Procedimiento de operación y precauciones de la terapia de acupuntura con incrustación de hilos en el Alzheimer

Resumen

Este estudio presenta un protocolo para la terapia de acupuntura con incrustación de hilos en ratas similares a la enfermedad de Alzheimer.

Resumen

La terapia de incrustación de hilos (TEAT) es un tratamiento que previene y controla enfermedades mediante la inserción de una sutura biodegradable en un punto de acupuntura, proporcionando una estimulación duradera. La tetina es un enfoque simple que evita las molestias de la acupuntura regular y proporciona efectos terapéuticos sostenidos. Este artículo analiza el impacto potencial de TEAT en las habilidades de aprendizaje y memoria de ratas con síntomas similares a la enfermedad de Alzheimer. Dado que la degeneración neuronal inducida químicamente y las deficiencias cognitivas en ratas no reflejan completamente los verdaderos cambios patológicos observados en la enfermedad de Alzheimer. En consecuencia, nuestro grupo de investigación ha designado estas manifestaciones como síntomas similares a la enfermedad de Alzheimer. Se ha establecido un protocolo para describir la selección de los puntos de acupuntura, el proceso de operación y las precauciones necesarias para la cabeza y la espalda baja. El experimento se llevó a cabo en tres grupos: un grupo de control, un grupo modelo y un grupo TEAT, cada uno con 6 ratas. Para inducir síntomas similares a los de la enfermedad de Alzheimer, se inyectó D-galactosa a las ratas por vía intraperitoneal durante 7 semanas (49 días). Las ratas del grupo TEAT recibieron un tratamiento de inclusión de catgut con punto de acupuntura. Después del período de intervención, se llevó a cabo un laberinto acuático de Morris (MWM) para evaluar el aprendizaje y la memoria de las ratas. Posteriormente, se sacrificaron las ratas y se examinó su tejido cerebral. Se realizó un examen histológico para comprender los efectos de la TEAT en la patología de ratas que presentaban síntomas de la enfermedad de Alzheimer. Este estudio sugiere que TEAT puede mejorar el aprendizaje y la memoria en ratas con síntomas similares a los de la enfermedad de Alzheimer, lo que indica un nuevo enfoque de tratamiento potencialmente prometedor para esta afección neurodegenerativa.

Introducción

La acupuntura con hilos incrustados (TEA, por sus siglas en inglés) consiste en incrustar tripa de gato o suturas absorbibles en los puntos de acupuntura con una aguja especial. Esta técnica tiene un efecto prolongado hasta que las suturas se absorben y se degradan. Proporciona una estimulación continua y sostenida de los puntos de acupuntura durante una semana o más¹, logrando un resultado comparable sin la necesidad de procedimientos repetitivos diarios². Esto reduce el número de pacientes que buscan tratamiento médico, conservando así los recursos médicos hasta cierto punto. En los últimos años, TEAT se ha utilizado cada vez más en varios campos médicos en China, incluida la medicina interna, la medicina externa, la dermatología, los rasgos faciales, la ginecología y la pediatría³. Los estudios han demostrado que es eficaz para producir efectos a largo plazo y fiables para ciertas enfermedades crónicas y complejas, como la epilepsia⁴ y la parálisis del nervio facial⁵. Tiene las ventajas de un trauma mínimo y una operación simple⁶. Además, se ha reportado que los costos del tratamiento de la TEAT son más bajos que los de la electroacupuntura (EA)⁷. Por lo tanto, el TEAT es cada vez más valorado en la investigación clínica y científica.

