Procedimento de operação e precauções da terapia de acupuntura com incorporação de fios em Alzheimer

Resumo

Este estudo apresenta um protocolo para terapia de acupuntura com incorporação de fios em ratos semelhantes à doença de Alzheimer.

Resumo

A terapia de incorporação de fios (TEAT) é um tratamento que previne e gerencia doenças inserindo uma sutura biodegradável em um ponto de acupuntura, proporcionando estimulação duradoura. A TEAT é uma abordagem simples que evita o desconforto da acupuntura regular e proporciona efeitos terapêuticos sustentados. Este artigo discute o impacto potencial do TEAT nas habilidades de aprendizagem e memória de ratos com sintomas semelhantes aos da doença de Alzheimer. Uma vez que a degeneração neuronal induzida quimicamente e as deficiências cognitivas em ratos não refletem inteiramente as verdadeiras alterações patológicas observadas na doença de Alzheimer. Consequentemente, nosso grupo de pesquisa designou essas manifestações como sintomas semelhantes aos da doença de Alzheimer. Um protocolo foi estabelecido para delinear a seleção de pontos de acupuntura, o processo de operação e as precauções necessárias para a cabeça e a região lombar. O experimento foi conduzido em três grupos: um grupo controle, um grupo modelo e um grupo TEA, cada um contendo 6 ratos. Para induzir sintomas semelhantes aos da doença de Alzheimer, os ratos foram injetados intraperitonealmente com D-galactose por 7 semanas (49 dias). Os ratos do grupo TEAT receberam tratamento de incorporação de categute de acupuntura. Após o período de intervenção, um labirinto aquático de Morris (MWM) foi realizado para avaliar o aprendizado e a memória dos ratos. Posteriormente, os ratos foram sacrificados e seu tecido cerebral foi examinado. Um exame histológico foi realizado para entender os efeitos do TEAT na patologia de ratos que apresentavam sintomas da doença de Alzheimer. Este estudo sugere que o TEAT pode melhorar o aprendizado e a memória em ratos com sintomas semelhantes aos da doença de Alzheimer, indicando uma nova abordagem de tratamento potencialmente promissora para essa condição neurodegenerativa.

Introdução

A acupuntura com incorporação de fios (TEA) envolve a incorporação de categute ou suturas absorvíveis em pontos de acupuntura usando uma agulha especial. Esta técnica tem um efeito prolongado até que as suturas sejam absorvidas e degradadas. Ele fornece estimulação contínua e sustentada aos pontos de acupuntura por uma semana ou mais¹, alcançando um resultado comparável sem a necessidade de procedimentos repetitivos diários². Isso reduz o número de pacientes que procuram tratamento médico, conservando assim os recursos médicos até certo ponto. Nos últimos anos, o TEAT tem sido cada vez mais usado em várias áreas médicas na China, incluindo medicina interna, medicina externa, dermatologia, características faciais, ginecologia e pediatria³. Estudos demonstraram que é eficaz na produção de efeitos confiáveis e de longo prazo para certas doenças crônicas e complexas, como epilepsia⁴ e paralisia do nervo facial⁵. Tem as vantagens de trauma mínimo e operação simples⁶. Além disso, os custos do tratamento do TEAT foram relatados como menores do que os da eletroacupuntura (EA)⁷. Por isso, o TEAT é cada vez mais valorizado na investigação clínica e científica.

A doença de Alzheimer (DA) é uma condição neurodegenerativa que progride com o tempo. Seu processo fisiopatológico começa a se acumular aproximadamente 20 anos antes do aparecimento dos sintomas clínicos, mas seu mecanismo ainda não é totalmente^{compreendido8}. Dada a disponibilidade limitada de medicamentos eficazes para a DA, a pesquisa está cada vez mais focada nos estágios prodrômicos e pré-clínicos da doença⁹. A prevenção é uma estratégia crucial para abordar o desenvolvimento e a progressão da AD ^9,10. Nos últimos anos, a medicina tradicional chinesa (MTC) tem feito progressos significativos e espera-se que ofereça novas possibilidades de prevenção e tratamento da ^DA11,12. Como um subtipo de acupuntura, o TEAT é preferido a outras terapias devido à sua ampla faixa de tratamento, trauma mínimo, operação simples, baixa frequência de tratamento e eficácia duradoura⁶. A literatura emergente sugere que o TEAT pode beneficiar indivíduos com obesidade^13,14, diabetes¹⁵, insônia¹⁶, osteoporose pós-menopausa¹⁷ e depressão¹⁸, todos fatores de risco para DA. Também melhora a senescência em ratos idosos, regulando a mitofagia², melhora o aprendizado espacial e o comprometimento da memória, alivia os danos patológicos do hipocampo e inibe a resposta inflamatória em ratos com demência vascular (DV)¹⁹. Parecia atraente descobrir se o TEAT também poderia atuar em processos patológicos durante a DA.

