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要約

この研究は、アルツハイマー病様ラットにおける糸埋め込み鍼治療のプロトコルを提示します。

要約

糸埋め込み療法(TEAT)は、ツボに生分解性の縫合糸を挿入することで病気を予防・管理し、刺激を長く持続させる治療法です。TEATは、通常の鍼治療の不快感を回避し、持続的な治療効果を提供するシンプルなアプローチです。この記事では、アルツハイマー病様症状のラットの学習能力と記憶能力に対するTEATの潜在的な影響について説明します。ラットの化学的に誘発されたニューロンの変性および認知障害は、アルツハイマー病で観察される真の病理学的変化を完全に反映しているわけではない。そこで、当研究グループでは、これらの症状をアルツハイマー病様症状と指定しました。ツボの選択、操作プロセス、および頭と腰に必要な予防措置を概説するためのプロトコルが確立されています。実験は、対照群、モデル群、TEAT群の3つのグループで行われ、それぞれ6匹のラットが含まれていました。アルツハイマー病様症状を誘発するために、ラットにD-ガラクトースを7週間(49日間)腹腔内注射しました。TEATグループのラットは、ツボ猫腸埋め込み治療を受けました。介入期間の後、ラットの学習と記憶を評価するために、モリスウォーターメイズ(MWM)が実施されました。その後、ラットを生贄に加工し、脳組織を検査しました。アルツハイマー病の症状を示すラットの病理に対するTEATの影響を理解するために、組織学的検査が行われました。この研究は、TEATがアルツハイマー病様症状のラットの学習と記憶を改善する可能性があることを示唆しており、この神経変性疾患に対する新しい治療アプローチが有望である可能性を示しています。

概要

糸埋め込み鍼治療(TEA)は、特殊な針を使用してキャットガットまたは吸収性縫合糸をツボに埋め込むことを含みます。この技術は、縫合糸が吸収されて劣化するまで、効果が持続します。ツボに1週間以上持続的かつ持続的な刺激を与え、毎日の反復的な手順2を必要とせずに同等の結果を達成します。これにより、治療を求める患者が減り、医療資源をある程度節約することができます。近年、TEATは、内科、外用医学、皮膚科、顔の特徴、婦人科、小児科など、中国のさまざまな医療分野でますます使用されています3。研究によると、てんかん4 や顔面神経麻痺5など、特定の慢性疾患や複雑な疾患に対して長期的かつ信頼性の高い効果を発揮するのに効果的であることがわかっています。それに最低の外傷および簡単な操作の利点がある 6.さらに、TEAT の治療費は電気鍼治療 (EA) よりも低いと報告されています7。そのため、TEATは臨床研究や科学研究においてますます評価されています。

アルツハイマー病(AD)は、時間の経過とともに進行する神経変性疾患です。その病態生理学的過程は、臨床症状が現れる約20年前から蓄積し始めるが、そのメカニズムはまだ完全には解明されていない8。ADに有効な薬剤の入手可能性が限られていることを考えると、研究はますます疾患の前駆期および前臨床段階に焦点を当てています9。予防は、AD 9,10の発症と進行に対処するための重要な戦略です。近年、伝統的な中国医学(TCM)は大きな進歩を遂げており、AD11,12の予防と治療に新たな可能性を提供することが期待されています。鍼治療のサブタイプとして、TEAT は、その広い治療範囲、最小限の外傷、簡単な操作、低い治療頻度、および長期的な有効性により、他の治療法よりも好まれています6。新たな文献では、TEATは肥満13,14、糖尿病15、不眠症16、閉経後骨粗鬆症17、うつ病18の個人に利益をもたらす可能性があることが示唆されており、これらはすべてADの危険因子です。また、マイトファジー2を調節することにより老化ラットの老化を改善し、空間学習および記憶障害を改善し、海馬の病理学的損傷を緩和し、血管性認知症(VD)ラットの炎症応答を阻害する19。TEATがAD中の病理学的プロセスにも作用するかどうかを把握することは魅力的に見えました。