La enfermedad de Alzheimer (EA) es una afección neurodegenerativa que progresa con el tiempo. Su proceso fisiopatológico comienza a acumularse aproximadamente 20 años antes de que aparezcan los síntomas clínicos, pero su mecanismo aún no se comprende completamente⁸. Dada la limitada disponibilidad de fármacos eficaces para la EA, la investigación se centra cada vez más en las fases prodrómica y preclínica de la enfermedad⁹. La prevención es una estrategia crucial para abordar el desarrollo y la progresión de la EA ^9,10. En los últimos años, la medicina tradicional china (MTC) ha logrado avances significativos y se espera que ofrezca nuevas posibilidades para prevenir y tratar la EA^11,12. Como subtipo de acupuntura, se prefiere la TEAT sobre otras terapias debido a su amplia gama de tratamientos, trauma mínimo, operación simple, baja frecuencia de tratamiento y eficacia duradera⁶. La literatura emergente sugiere que el TEAT puede beneficiar a las personas con obesidad^13,14, diabetes¹⁵, insomnio¹⁶, osteoporosis posmenopáusica¹⁷ y depresión¹⁸, todos los cuales son factores de riesgo para la EA. También mejora la senescencia en ratas envejecidas mediante la regulación de la mitofagia², mejora el aprendizaje espacial y el deterioro de la memoria, alivia el daño patológico del hipocampo e inhibe la respuesta inflamatoria en ratas con demencia vascular (VD)¹⁹. Parecía atractivo averiguar si el TEAT también podía actuar sobre los procesos patológicos durante la EA.

La investigación actual carece de uniformidad y estandarización en varios elementos críticos de la operación de TEAT, incluido el método de incrustación, la herramienta de incrustación, el hilo y el período de intervalo de incrustación. Esta falta de estandarización afecta la evaluación del efecto de la terapia y la exploración de los mecanismos relacionados, y restringe la promoción y la comunicación externas. Investigaciones previas ^20,21 han demostrado que la administración intraperitoneal de D-galactosa (D-gal) puede inducir cambios patológicos similares a la enfermedad de Alzheimer en ratas, incluyendo degeneración neuronal y deficiencias cognitivas. Además, se ha demostrado que la electroacupuntura en el Baihui (GV20) y Shenshu (BL23) mejora eficazmente el deterioro cognitivo, mitiga la neuroinflamación y reduce el daño neuronal. Este estudio toma como ejemplo ratas modelo similares a la enfermedad de Alzheimer para presentar la selección de puntos de acupuntura y el proceso de operación y las precauciones de TEAT bajo este modelo. Se analizan los elementos operativos críticos de TEAT en la investigación experimental para proporcionar una referencia para estudios futuros.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo siguiendo la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité de Manejo y Uso de Animales de Laboratorio del Centro Provincial de Control y Prevención de Enfermedades de Hubei. Se utilizaron para la prueba 18 ratas Sprague-Dawley (SD) hembras de 3 meses de edad con un peso de 220-250 g. Todas las ratas se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h a 23 ± 1 °C y 40%-50% de humedad, con libre acceso a comida y agua. Después de un período de aclimatación de una semana, durante el cual se permitió a las ratas habituarse a las condiciones del laboratorio, se iniciaron los experimentos.

1. Desarrollo del modelo

1. El diseño experimental se muestra en la Figura 1. Divida aleatoriamente 18 ratas hembras Sprague-Dawley de 3 meses de edad que pesaban entre 220 y 250 g en grupos de control, modelo y TEAT. Cada grupo consta de 6 ratas.
2. Inyectar diariamente D-galactosa (D-gal; 120 mg/kg/día) al grupo modelo y al grupo TEAT, mientras que el grupo control recibe inyecciones de solución salina (120 mg/kg/día), durante 7 semanas (49 días) en la zona ventral inferior²². La inyección debe administrarse diariamente entre las 8:00 y las 9:00 a.m.
3. Pesar las ratas el 7º día de cada semana entre las 9:00 y las 10:00 a.m. El experimento duró 49 días. Entierra los hilos cada 14 días los días 14^, 28 y 42. Fije la hora de cada incrustación de subprocesos entre las 9:00 y las 12:00 a.m.
4. Continuar la administración intraperitoneal de D-galactosa durante 7 semanas para inducir manifestaciones patológicas relacionadas con la enfermedad de Alzheimer en ratas²².