A pesquisa atual carece de uniformidade e padronização em vários elementos críticos da operação do TET, incluindo o método de incorporação, ferramenta de incorporação, rosca e período de intervalo de incorporação. Essa falta de padronização afeta a avaliação do efeito da terapia e a exploração de mecanismos relacionados e restringe a promoção e comunicação externas. Pesquisas anteriores^20,21 demonstraram que a administração intraperitoneal de D-galactose (D-gal) pode induzir alterações patológicas semelhantes à doença de Alzheimer em ratos, incluindo degeneração neuronal e deficiências cognitivas. Além disso, a eletroacupuntura no Baihui (GV20) e Shenshu (BL23) demonstrou melhorar efetivamente o declínio cognitivo, mitigar a neuroinflamação e reduzir o dano neuronal. Este estudo toma como exemplo o modelo de ratos semelhantes à doença de Alzheimer para introduzir a seleção de pontos de acupuntura e o processo de operação e precauções do TEAT sob este modelo. Ele discute os elementos operacionais críticos do TEAT em pesquisas experimentais para fornecer uma referência para estudos futuros.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados seguindo o Guia do National Institutes of Health para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê de Gerenciamento e Uso de Animais de Laboratório do Centro Provincial de Controle e Prevenção de Doenças de Hubei. Um total de 18 ratas Sprague-Dawley (SD) de 3 meses de idade, pesando 220-250 g, foram usadas para o teste. Todos os ratos foram mantidos em um ciclo claro/escuro de 12 h a 23 ± 1 °C e umidade de 40%-50%, com livre acesso a comida e água. Após um período de aclimatação de uma semana, durante o qual os ratos foram autorizados a se habituar às condições de laboratório, os experimentos foram iniciados.

1. Desenvolvimento do modelo

1. O desenho experimental é mostrado na Figura 1. Divida aleatoriamente 18 ratas Sprague-Dawley de 3 meses pesando 220-250 g em grupos controle, modelo e TEAT. Cada grupo é composto por 6 ratos.
2. Injetar diariamente D-galactose (D-gal; 120 mg/kg/dia) no grupo modelo e no grupo TEAT diariamente, enquanto o grupo controle recebe injeções de solução salina (120 mg/kg/dia), por 7 semanas (49 dias) na área ventral inferior²². A injeção deve ser administrada diariamente entre 8h00 e 9h00.
3. Pese os ratos no 7º dia de cada semana entre 9:00 e 10:00 da manhã. O experimento teve duração de 49 dias. Enterre os fios a cada 14 dias nos dias 14, 28 e 42^. Fixe o horário para cada incorporação de thread entre 9:00 e 12:00 da manhã.
4. Continuar a administração intraperitoneal de D-galactose por 7 semanas para induzir manifestações patológicas relacionadas à doença de Alzheimer em ratos²².

2. Preparação para o TEAT

1. Esterilize instrumentos cirúrgicos, como tesouras oftálmicas, bandejas e pinças e desinfete. Limpe bem as superfícies do ambiente da sala de cirurgia e desinfete.
2. Prepare a plataforma cirúrgica colocando uma almofada de aquecimento para pequenos animais na superfície, seguida de uma toalha estéril. Em seguida, coloque a placa de operação limpa e desinfetada suavemente em cima, com o lado áspero voltado para cima. Em seguida, ligue a almofada de aquecimento e ajuste a temperatura para 32 °C.
3. Para o procedimento, selecione uma agulha de inclusão de fio descartável nº 6 com diâmetro de 0,6 mm e uma sutura cirúrgica absorvível 5-0 (sutura de colágeno) com comprimento de 2 cm. Corte a sutura cirúrgica absorvível 5-0 de 2 cm em pedaços de 0,5 cm e 0,2 cm usando uma tesoura oftálmica. Mergulhe o fio cortado em solução salina a 0,9% e reserve.
4. Lave as mãos com água e sabão por 20 s e depois seque-as. Depois, use luvas estéreis.
5. Anestesiar os ratos com uma injeção IP de hidrato de cloral (300 mg/kg) na região ventral inferior, garantindo que a anestesia seja confirmada quando os animais não responderem em um plano cirúrgico, com base na falta de resposta de um teste de pinça do dedo do pé, e mantendo um estado fisiológico estável. Além disso, para evitar o ressecamento da córnea e possíveis danos enquanto os ratos estão sob anestesia, aplique uma quantidade generosa de pomada veterinária nos olhos, garantindo que eles permaneçam lubrificados durante todo o procedimento.
   NOTA: Recomenda-se anestesiar o rato, pois é doloroso para ele experimentar o piercing.