現在の研究では、埋め込み方法、埋め込みツール、スレッド、埋め込み間隔期間など、TEAT 操作のいくつかの重要な要素で統一性と標準化が欠けています。この標準化の欠如は、治療の効果の評価と関連するメカニズムの探求に影響を及ぼし、外部への昇進とコミュニケーションを制限します。先行研究20,21では、D-ガラクトース(D-gal)の腹腔内投与が、ニューロンの変性や認知障害を含むラットのアルツハイマー病のような病理学的変化を誘発する可能性があることが実証されています。さらに、白慧(GV20)と神舟(BL23)での電気鍼治療は、認知機能低下の改善、神経炎症の緩和、および神経細胞の損傷の軽減に効果的であることが示されています。本研究では、アルツハイマー病様モデルラットを例に、このモデルの下でのツボの選び方やTEATの手術過程や注意点について紹介します。実験研究におけるTEATの重要な運用要素について説明し、将来の研究の参考資料を提供します。

プロトコル

すべての実験は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドに従って実施され、湖北省疾病管理予防センターの実験動物管理および使用委員会によって承認されました。試験には、体重220〜250gの3か月齢の雌Sprague-Dawley(SD)ラット合計18匹を使用しました。すべてのラットは、23±1°C、湿度40%〜50%で12時間の明暗サイクルで維持され、餌と水に自由にアクセスできました。ラットが実験室の条件に慣れることを許された1週間の順応期間の後、実験が開始されました。

1. モデル開発

  1. 実験計画を 図1に示します。体重220〜250 gの生後3か月の雌ラット18匹を、対照群、モデル群、および乳頭群にランダムに分けます。各グループは6匹のラットで構成されています。
  2. モデル群とTEAT群にD-ガラクトース(D-gal;120 mg / kg /日)を毎日注射し、対照群は生理食塩水注射(120 mg / kg /日)を腹下部22に7週間(49日間)注入します。注射は毎日午前8:00から9:00の間に投与する必要があります。
  3. 毎週7日目の午前9:00から10:00の間にラットの体重を量ります。実験は49日間続きました。14日、28日、42日に14日ごとに糸を埋めます。各スレッドの埋め込み時間を午前 9:00 から 12:00 の間に固定します。
  4. ラットにアルツハイマー病関連の病理学的症状を誘発するために、D-ガラクトースの腹腔内投与を7週間続けてください22。

2. 乳頭の準備

  1. 眼科用ハサミ、トレー、ピンセットなどの手術器具を滅菌し、消毒します。手術室環境の表面を徹底的に清掃し、消毒します。
  2. 手術用プラットフォームを準備するには、小動物の加熱パッドを表面に平らに置き、滅菌タオルでドレープします。その後、清掃・消毒した操作ボードを、粗い面を上に向けてスムーズに上に置きます。次に、加熱パッドのスイッチを入れ、温度を32°Cに設定します。
  3. 施術には、直径0.6mmの6号使い捨て糸埋込針と、長さ2cmの5-0吸収性外科用縫合糸(コラーゲン縫合糸)を選択します。2cmの5-0吸収性外科用縫合糸を眼ハサミで0.5cmと0.2cmに切ります。カットした糸を0.9%生理食塩水に浸し、脇に置きます。
  4. 石鹸と水で20秒間手を洗い、その後乾かします。その後、滅菌手袋を着用してください。
  5. 腹側下部にクロラール水和物(300 mg/kg)をIP注射してラットに麻酔をかけ、つま先つま先つまみ試験による反応のなさに基づいて、手術面で動物が反応しない場合に麻酔を確認し、安定した生理状態を維持します。さらに、ラットが麻酔下にある間の角膜の乾燥や潜在的な損傷を防ぐために、動物用軟膏をたっぷりと目に塗布し、手順全体を通して目が潤滑されたままになるようにします。
    注:ネズミがピアスを経験するのは苦痛であるため、ラットに麻酔をかけることをお勧めします。