2. Preparación para la tetina

1. Esterilice los instrumentos quirúrgicos, como tijeras oftálmicas, bandejas y pinzas, y desinfecte. Limpie a fondo las superficies del entorno del quirófano y desinféctelas.
2. Prepare la plataforma quirúrgica colocando una almohadilla térmica para animales pequeños sobre la superficie, seguida de una toalla estéril. A continuación, coloque suavemente el tablero de operaciones limpio y desinfectado en la parte superior, con el lado rugoso hacia arriba. A continuación, encienda la almohadilla térmica y ajuste la temperatura a 32 °C.
3. Para el procedimiento, seleccione una aguja desechable de inserción de hilo n.º 6 con un diámetro de 0,6 mm y una sutura quirúrgica reabsorbible 5-0 (sutura de colágeno) con una longitud de 2 cm. Cortar la sutura quirúrgica reabsorbible 5-0 de 2 cm en trozos de 0,5 cm y 0,2 cm con unas tijeras oftálmicas. Remojar el hilo cortado en solución salina al 0,9% y reservar.
4. Lávese las manos con agua y jabón durante 20 s y luego séquelas. Después, use guantes estériles.
5. Anestesiar a las ratas con una inyección IP de hidrato de cloral (300 mg/kg) en la zona ventral inferior, asegurando que la anestesia se confirme cuando los animales no responden en un plano quirúrgico, basándose en la falta de respuesta de una prueba de pinzamiento de los dedos del pie, y manteniendo un estado fisiológico estable. Además, para prevenir la sequedad de la córnea y el daño potencial mientras las ratas están bajo anestesia, aplique una cantidad generosa de ungüento veterinario en los ojos, asegurándose de que permanezcan lubricados durante todo el procedimiento.
   NOTA: Se recomienda anestesiar a la rata, ya que es doloroso para ellas experimentar el piercing.

3. Operación de incrustación de roscas para Baihui (GV 20)

1. Localice el punto de acupuntura Baihui (GV 20) en ratas en el punto medio derecho del hueso parietal (Figura 2A). Coloque las ratas para exponer completamente la cabeza, con las orejas tiradas hacia adelante para aproximarse al método utilizado en los humanos para conectar las líneas del ápice de la oreja. Identifique el punto Baihui (GV 20) palpando la cresta longitudinal central del cráneo y señalando la ubicación aproximadamente en su punto medio. Confirme este punto de acupuntura aún más al nivel donde las orejas harían contacto con la cabeza si se colocan planas, alineándose con la intersección de la sutura sagital y el hueso parietal. Usa un marcador para marcar Baihui (GV 20).
2. Afeita el área de la cabeza alrededor del punto de acupuntura de la rata con una recortadora (por lo general, una recortadora de barba eléctrica para hombres).
3. Antes de la cirugía, desinfecte los puntos de acupuntura y la piel circundante aplicando una solución de yodo al 0,5% con movimientos circulares, comenzando desde el centro y moviéndose hacia afuera. A continuación, realizar un triple proceso de desinfección: utilizar el yodóforo 3 veces, seguidas de una aplicación de alcohol para garantizar una correcta descontaminación y preparar el lugar para la técnica aséptica.
4. Utilice fórceps para sujetar la sutura quirúrgica reabsorbible de 0,2 cm empapada en solución salina y colóquela en el extremo delantero del tubo de la aguja. Luego, conéctelo al núcleo de la aguja.
5. Pellizque el área alrededor de Baihui (GV 20) con el pulgar y el índice de una mano, mientras sostiene la aguja con la otra.
6. Inserte la aguja horizontal y rápidamente en un ángulo de 15° con respecto a la superficie de la piel, 0,1 cm por debajo del punto Baihui (GV 20), mientras pellizca la piel (Figura 3A).
7. Después de que la punta de la aguja alcance 0,1 cm por encima del punto Baihui (GV 20), empuje el núcleo de la aguja mientras retrae el tubo de la aguja para implantar completamente la sutura quirúrgica absorbible de 0,2 cm en el tejido subcutáneo del punto de acupuntura (Figura 3B).
8. Retire lentamente la aguja, asegurándose de que no quede ninguna sutura expuesta. Presione el orificio de la aguja con algodón seco estéril durante 10 segundos para evitar el sangrado. Si el hilo está fuera del cuerpo después de incrustar la línea en los puntos de acupuntura, extráigalo y vuelva a operar.

