量化肿瘤球状体模型中抗体依赖性细胞毒性:药物发现应用

摘要

在这里，我们提出了一种鉴定调节ADCC机制的化合物的方法，ADCC机制是抗肿瘤抗体的重要癌细胞杀伤机制。在曲妥珠单抗存在下，在乳腺癌细胞球状体中测量NK细胞的细胞毒性作用。图像分析可识别球状体中的活细胞和死细胞、杀伤细胞和靶细胞。

摘要

基于单克隆抗体的针对肿瘤抗原的免疫疗法现在是癌症治疗的支柱。抗体的临床相关作用机制之一是抗体依赖性细胞毒性 （ADCC），其中抗体与癌细胞结合并与免疫系统的细胞成分（例如自然杀伤 （NK） 细胞）结合以杀死肿瘤细胞。通过识别增加癌细胞敏感性或免疫细胞效力的辅助化合物，可以提高这些疗法的有效性。此外，在因既往疾病或癌症相关症状而联合用药的癌症患者中未发现的药物相互作用可能决定抗体治疗的成功;因此，需要消除这种不需要的药物相互作用。考虑到这些目标，我们创建了一个癌症ADCC模型，并在此描述了一种寻找ADCC调节药物的简单方案。由于癌细胞球体等 3D 模型在预测肿瘤对抗癌治疗 的体内 反应方面优于 2D 培养物，因此表达 EGFP 的 HER2+ JIMT-1 乳腺癌细胞和 NK92 的球状体共培养物。CD16 细胞系的建立和诱导曲妥珠单抗是一种临床批准的针对 HER2 阳性乳腺癌的单克隆抗体。允许JIMT-1球状体在细胞排斥U底96孔板中形成。第3天，加入NK细胞和曲妥珠单抗。然后用膜联蛋白 V-Alexa 647 对球状体进行染色以测量凋亡细胞死亡，并用自动显微镜在球状体的外围区域进行定量。我们的检测方法在鉴定ADCC调节分子方面的适用性得到了证明，表明舒尼替尼（一种经FDA批准的针对转移性癌症的受体酪氨酸激酶抑制剂）几乎完全消除了ADCC。球状体的生成以及图像采集和分析管道与癌细胞球体中ADCC调节化合物的高通量筛选兼容。

引言

多细胞肿瘤球状体 （MCTS） 是广泛使用的三维 （3D） 模型，由于贴壁细胞聚集的趋势而形成，是获得癌细胞生物学机制洞察的重要工具。它们可以通过多种技术从多种细胞类型中生成，例如基于液体和基于支架的 3D 培养^{物 1}。与单层 2D 模型相比，它们的主要优势在于它们通过模拟肿瘤细胞的生物学行为，特别是导致治疗逃逸和耐药性的机制，概括了 体内 肿瘤的主要特征，即结构组织和缺氧²。因此，由于MCTS可以提高毒性和药物敏感性的可预测性，因此它们被广泛用于3D癌症研究，并可以促进针对不同类型癌症的有效药物^的开发3。

为了研究任何疾病，迫切需要相关且方便的模型。建立癌症免疫学研究模型具有挑战性，因为免疫系统由多种细胞类型组成。每种细胞类型都有几种亚型和广泛的激活状态。这些不同的免疫细胞类型与癌细胞和其他肿瘤成分相互作用，最终影响疾病的结果。2D 体外细胞培养方法无法概括这些复杂的细胞相互作用，因为它们缺乏可翻译性，并且无法在系统水平（例如，在组织^中）预测药物的作用^4,5。此外，由于人类和小鼠免疫系统之间的根本差异，小鼠模型也具有严重的局限性。因此，3D 培养系统可以填补当前可用模型的空白，提供一种替代方法并提高我们对癌症免疫学的理解⁶。具体而言，球状体模型可用于测试免疫疗法，主要用于评估药物筛选和治疗性抗体的效率，以增强免疫细胞浸润和对球状体靶标的抗肿瘤作用⁷。此外，由处于不同代谢和增殖状态的细胞组成的 MCTS 在研究基质细胞（例如淋巴细胞、巨噬细胞、成纤维细胞）和癌细胞之间的相互作用以及开发新的抗癌策略方面的潜力已得到充分证明⁸。因此，考虑到肿瘤微环境的病理生理学，迫切需要证实预测性和准确的平台，以促进药物测试过程。