3. Baihui(GV 20)のスレッド埋め込み操作

  1. 頭頂骨の右中点にあるラットのツボBaihui(GV 20)を見つけます(図2A)。ラットを頭が完全に露出するように配置し、耳を前方に引っ張って、耳の頂点線を接続するために人間で使用される方法に近づけます。頭蓋骨の中央の縦方向の隆起を触診し、その位置をほぼその中間点に特定することにより、Baihui(GV 20)ポイントを特定します。このツボは、矢状縫合糸と頭頂骨の交点に合わせて、平らに置いた場合に耳が頭に接触するレベルでさらに確認します。マーカーを使用してBaihui(GV 20)をマークします。
  2. トリマー(通常は電動男性用ヒゲトリマー)を使用して、ラットのツボの周りの頭の領域を剃ります。
  3. 手術前に、0.5%ヨウ素溶液を中心から外側に向かって円を描くように塗布し、ツボと周囲の皮膚を消毒します。その後、3つの消毒プロセスを実行します:iodophor 3xを使用し、それぞれに続いてアルコールを塗布して、適切な除染を確保し、無菌技術のためのサイトを準備します。
  4. 鉗子を使用して、生理食塩水に浸した0.2cmの吸収性外科用縫合糸をクランプし、針管の前端に配置します。次に、針の芯に接続します。
  5. 片方の手で親指と人差し指で白輝(GV 20)の周りをつまみ、もう一方の手で針を持ちます。
  6. 針を白輝(GV 15)ポイントから0.1cm下、皮膚表面に対して20°の角度で水平かつすばやく挿入し、皮膚をつまみます(図3A)。
  7. 針先がBaihui(GV 20)ポイントから0.1 cm上に達したら、針管を引っ込めながら針のコアを押して、0.2 cmの吸収性外科用縫合糸をツボの皮下組織に完全に埋め込みます(図3B)。
  8. 縫合糸が露出していないことを確認しながら、針をゆっくりと取り外します。滅菌乾燥綿で針穴を10秒間押して、出血を防ぎます。ツボにラインを埋め込んだ後、糸が体外に出ている場合は、糸を抜いて再手術してください。

4. 神舟の糸埋め込み操作(BL 23)

  1. ラットのツボ神舟(BL 23)は、第2腰椎 の5mm外側に位置しています(図2B)。まず、ラットの股関節結節に基づいて6番目の 腰椎を見つけます。次に、上向きに4つの椎体を数えて、2番目の 腰椎を見つけます。神舟(BL 23)は、それに対して5 mm横になります23。
    注:白慧(GV 20)と神舟(BL 23)のツボの組み合わせは、脳障害の予防と治療のために伝統的な中国医学(TCM)理論で頻繁に利用されるセットです。以前の研究20,21で確認されたように、このツボの組み合わせはその有効性のために確立されています。
  2. マーカーを使用して神舟(BL 23)をマークします。ラットのツボの周りの背中と腰の部分をトリマー(通常は電気ひげトリマー)を使用して剃ります。
  3. 手術前に、0.5%ヨウ素溶液を中心から外側に向かって円を描くように塗布し、ツボと周囲の皮膚を消毒します。その後、3つの消毒プロセスを実行します:iodophorを3回使用し、それぞれにアルコールを塗布して、適切な除染と無菌技術のためのサイトの準備を確保します。
  4. 鉗子を使用して、生理食塩水に浸した0.5cmの吸収性外科用縫合糸をクランプし、針管の前端に配置します。次に、針の芯に接続します。
  5. 押す手の人差し指と中指、または親指と人差し指で皮膚を伸ばします。穴を開ける手で針を持ちます。
  6. 針を神舟(BL 23)の0.25cm下のポイントに垂直にすばやく挿入します。 図 4A を参照してください。
  7. 針先が皮膚下0.5cmに達したら、針先を調整し、挿入方向を求心性にして、皮膚表面と45°の角度を形成し、0.5cm斜めに挿入します(図4B)。
    注:腎臓の近くにある神舟(BL 23)に針を刺すときは注意が必要です。針を深く挿入したり、持ち上げたり突き上げたりすると、損傷を引き起こす可能性があります。そのため、挿入深さは0.3〜0.6cm程度をおすすめします。
  8. チューブを引っ込めながら針の芯を押し、0.5cmの吸収性外科用縫合糸をツボのツボの筋肉組織に完全に埋め込みます(図4C)。
  9. 縫合糸が露出しないように、針をゆっくりと引き出します。次に、滅菌乾燥綿で針穴を10秒間押して出血を防ぎます。ツボにラインを埋め込んだ後、糸が体外に出ている場合は、糸を抜いて再手術してください。