4. Operación de incrustación de roscas para Shenshu (BL 23)

1. El punto de acupuntura Shenshu (BL 23) en ratas se localiza 5 mm lateral a la^2ª vértebra lumbar (Figura 2B). En primer lugar, localice la^6ª vértebra lumbar basándose en el tubérculo de la cadera de la rata. A continuación, localice la^2ª vértebra lumbar contando hacia arriba cuatro cuerpos vertebrales. Shenshu (BL 23) será 5 mm lateral a él²³.
   NOTA: La combinación de los puntos de acupuntura Baihui (GV 20) y Shenshu (BL 23) es un conjunto frecuentemente utilizado en la teoría de la Medicina Tradicional China (MTC) para la prevención y el tratamiento de trastornos cerebrales. Como lo confirmaron investigaciones previas^20,21, este emparejamiento de puntos de acupuntura ha sido establecido por su eficacia.
2. Usa un marcador para marcar Shenshu (BL 23). Afeita el área de la espalda y la cintura alrededor del punto de acupuntura de la rata con una recortadora (generalmente una recortadora de barba eléctrica).
3. Antes de la cirugía, desinfecte los puntos de acupuntura y la piel circundante aplicando una solución de yodo al 0,5% con movimientos circulares, comenzando desde el centro y moviéndose hacia afuera. A continuación, realizar un triple proceso de desinfección: utilizar el yodóforo tres veces, seguidas de una aplicación de alcohol para garantizar una correcta descontaminación y preparación del lugar para la técnica aséptica.
4. Utilice fórceps para sujetar la sutura quirúrgica reabsorbible de 0,5 cm empapada en solución salina y colóquela en el extremo delantero del tubo de la aguja. Luego, conéctelo al núcleo de la aguja.
5. Estire la piel con los dedos índice y medio de la mano que presiona o con los dedos pulgar e índice. Sostenga la aguja con la mano punzante.
6. Inserte rápidamente la aguja perpendicularmente en el punto 0,25 cm por debajo del Shenshu (BL 23). Véase la figura 4A.
7. Después de que la punta de la aguja alcance 0,5 cm debajo de la piel, ajuste la punta de la aguja, haciendo que la dirección de inserción sea centrípeta, formando un ángulo de 45° con la superficie de la piel e inserte oblicuamente 0,5 cm (Figura 4B).
   NOTA: Es importante tener cuidado al pinchar el Shenshu (BL 23), que se encuentra cerca del riñón. La inserción profunda o el levantamiento y empuje repetidos de la aguja pueden causar daños. Por lo tanto, recomendamos una profundidad de inserción de alrededor de 0,3-0,6 cm.
8. Empuje el núcleo de la aguja mientras retrae el tubo e implante completamente la sutura quirúrgica absorbible de 0,5 cm en el tejido muscular del punto de acupuntura (Figura 4C).
9. Tire lentamente de la aguja, asegurándose de que no quede expuesta ninguna sutura. A continuación, presione el orificio de la aguja con algodón seco estéril durante 10 s para evitar el sangrado. Si el hilo está fuera del cuerpo después de incrustar la línea en los puntos de acupuntura, extráigalo y vuelva a operar.