3. Operação de incorporação de roscas para Baihui (GV 20)

1. Localize o ponto de acupuntura Baihui (GV 20) em ratos no ponto médio direito do osso parietal (Figura 2A). Posicione os ratos para expor totalmente a cabeça, com as orelhas puxadas para a frente para se aproximar do método usado em humanos para conectar as linhas do ápice da orelha. Identifique o ponto Baihui (GV 20) palpando a crista longitudinal central do crânio e identificando a localização aproximadamente em seu ponto médio. Confirme esse ponto de acupuntura ainda mais no nível em que as orelhas entrariam em contato com a cabeça se colocadas planas, alinhando-se com a interseção da sutura sagital e do osso parietal. Use um marcador para marcar Baihui (GV 20).
2. Raspe a área da cabeça ao redor do ponto de acupuntura do rato usando um aparador (geralmente um aparador de barba masculino elétrico).
3. Antes da cirurgia, desinfete os pontos de acupuntura e a pele ao redor aplicando uma solução de iodo a 0,5% em movimentos circulares, começando do centro e movendo-se para fora. Posteriormente, execute um processo de desinfecção tripla: use o iodóforo 3x, cada um seguido de uma aplicação de álcool para garantir a descontaminação adequada e preparar o local para a técnica asséptica.
4. Use uma pinça para prender a sutura cirúrgica absorvível de 0,2 cm embebida em solução salina e coloque-a na extremidade frontal do tubo da agulha. Em seguida, conecte-o ao núcleo da agulha.
5. Aperte a área ao redor do Baihui (GV 20) com o polegar e o indicador em uma mão, enquanto segura a agulha com a outra.
6. Insira a agulha horizontalmente e rapidamente em um ângulo de 15° em relação à superfície da pele, 0,1 cm abaixo do ponto Baihui (GV 20), enquanto pinça a pele (Figura 3A).
7. Depois que a ponta da agulha atingir 0,1 cm acima do ponto Baihui (GV 20), empurre o núcleo da agulha enquanto retrai o tubo da agulha para implantar totalmente a sutura cirúrgica absorvível de 0,2 cm no tecido subcutâneo do ponto de acupuntura (Figura 3B).
8. Remova lentamente a agulha, certificando-se de que nenhuma sutura esteja exposta. Pressione o orifício da agulha com algodão seco estéril por 10 s para evitar sangramento. Se a rosca estiver fora do corpo depois de incorporar a linha nos pontos de acupuntura, extraia-a e opere novamente.

4. Operação de incorporação de rosca para Shenshu (BL 23)

1. O ponto de acupuntura Shenshu (BL 23) em ratos está localizado 5 mm lateralmente à^2ª vértebra lombar (Figura 2B). Primeiro, localize a^6ª vértebra lombar com base no tubérculo do quadril do rato. Em seguida, localize a^2ª vértebra lombar contando quatro corpos vertebrais para cima. Shenshu (BL 23) será 5 mm lateral a ele²³.
   NOTA: A combinação dos pontos de acupuntura Baihui (GV 20) e Shenshu (BL 23) é um conjunto frequentemente utilizado na teoria da Medicina Tradicional Chinesa (MTC) para a prevenção e tratamento de distúrbios cerebrais. Conforme confirmado por pesquisas anteriores ^20,21, esse emparelhamento de pontos de acupuntura foi estabelecido por sua eficácia.
2. Use um marcador para marcar Shenshu (BL 23). Raspe a área das costas e da cintura ao redor do ponto de acupuntura do rato usando um aparador (geralmente um aparador de barba elétrico).
3. Antes da cirurgia, desinfete os pontos de acupuntura e a pele ao redor aplicando solução de iodo a 0,5% em movimentos circulares, começando do centro e movendo-se para fora. Posteriormente, execute um processo de desinfecção tripla: use o iodóforo três vezes, cada uma seguida de uma aplicação de álcool para garantir a descontaminação adequada e a preparação do local para a técnica asséptica.
4. Use uma pinça para prender a sutura cirúrgica absorvível de 0,5 cm embebida em solução salina e coloque-a na extremidade frontal do tubo da agulha. Em seguida, conecte-o ao núcleo da agulha.
5. Estique a pele com os dedos indicador e médio da mão pressionadora ou com os dedos polegar e indicador. Segure a agulha com a mão perfurante.
6. Insira rapidamente a agulha perpendicularmente no ponto 0.25 cm abaixo do Shenshu (BL 23). Veja a Figura 4A.
7. Após a ponta da agulha atingir 0,5 cm sob a pele, ajustar a ponta da agulha, tornando a direção de inserção centrípeta, formando um ângulo de 45° com a superfície da pele e inserir obliquamente 0,5 cm (Figura 4B).
   NOTA: É importante ter cuidado ao agulhar o Shenshu (BL 23), que está localizado perto do rim. A inserção profunda ou o levantamento e impulso repetidos da agulha podem causar danos. Portanto, recomendamos uma profundidade de inserção de cerca de 0,3-0,6 cm.
8. Empurre o núcleo da agulha enquanto retrai o tubo e implante totalmente a sutura cirúrgica absorvível de 0,5 cm no tecido muscular do ponto de acupuntura (Figura 4C).
9. Puxe lentamente a agulha, garantindo que nenhuma sutura seja exposta. Em seguida, pressione o orifício da agulha com algodão seco estéril por 10 s para evitar sangramento. Se a rosca estiver fora do corpo depois de incorporar a linha nos pontos de acupuntura, extraia-a e opere novamente.