5. 術後のケア

  1. 術後、麻酔からの回復を容易にするために、32°Cの温度に設定された小動物用加温パッドにラットを置きます。動物を飼育箱に戻す前に、動物が完全に意識があり、その状態が満足のいくものであることを確認してください。
  2. 手術後、1週間以内に患部で無菌性炎症反応の兆候を観察します。これらの徴候には、発赤、腫れ、または膿のような分泌物が含まれる場合があります。通常、これらの症状は治療を必要としません。ただし、滲出液が過剰にある場合は、患部を排出して消毒してください。このような場合は、創傷が完全に回復するまでエリスロマイシン軟膏を塗布してください。

6. 行動検査と組織学的検査

  1. 介入後、8 週目にモリス ウォーター メイズ (MWM) 実験 2,24 を実行して、学習能力と記憶能力を評価します。学習トライアルを 5 日間にわたって実施し、1 日 4 回のトライアルを行います。その後、最後の取得日から24時間後にプローブトライアルを実施します。
  2. 統計解析ソフトウェアを使用して統計比較を実行します。一元配置分散分析(ANOVA)と事後テューキー検定により、学習能力の行動データを分析します。二元配置反復測定分散分析 (ANOVA) とそれに続く事後 Bonferroni 検定により、エスケープ遅延データの有意性を評価します。p <0.05の値は、すべてのテストで有意と見なされます。
  3. 行動評価後、上記のようにラットに麻酔をかけ、150 mg / kg体重のペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射で安楽死させます。.
  4. 血管系を介して灌流された4%パラホルムアルデヒドを使用して、灌流によってラットの脳を固定します25。
    1. 強制針の挿入と固定
      1. 12Gの針を準備し、まっすぐでラットの心室を通過するのに適していることを確認します。ラットの心室(通常は左心室)を特定し、それを通して針を上行大動脈に挿入します。この手順には、精度とラットの解剖学的構造に関する十分な理解が必要です。
      2. 針が所定の位置に配置されたら、止血剤を使用して、大動脈に入るポイントの近くに強制針を固定します。これにより、針を固定し、針が動かないようにすることができます。
      3. クランプが針をしっかりと保持するのに十分なほど締まっていることを確認しますが、大動脈を損傷したり血流を妨げたりするほどきつくはありません。強制針は、適切な灌流を維持するために、手順全体を通して上行大動脈に留まる必要があります。.
    2. 生理食塩水による灌流
      1. 灌流用の針なしの50ccシリンジを準備します。ラットの体外にある強制針のもう一方の端を、通常の生理食塩水で満たされた注射器に取り付けます。
      2. 心臓から血液が流れ出るように、右心房付属器を切るために小さな切開を行います。このステップにより、灌流中に血液が生理食塩水によって置換されます。
      3. 正常な生理食塩水を上行大動脈に着実かつ一定の速度で注入し始めます。これにより、血液が洗い流され、組織を固定するための準備が整います。
      4. 右心房付属器から出てくる液体を監視し、必要に応じてシリンジを交換して新鮮な生理食塩水との連続灌流を維持する準備をしてください。
        置き、固定剤で灌流する準備をします。
      5. 生理食塩水を含むシリンジを、組織学で一般的に使用される固定剤である4%パラホルムアルデヒドを含むシリンジと交換します。パラホルムアルデヒドを使用して灌流を進め、その後の処理と分析のために組織を所定の位置に固定します。
        注:この手順全体を通して、感染を防ぐために無菌技術を維持し、怪我を最小限に抑えるためにラットを優しく扱うことが重要です。さらに、一貫性と有効性を確保するために、関係するすべての人員が技術の訓練を受ける必要があります。
  5. ラットの脳を取り出し、4%パラホルムアルデヒドを含む標本ボトルに4°C25,26で24〜48時間入れます。エタノール脱水とキシレン処理を段階的に行い、その後、従来の連続冠状切片(4〜5μm)で測定します。ヘマトキシリンとエオシン (H&E) 染色 (200x) を使用して、各グループの海馬ニューロンの形態と喪失を評価します。
    注:胃腸(GI)病変を評価するための剖検検査は、実験期間を通じてGI障害を示す臨床徴候がないことに基づいてげっ歯類に対して実施されませんでした。.動物は、そのような病状の存在を示唆する明白な副作用を示さなかった。