5. Cuidados postoperatorios

1. En el postoperatorio, coloque a la rata sobre una almohadilla térmica para animales pequeños a una temperatura de 32 °C para facilitar la recuperación de la anestesia. Asegúrese de que el animal esté completamente consciente y su condición sea satisfactoria antes de devolverlo a su recinto de alojamiento.
2. Después de la cirugía, observe signos de respuestas inflamatorias estériles en el área afectada dentro de una semana. Estos signos pueden incluir enrojecimiento, hinchazón o una secreción similar al pus. Por lo general, estos síntomas no requieren ningún tratamiento. Sin embargo, si hay una cantidad excesiva de exudado, drene y desinfecte el área afectada. En tales casos, aplique ungüento de eritromicina hasta que la herida se recupere por completo.

6. Pruebas conductuales y examen histológico

1. Después de la intervención, en la semana 8, realizar el experimento Morris Water Maze (MWM) ^2,24 para evaluar sus capacidades de aprendizaje y memoria. Realice las pruebas de aprendizaje durante 5 días, con cuatro pruebas por día. A continuación, administre una prueba de sonda después de 24 horas desde el último día de adquisición.
2. Realizar comparaciones estadísticas utilizando software de análisis estadístico. Analizar los datos conductuales de la capacidad de aprendizaje mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA) y test de Tukey post-hoc. Evaluar la importancia de los datos de latencia de escape mediante el análisis de varianza de medidas repetidas bidireccionales (ANOVA) seguido de la prueba de Bonferroni post-hoc. Un valor de p <0,05 se considera significativo en todas las pruebas.
3. Después de la evaluación del comportamiento, anestesiar a las ratas como se indicó anteriormente y eutanasiar con inyecciones intraperitoneales de 150 mg/kg de peso corporal de pentobarbital sódico.
4. Fijar el cerebro de la rata a través de la perfusión utilizando paraformaldehído al 4% perfundido a través del sistema vascular²⁵.
   1. Inserción y fijación de la aguja de sonda nasogástrica
      1. Prepare una aguja de 12G y asegúrese de que esté recta y sea adecuada para pasar a través del ventrículo de la rata. Localiza el ventrículo de la rata, que suele ser el ventrículo izquierdo, e inserta la aguja a través de él hasta la aorta ascendente. Este paso requiere precisión y una buena comprensión de la anatomía de la rata.
      2. Una vez que la aguja esté en su lugar, use un hemostático para sujetar la aguja de sonda nasogástrica cerca del punto donde ingresa a la aorta. Esto ayudará a asegurar la aguja y evitará que se mueva.
      3. Asegúrese de que la pinza esté lo suficientemente apretada como para sujetar la aguja de forma segura, pero no tanto como para dañar la aorta o impedir el flujo sanguíneo. La aguja sonda nasogástrica debe permanecer en la aorta ascendente durante todo el procedimiento para mantener una perfusión adecuada.
   2. Perfusión con solución salina normal
      1. Prepare una jeringa de 50 cc sin aguja para la perfusión. Conecta el otro extremo de la aguja de sonda nasogástrica, que está fuera del cuerpo de la rata, a la jeringa llena de solución salina normal.
      2. Haga una pequeña incisión para cortar el apéndice auricular derecho y permitir que la sangre fluya fuera del corazón. Este paso asegura que la sangre sea desplazada por la solución salina durante la perfusión.
      3. Comience a inyectar la solución salina normal en la aorta ascendente a un ritmo constante y constante. Esto eliminará la sangre y preparará los tejidos para la fijación.
      4. Controle el líquido que sale de la orejuela auricular derecha y esté preparado para cambiar la jeringa según sea necesario para mantener una perfusión continua con solución salina fresca.
         colocado, prepárese para perfundir con el fijador.
      5. Reemplace la jeringa que contiene solución salina por una que contenga 4% de paraformaldehído, un fijador de uso común en histología. Proceda con la perfusión utilizando el paraformaldehído para fijar los tejidos en su lugar para su posterior procesamiento y análisis.
         NOTA: A lo largo de este procedimiento, es crucial mantener técnicas asépticas para prevenir infecciones y manipular la rata con cuidado para minimizar las lesiones. Además, todo el personal involucrado debe estar capacitado en la técnica para garantizar la consistencia y la efectividad.
5. Retirar el cerebro de rata y colocarlo en un frasco de muestra que contenga un 4% de paraformaldehído durante 24-48 h a 4 °C^25,26. Realice la deshidratación de etanol y el tratamiento con xileno paso a paso, seguido de secciones coronales continuas convencionales (4-5 μm) para la medición. Evaluar la morfología y la pérdida de neuronas del hipocampo en cada grupo mediante tinción con hematoxilina y eosina (H&E) (200x).
   NOTA: No se realizó un examen de necropsia para evaluar lesiones gastrointestinales (GI) en los roedores debido a la ausencia de signos clínicos indicativos de alteraciones gastrointestinales durante todo el período experimental. Los animales no mostraron reacciones adversas manifiestas que sugirieran la presencia de tales patologías.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Este artículo presenta el método de operación específico de TEAT en ratas similares a la enfermedad de Alzheimer. Se analizan los elementos operativos críticos de TEAT en la investigación experimental para proporcionar una referencia para estudios futuros.