乳腺癌 （BC） 是全球女性中最常见的癌症。这种异质性疾病的临床分类基于跨膜受体的存在，例如雌激素 （ER） 和孕激素 （PR） 受体（统称为激素受体 HR）以及人表皮生长因子受体 2 （HER2） 蛋白/癌基因的过表达或扩增。根据这些受体的免疫组织化学表达，通常可识别四种亚型:管腔 A （HR+/HER2-）、管腔 B （HR+/HER2+）、HER2 阳性 （HR-/HER2+） 和三阴性乳腺癌 （HR-/HER2-）。HER2+ 组占 BC 病例的 10-15%，其特征是 HER2 高表达，无 ER 和 PR，与管腔肿瘤相比预后更差，需要针对 HER2/neu 蛋白的特异性药物⁹。

BC的发展是一个多步骤的过程，早期诊断对于成功治疗该疾病至关重要¹⁰。然而，尽管最近出现了个性化的 BC 治疗方案（例如内分泌和抗 HER2 抗体疗法），但 BC 继续挑战肿瘤学家。就像手术、化疗和放疗一样，这些个性化治疗也可能产生严重的不良反应，患者可能会对这些药物产生耐药性，这使得确定最佳策略成为一项长期挑战^11,12。因此，提高对肿瘤与其微环境之间相互作用的理解至关重要，并有望为新疗法的开发提供新的方向，这些治疗方法考虑到不同 BC 亚型¹³ 的特异性。新一波免疫疗法，如抗体药物偶联物、过继性 T 细胞疗法、疫苗和新型 HER2 定向单克隆抗体 （mAb），正在广泛的 HER2 表达肿瘤患者群体中进行研究¹⁴。

例如，曲妥珠单抗代表了 HER2+ BC 的有效治疗方式。作为其作用方式的一部分，曲妥珠单抗介导片段可结晶γ受体（FcγR）依赖性活性。FcγR的特点是它们对Fc片段的亲和力以及它们引发的免疫反应。激活自然杀伤 （NK） 细胞上的 FcγRIIIa （CD16A） 对于介导抗体依赖性细胞毒性 （ADCC） 至关重要，而在巨噬细胞上触发 FcγRIIa （CD32A） 和 FcγRIIIa 可诱导抗体依赖性细胞吞噬作用 （ADCP）¹⁵。对动物模型的研究表明，缺乏 FcγRI （CD64） 和 FcγRIII （CD16） 受体的小鼠无法启动针对肿瘤特异性抗原的保护性免疫反应，这表明 ADCC 可能是 mAb Trastuzumab¹⁶ 的主要作用机制。

由于NK细胞诉诸肿瘤细胞结合的抗体通过ADCC杀死癌细胞，因此Fc受体的表达对于曲妥珠单抗¹⁷ 的有效治疗至关重要（图1）。此外，它们的作用通过刺激激活和抑制受体（例如杀伤细胞免疫球蛋白样（KIR）受体¹⁸）而有效平衡。

图 1.ADCC在抗肿瘤反应背景下的机制。 自然杀伤 （NK） 细胞的 Fcγ 受体可识别抗体的 Fc 区域，该抗体先前已与癌细胞上的表面抗原结合。这种免疫突触导致NK细胞脱颗粒，释放细胞毒性介质，如颗粒酶和穿孔素。这些分子有助于细胞膜中的孔形成并激活凋亡途径，导致靶细胞的程序性细胞死亡（用 Biorender.com 创建的图像）。 请点击这里查看此图的较大版本.

HER2+ BC的免疫疗法开发是一个不断发展的领域。在这种情况下，应该考虑免疫系统各个组成部分之间的相互作用。此外，先前的出版物已经广泛测试了涉及所有类型的传统、免疫或细胞疗法的联合疗法，以确定协同组合¹⁹。

HER2+ BC的几个3D模型以前已被用于药物发现。例如，Balalaeva 等人使用过表达 HER2 的 SKBR-3 球体来评估 HER2 靶向免疫毒素 4D5scFv-PE40^{20 的}细胞毒性。在另一项研究中，建立了基于 3D 基质的 HER2+ BC 培养系统来测量响应曲妥珠单抗和内分泌药物的细胞生长²¹。这些研究强调了 HER2 过表达癌细胞的肿瘤球状体模型在代表临床改善治疗反应的有效策略方面的重要性²²。

我们小组先前在 2D 培养试验中鉴定了 Sunitinib（一种多靶点酪氨酸激酶抑制剂）作为 JIMT-1 HER2+ BC 细胞中曲妥珠单抗依赖性 ADCC 的抑制剂。研究表明，舒尼替尼诱导自噬并损害NK细胞杀伤功能，下调HER2表达并增强JIMT-1细胞的表面附着¹⁷。