5. Cuidados pós-operatórios

1. No pós-operatório, coloque o rato em uma almofada de aquecimento para pequenos animais ajustada a uma temperatura de 32°C para facilitar a recuperação da anestesia. Certifique-se de que o animal esteja totalmente consciente e que sua condição seja satisfatória antes de devolvê-lo ao seu recinto.
2. Após a cirurgia, observe sinais de respostas inflamatórias estéreis na área afetada dentro de uma semana. Esses sinais podem incluir vermelhidão, inchaço ou secreção semelhante a pus. Normalmente, esses sintomas não requerem nenhum tratamento. No entanto, se houver uma quantidade excessiva de exsudato, drene e desinfete a área afetada. Nesses casos, aplique pomada de eritromicina até que a ferida se recupere totalmente.

6. Teste comportamental e exame histológico

1. Após a intervenção, na semana 8, realizar o experimento Morris Water Maze (MWM) ^2,24 para avaliar suas capacidades de aprendizado e memória. Realize os testes de aprendizagem ao longo de 5 dias, com quatro testes por dia. Em seguida, administre um teste de sonda após 24 horas do último dia de aquisição.
2. Realize comparações estatísticas usando software de análise estatística. Analisar os dados comportamentais da capacidade de aprendizagem por análise de variância (ANOVA) unidirecional e teste post-hoc de Tukey. Avalie a significância dos dados de latência de escape por análise de variância de medidas repetidas (ANOVA) de duas vias, seguida pelo teste post-hoc de Bonferroni. Um valor de p <0,05 é considerado significativo em todos os testes.
3. Após a avaliação comportamental, anestesiar os ratos como acima e eutanasiar com injeções intraperitoneais de 150 mg/kg de peso corporal de pentobarbital sódico.
4. Fixe o cérebro do rato por meio de perfusão usando paraformaldeído a 4% perfundido através do sistema vascular²⁵.
   1. Inserção e fixação da agulha de gavagem
      1. Prepare uma agulha 12G e certifique-se de que esteja reta e adequada para passar pelo ventrículo do rato. Localize o ventrículo do rato, que normalmente é o ventrículo esquerdo, e insira a agulha através dele na aorta ascendente. Esta etapa requer precisão e uma boa compreensão da anatomia do rato.
      2. Uma vez que a agulha esteja no lugar, use um hemostático para prender a agulha de gavagem perto do ponto onde ela entra na aorta. Isso ajudará a prender a agulha e evitar que ela se mova.
      3. Certifique-se de que o grampo esteja apertado o suficiente para segurar a agulha com segurança, mas não tão apertado a ponto de danificar a aorta ou impedir o fluxo sanguíneo. A agulha de gavagem deve permanecer na aorta ascendente durante todo o procedimento para manter a perfusão adequada.
   2. Perfusão com soro fisiológico
      1. Prepare uma seringa de 50cc sem agulha para a perfusão. Prenda a outra extremidade da agulha de gavagem, que está fora do corpo do rato, à seringa cheia de solução salina normal.
      2. Faça uma pequena incisão para cortar o apêndice atrial direito para permitir que o sangue flua para fora do coração. Esta etapa garante que o sangue seja deslocado pela solução salina durante a perfusão.
      3. Comece a injetar a solução salina normal na aorta ascendente a uma taxa constante e constante. Isso eliminará o sangue e preparará os tecidos para a fixação.
      4. Monitore o fluido que sai do apêndice atrial direito e esteja preparado para trocar a seringa conforme necessário para manter uma perfusão contínua com solução salina fresca.
         colocado, prepare-se para perfundir com o fixador.
      5. Substitua a seringa contendo solução salina por outra contendo 4% de paraformaldeído, um fixador comumente usado em histologia. Prossiga com a perfusão usando o paraformaldeído para fixar os tecidos no lugar para posterior processamento e análise.
         NOTA: Ao longo deste procedimento, é crucial manter técnicas assépticas para prevenir infecções e manusear o rato com cuidado para minimizar lesões. Além disso, todo o pessoal envolvido deve ser treinado na técnica para garantir consistência e eficácia.
5. Retirar o cérebro do rato e colocá-lo num frasco de amostra contendo paraformaldeído a 4% durante 24-48 h a 4 °C ^25,26. Realize a desidratação com etanol e o tratamento com xileno passo a passo, seguido de cortes coronais contínuos convencionais (4-5 μm) para medição. Avaliar a morfologia e a perda de neurônios do hipocampo em cada grupo usando coloração de hematoxilina e eosina (H & E) (200x).
   NOTA: Um exame de necropsia para avaliar lesões gastrointestinais (GI) não foi realizado nos roedores com base na ausência de sinais clínicos indicativos de distúrbios gastrointestinais durante todo o período experimental. Os animais não apresentaram reações adversas evidentes que sugerissem a presença de tais patologias.