La tetina mejora el aprendizaje en ratas similares a la enfermedad de Alzheimer
Como se ilustra en el diagrama de flujo (Figura 5), durante el período de entrenamiento adaptativo, se o...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discusión

Tiempo de intervención
La etiología de la EA es compleja y su patogenia sigue siendo incierta. En la actualidad, no existe un tratamiento eficaz para la enfermedad y su curso es irreversible. Por lo tanto, la comunidad académica ha llegado a un consenso sobre la importancia de centrarse en la prevención y el tratamiento de la EA. Las estrategias de prevención y tratamiento de la EA hacen hincapié en la intervención temprana, siguiendo el concepto de la MTC de tratar las afecciones antes de que ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline, 4% paraformaldehyde, Hematoxylin, Eosin Y (water-soluble), absolute ethanol, 0.01M PBS powder, xylene, hydrochloric acid, embedded paraffin, neutral gum	sinopharm (www.sinopharm.com)
5-0 absorbable surgical suture	bodamedical (www.bodamedical.com)
70% alcohol, iodophor, cotton ball			Used for disinfection.
chloral hydrate	sigma	C8383
coverslips, glass slides	Guangzhou Wuqiang Experimental Equipment Co., Ltd
Dehydrator	Wuhan Junjie JT-12J Computerized Biological Tissue Dehydrator
DELUXE THERMOSTAT HEAT MAT	Zhenhua Instruments		For maintaining the body temperature of rats.
D-galactose	sigma	G0750
electric men's beard trimmer			Used for shaving rats.
Electronic scale for small animals (ZK-DST)	Henan Zhike Information Technology Co., Ltd
erythromycin ointment	frontpharm
glass dish			Used to place cut absorbable sutures.
High-Pressure Steam Sterilization Pot (YM100Z)	Shanghai Sanshen medical equipment factory		For sterilization of surgical instruments.
Ice Maker (CMB40)	Shanghai Sheyan Instrument Co., Ltd.
Microscope (BX-53)	OLYMPUS
milk powder			Used for the MWM test.
Morris Water Maze Video Tracking System & Data Analysis Software (Version: Watermaze 2.0)	Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd
No.6 thread-embedding needle	bodamedical (www.bodamedical.com)
ophthalmic scissors, trays, tweezers
Pathology Microtome  (RM 2016)	LEICA, Germany
pentobarbital	Germany	P11011
permanent marker			Used to mark the acupoint.
Slicing knives (R35)	Feathers, Japanese
soap			Used to wash hands.
sterile gloves