在这里，我们建立了一个新型的3D球状ADCC模型（NK.92.CD16+曲妥珠单抗+JIMT-1-EGFP癌细胞），用于高通量筛选应用，为了验证上述发现，使用舒尼替尼作为模型化合物。首先，我们生成了表达 JIMT-1 细胞的 EGFP¹⁷ ，并从这些细胞中生长出球状体。ADCC由NK细胞与曲妥珠单抗一起诱导，球状体在存在或不存在测试化合物的情况下在培养物中保存24小时（图2）。ADCC的定量基于使用高内涵分析系统检测凋亡癌细胞死亡（膜联蛋白V染色）。

图2.3D 球状体共培养系统中的 ADCC。 我们的实验设置基于3D球体系统，与2D模型相比，该系统可以更准确地模拟 体内 微环境。将JIMT-1 EGFP乳腺癌细胞接种在凹形细胞驱避剂底部，形成圆形细胞簇，称为球状体。然后通过添加NK92启动ADCC。CD16 自然杀伤细胞 （E:T 比 = 20:1） 和抗 HER2 单克隆抗体曲妥珠单抗。该实验模型已被证明是有效的，并且易于用于鉴定ADCC修饰测试化合物（使用 Biorender.com 创建的图像）。 请点击这里查看此图的较大版本.

我们证明，以这种方式获取数据可以实时完成，并且在统计学上适用于癌症药物发现中的高内涵筛选。重要的是，该模型允许对更多的化合物进行扩展验证，并且可以应用于多种感兴趣的测定。

研究方案

1. 建立JIMT-1增强荧光蛋白（EGFP）球状体模型

1. 为了形成U形细胞驱避剂底部，用0.5%琼脂糖-PBS溶液（30μL/孔）涂覆96孔板。将板在室温下孵育约30-45分钟。
2. 用 2 mL 无菌 PBS 洗涤 JIMT-1-EGFP 细胞两次（JIMT1-EGFP 细胞系的产生在之前的出版物^{中报道 17}）。使用 T25 组织培养瓶和 JIMT-1 培养基（补充有 20% 胎牛血清 （FBS）、0.3 U/mL 胰岛素（100 IU/mL，Humulin R）和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM/F-12 培养基）进行细胞培养。
3. 将 2 mL 胰蛋白酶-EDTA 加入烧瓶中，并在 CO₂ 培养箱中孵育 10 分钟。
4. 轻敲烧瓶以检查 JIMT-1 细胞是否在孵育时间后分离。
5. 使用 2 mL JIMT-1 培养基停止消化并将细胞悬液收集到 15 mL 试管中。
6. 在含有 0.4% 台盼蓝（80 μL 染料 + 20 μL 细胞悬液）的 Bürker 室中计数细胞，并将细胞数调整至 20,000 个细胞/mL。
7. 将 100 μL 细胞悬液（2000 个细胞/孔）移液到 96 孔板的每个孔中（预涂有 0.5% 琼脂糖-PBS 溶液，如 1.1 所示）。
8. 在CO₂ 培养箱中，在37°C的3天孵育期间，让细胞聚集在一起。
9. 定期用倒置显微镜检查球状体的大小和形状。

2.HCS板的涂层

注意:为了防止JIMT-1-EGFP球体附着在板的玻璃表面，涂覆高内涵筛选（HCS）板至关重要（否则将无法进行高内涵分析）。

1. 在诱导球状体后的第 3 天，用 Pluronic-F127（DMSO 溶液为 0.5%，50 μL/孔）涂覆 96 孔高内涵筛选板，并在室温下孵育板 45 分钟。
2. 吸出包衣溶液，并用DMEM/F-12-无血清培养基（100μL/孔）洗涤孔两次。

3. 将球体转移到 HCS 板上

1. 使用 1 mL 移液管，将球体一式三份转移到玻璃底 96 孔 HCS 板中。

4. JIMT-1 EGFP球体的预处理

1. 通过移液 10 μL/孔加入测试化合物（例如，在 DMSO 中以 40 μM 的浓度稀释的舒尼替尼），并向对照 （CTL） 孔中加入 10 μL 新鲜 JIMT-1 培养基。
2. 将板在37°C的CO₂ 培养箱中孵育1小时。

5. 通过添加效应细胞诱导ADCC

注:CD16.176V.NK92细胞（以下简称NK细胞）在补充有20%FBS、1%MEM-NEAA、1%Na-丙酮酸、1%谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素和100IU/mL IL-2的α-MEM中培养。