Resultados

Este artigo apresenta o método de operação específico do TEAT em ratos semelhantes à doença de Alzheimer. Ele discute os elementos operacionais críticos do TEAT em pesquisas experimentais para fornecer uma referência para estudos futuros.

TEAT melhora a aprendizagem em ratos com doença de Alzheimer
Conforme ilustrado no fluxograma (Figura 5), durante o período de treinamento adaptativo, observou-se que os ratos de cada grupo observava...

Discussão

Tempo de intervenção
A etiologia da DA é complexa e sua patogênese permanece incerta. Atualmente, não há tratamento eficaz para a doença e seu curso é irreversível. Portanto, a comunidade acadêmica chegou a um consenso sobre a importância de focar na prevenção e tratamento da DA. As estratégias de prevenção e tratamento da DA enfatizam a intervenção precoce, seguindo o conceito da MTC de tratar as condições antes que elas ocorram, enfatizando o tratamento antes de seu início, tran...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline, 4% paraformaldehyde, Hematoxylin, Eosin Y (water-soluble), absolute ethanol, 0.01M PBS powder, xylene, hydrochloric acid, embedded paraffin, neutral gum	sinopharm (www.sinopharm.com)
5-0 absorbable surgical suture	bodamedical (www.bodamedical.com)
70% alcohol, iodophor, cotton ball			Used for disinfection.
chloral hydrate	sigma	C8383
coverslips, glass slides	Guangzhou Wuqiang Experimental Equipment Co., Ltd
Dehydrator	Wuhan Junjie JT-12J Computerized Biological Tissue Dehydrator
DELUXE THERMOSTAT HEAT MAT	Zhenhua Instruments		For maintaining the body temperature of rats.
D-galactose	sigma	G0750
electric men's beard trimmer			Used for shaving rats.
Electronic scale for small animals (ZK-DST)	Henan Zhike Information Technology Co., Ltd
erythromycin ointment	frontpharm
glass dish			Used to place cut absorbable sutures.
High-Pressure Steam Sterilization Pot (YM100Z)	Shanghai Sanshen medical equipment factory		For sterilization of surgical instruments.
Ice Maker (CMB40)	Shanghai Sheyan Instrument Co., Ltd.
Microscope (BX-53)	OLYMPUS
milk powder			Used for the MWM test.
Morris Water Maze Video Tracking System & Data Analysis Software (Version: Watermaze 2.0)	Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd
No.6 thread-embedding needle	bodamedical (www.bodamedical.com)
ophthalmic scissors, trays, tweezers
Pathology Microtome  (RM 2016)	LEICA, Germany
pentobarbital	Germany	P11011
permanent marker			Used to mark the acupoint.
Slicing knives (R35)	Feathers, Japanese
soap			Used to wash hands.
sterile gloves