalmic scissors, trays, tweezers
Pathology Microtome  (RM 2016)	LEICA, Germany
pentobarbital	Germany	P11011
permanent marker			Used to mark the acupoint.
Slicing knives (R35)	Feathers, Japanese
soap			Used to wash hands.
sterile gloves