1. 将烧瓶中的NK细胞收集到15 mL管中。用台盼蓝（80 μL 染料 + 20 μL 细胞悬液）计数细胞，并将细胞密度调节至 20:1 效应子与靶标 （E:T） 比（40,000 个 NK 细胞/孔）。
2. 用10μM Cell Tracker Blue（CTB，1μL在1mL α-MEM NK培养基中）染色NK细胞，并将其置于37°C的CO₂ 培养箱中1小时。
3. 在室温下以150× g 离心NK细胞3分钟两次，用1mL α-MEM培养基洗涤多余的染料。
4. 将 NK 细胞沉淀重悬于 1 mL 新鲜 JIMT-1 培养基中。
5. 通过在JIMT-1培养基中移液55μL/孔CTB染色的NK细胞和55μL/孔的10μg/mL抗体，将染色的NK细胞与抗HER2抗体（Ab）（曲妥珠单抗，溶解在无菌蒸馏H_2O中）添加到目标JIMT-1球体中（ADCC添加的处理总体积为110μL/孔，最终舒尼替尼浓度为20μM）。
   注:对于抗体浓度和E:T比的选择，我们依赖于我们之前的出版物¹⁷。使用不同的 E:T 比率和曲妥珠单抗浓度进行初步实验，以评估哪种在球状体中诱导 ADCC 最有效（补充图 S1）。
6. 向对照 （CTL） 孔中加入 110 μL/孔新鲜 JIMT-1 培养基。
7. 将板在37°C的CO₂ 培养箱中孵育24小时。
   注意:由于已知 NK92 细胞发挥非特异性细胞毒性功能，因此对于对照，使用与 NK 细胞单独和同型对照或 F（ab'_）2 Ab 共同孵育的 JIMT-1 细胞。这里，F（ab'）₂-曲妥珠单抗（TR-F（ab'）₂）被用作阴性CTL。按照 Tóth 等人 ¹⁹ 的报道制备 TR-F（ab'）₂ 片段，并以与曲妥珠单抗相同的体积与 NK 细胞一起加入，如 5.5 所示。将浓度调整至 6.6 μg/mL，对应于曲妥珠单抗²³ 的等摩尔浓度。

6. 球状体的膜联蛋白 V-647 染色

1. 为了测量凋亡细胞死亡，通过移液 50 μL/孔，用 Annexin V-Alexa Fluor 647 偶联物在 JIMT-1 培养基 （1:100） 中对球状体进行染色 1 小时。

7. 成像

注意:在将NK效应细胞添加到靶细胞后24小时对板进行成像。对于成像，使用高内涵分析仪和图像分析软件。

1. 使用 "孔板类型 "选项从孔板列表中选择微孔板类型。使用 96 孔高内涵筛选 （HCS） 板。
2. 选择双峰自动对焦，因为分析是在具有 10 倍物镜和 0.3 数值孔径 （NA） 的板中进行的，分别使用 自动对焦 和 物镜 选项。使用 "选项 模式"选项选择共聚焦模式，然后使用 "像素合并 "选项应用像素合并 2。
3. 对于成像球体，请使用" 通道选择 "选项选择适当的通道。要检测EGFP转导的JIMT-1细胞，请选择EGFP（积分时间200 ms，激光功率50%，堆叠高度2.0 μm;例如:488 nm em:500-550 nm），要检测凋亡细胞，请使用Alexa 647（积分时间100 ms，激光功率50%，堆叠高度10.0 μm;例如:640 nm em:650-760 nm）。要可视化球状体内的NK细胞，请选择以下通道:DAPI（积分时间100 ms，激光功率50%，堆叠高度2.0 μm;例如:405 nm em:435-480 nm）。
4. 在 "布局选择 "选项中，选择 Z 轴堆栈，因为球体中的细胞往往位于显微镜的不同焦平面上。10 个平面（距离为 10 μm）足以覆盖整个椭球体区域。将第一个平面和最后一个平面的值分别设置为 0 μm 和 90 μm。
   注意: 在开始测量之前，可以使用快照功能拍摄样本图像，以检查正确的设置。
5. 使用 "定义布局"（Define Layout ） 选项设置成像的孔数和场数。

8. 高内涵分析（HCA）

注意:使用 Harmony 软件分析图像或导出图像以使用首选的第三方软件进行分析。为了分析ADCC效率，测量膜联蛋白V 647的荧光强度。被ADCC杀死的靶细胞出现在球状体的外围区域。因此，在这个球状体"环"中测量膜联蛋白V阳性细胞。为了验证这种方法，使用不同的参数进行了分析，以评估哪种参数最可靠并产生最佳结果（补充图S2）。视频中显示了一个ADCC孔，以便逐步演示图像分析过程。