結果

本稿では、アルツハイマー型認知症様ラットにおけるTEATの具体的な手術方法について紹介します。実験研究におけるTEATの重要な運用要素について説明し、将来の研究の参考資料を提供します。

乳首はアルツハイマー病様ラットの学習を改善します
フローチャート(図5)に示すように、適応訓練期間中、各グループのラットが遊泳中に...

ディスカッション

介入時間
ADの病因は複雑であり、その病因は依然として不明です。現在、この病気に対する効果的な治療法はなく、その経過は不可逆的です。したがって、学界は、ADの予防と治療に焦点を当てることの重要性についてコンセンサスに達しました。ADの予防および治療戦略は、状態が発生する前に治療するというTCMの概念に従って、早期介入を強調し、発症、感染、および再発?...

開示事項

著者は、開示することは何もないと宣言します。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学基金会(NSFC)第82374564号(YJDへ)およびNo.82074566(YJDへ)、および中国武漢の世界鍼灸学会連盟のTCM鍼灸のための孫国傑継承基地(世界鍼灸学会連盟[2019]第26号)(YJDへ)、および国家伝統中国医学管理局の全国有名TCM継承スタジオ建設プロジェクトからの資金提供を受けました。 中国(国家中医薬管理局[2022]第5号)(YJDへ)。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% saline, 4% paraformaldehyde, Hematoxylin, Eosin Y (water-soluble), absolute ethanol, 0.01M PBS powder, xylene, hydrochloric acid, embedded paraffin, neutral gumsinopharm (www.sinopharm.com)
5-0 absorbable surgical suturebodamedical (www.bodamedical.com)
70% alcohol, iodophor, cotton ballUsed for disinfection.
chloral hydratesigmaC8383
coverslips, glass slidesGuangzhou Wuqiang Experimental Equipment Co., Ltd
DehydratorWuhan Junjie JT-12J Computerized Biological Tissue Dehydrator
DELUXE THERMOSTAT HEAT MATZhenhua InstrumentsFor maintaining the body temperature of rats.
D-galactosesigmaG0750
electric men's beard trimmerUsed for shaving rats.
Electronic scale for small animals (ZK-DST)Henan Zhike Information Technology Co., Ltd
erythromycin ointmentfrontpharm
glass dishUsed to place cut absorbable sutures.
High-Pressure Steam Sterilization Pot (YM100Z)Shanghai Sanshen medical equipment factoryFor sterilization of surgical instruments.
Ice Maker (CMB40)Shanghai Sheyan Instrument Co., Ltd.
Microscope (BX-53)OLYMPUS
milk powderUsed for the MWM test.
Morris Water Maze Video Tracking System & Data Analysis Software (Version: Watermaze 2.0)Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd
No.6 thread-embedding needlebodamedical (www.bodamedical.com)
ophthalmic scissors, trays, tweezers
Pathology Microtome  (RM 2016)LEICA, Germany
pentobarbitalGermanyP11011
permanent markerUsed to mark the acupoint.
Slicing knives (R35)Feathers, Japanese
soapUsed to wash hands.
sterile gloves

参考文献

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