1. 使用"查找纹理区域"选项通过JIMT-1细胞的EGFP荧光识别球状体，并按大小（>25,000μm2）过滤掉它们。
2. 通过 "选择填充 "选项删除边框对象。
3. 由于膜联蛋白 V 阳性（凋亡）细胞出现在球状体的外围，因此测量该凋亡"环"中的膜联蛋白强度，由 "选择区域 "选项（外边界 -90%）选择以确定凋亡细胞死亡。
4. 将膜联蛋白 V 强度值表示为平均强度。

结果

生成表达 JIMT-1 的 EGFP 细胞，并从这些细胞中生长出球状体。舒尼替尼被用作测试化合物，因为它先前被证明会影响ADCC¹⁷的疗程。允许球状体结块72小时。在第 3 天，在存在或不存在 20 μM 舒尼替尼（1 小时预处理）的情况下，将 10 μg/mL 曲妥珠单抗（或等摩尔 6.6 μg/mL TR-F（ab'）₂¹⁹）和 NK 细胞 （20:1） 加入球状体中，总时间为 24 小时。 单独使用 JIMT-1 和 ...

讨论

尽管在过去几十年中，BC的治疗有了显着改善，但患者仍然经常出现耐药性或出现负面副作用²⁴。与 BC 相关的高发病率和死亡率要求继续研究潜在的分子机制，就像强大的筛选平台以确定可用于治疗开发的新分子^{一样 25}.这些策略需要基于细胞培养的转化检测。3D肿瘤培养系统，如球状体和肿瘤类器官，最近已成为低成本、易于实施的模型，与传统的单层培养相?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well glass bottom Cell Carrier Ultra microplates	PerkinElmer, Waltham, MA, USA	LLC 6055302	for spheroids measurements
96-well tissue culture plates	TPP	92096	for cell seeding
α-MEM medium	Sigma	M8042	in NK medium
Agarose	Sigma	A9539	for spheroids seeding
Annexin V-Alexa Fluo 647 conjugate	Invitrogen-ThermoFisher Scientific	A23204	for apoptosis measurement with HCS
CD16.176 V.NK-92 cells	Dr. Kerry S. Campbell (the Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA on behalf of Brink Biologics, Inc. San Diego, CA)	ATCC CRL-2407	for cell culture
Cell Tracker Blue	Invitrogen-Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)	C2110	for staining of NK cells
DMEM/F-12 medium	Sigma	D8437	in JIMT1-EGFP medium
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418	for coating HCS plate before transfering the spheroids
Fetal bovine serum (FBS)	Biosera	FB-1090/500	JIMT-1-EGFP and NK medium
Glutamine	Gibco	35,050–061	in NK medium
GraphPad Prism 8.0.1	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA		for statistical analysis
Harmony software	PerkinElmer, Waltham, MA, USA		for HCA
IL-2	Proleukin, Novartis Hungária Kft., Budapest, Hungary	PHC0026	in NK medium
Insulin (Humulin R)	Eli Lilly	HI0219	JIMT-1-EGFP medium
JIMT-1 breast cancer cells			for cell culture
MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA)	Gibco	11,140–050	in NK medium
Na-pyruvate	Lonza	BE13-115E	in NK medium
Opera Phenix High-Content Analysis equipment	PerkinElmer, Waltham, MA, USA	HH14001000	for HCA
PBS (Posphate buffered saline)	Lonza	BE17-517Q	for washing the cells
Penicillin-Streptomycin	Biosera	LM-A4118	JIMT-1-EGFP and NK medium
pLP-1, pLP-2, pLP-VSV-G, pWOXEGFP	Invitrogen, (Prof. József Tzsér, University of Debrecen)		for JIMT-1-EGFP cell line
Pluronic-F127	Sigma	P2443	for coating HCS plate before transfering the spheroids
Sunitinib malate	SigmaAldrich	PZ0012	for treatments
Trastuzumab Ab (humanized anti-HER2 monoclonal antibody)	Herzuma®, EGIS Pharmaceuticals, Budapest, Hungary	NDC-63459-303-43	for treatments
Trastuzumab-F(ab')2	Gift from Prof. György Vereb and Árpád Ször	Department of Biophysics and Cell Biology, University of Debrecen	for treatments
Trypan blue 0.4% solution	Sigma	T8154	for cell counting
Trypsin-EDTA 1X in PBS	Biosera	LM-T1706	for cells detachment