Quantificação da Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos em Modelo Esferoide Tumoral: Aplicação para Descoberta de Fármacos

Resumo

Aqui, apresentamos um método para identificar compostos que modulam o mecanismo ADCC, um importante mecanismo de morte de células cancerígenas de anticorpos antitumorais. O efeito citotóxico das células NK é medido em esferoides de células de câncer de mama na presença de trastuzumabe. A análise de imagens identifica células assassinas e alvo vivas e mortas em esferoides.

Resumo

A imunoterapia baseada em anticorpos monoclonais direcionada a antígenos tumorais é agora um pilar do tratamento do câncer. Um dos mecanismos clinicamente relevantes de ação dos anticorpos é a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), em que o anticorpo se liga às células cancerosas e engaja o componente celular do sistema imunológico, por exemplo, células natural killer (NK), para matar as células tumorais. A eficácia dessas terapias poderia ser melhorada pela identificação de compostos adjuvantes que aumentam a sensibilidade das células cancerosas ou a potência das células imunes. Além disso, interações medicamentosas não descobertas em pacientes com câncer comedicados para condições prévias ou sintomas associados ao câncer podem determinar o sucesso da terapia com anticorpos; portanto, tais interações medicamentosas indesejadas precisam ser eliminadas. Com esses objetivos em mente, criamos um modelo de ADCC para câncer e descrevemos aqui um protocolo simples para encontrar drogas moduladoras do ADCC. Uma vez que modelos 3D, como esferoides de células cancerosas, são superiores a culturas 2D na previsão de respostas in vivo de tumores a terapias anticâncer, co-culturas esferoides de células de câncer de mama HER2+ JIMT-1 que expressam EGFP e NK92. Linhagens celulares CD16 foram montadas e induzidas com trastuzumabe, um anticorpo monoclonal clinicamente aprovado contra o câncer de mama HER2-positivo. Esferoides JIMT-1 foram deixados formar em placas de 96 poços repelentes de células com fundo U. No dia 3, células NK e trastuzumabe foram adicionados. Os esferoides foram então corados com Annexin V-Alexa 647 para medir a morte celular apoptótica, que foi quantificada na zona periférica dos esferoides com um microscópio automatizado. A aplicabilidade de nosso ensaio para identificar moléculas moduladoras do ADCC é demonstrada mostrando que o Sunitinibe, um inibidor da tirosina quinase do receptor aprovado pelo FDA contra câncer metastático, abole quase completamente o ADCC. A geração dos esferoides e os pipelines de aquisição e análise de imagens são compatíveis com a triagem de alto rendimento para compostos moduladores de ADCC em esferoides de células cancerosas.

Introdução

Os esferoides tumorais multicelulares (STCM) são modelos tridimensionais (3D) amplamente utilizados que se formam devido à tendência das células aderentes em se agregarem e representam uma importante ferramenta para obter informações mecanicistas sobre a biologia das células cancerosas. Eles podem ser gerados a partir de uma ampla gama de tipos celulares por inúmeras técnicas, tais como culturas 3D baseadas em líquido e andaimes¹. Sua principal vantagem sobre os modelos 2D monocamada é que eles recapitulam as principais características dos tumores in vivo , ou seja, a organização estrutural e a hipóxia, mimetizando o comportamento biológico das células tumorais, especialmente os mecanismos que levam ao escape terapêutico e à resistência a^drogas2. Assim, uma vez que os TCM podem melhorar a previsibilidade da toxicidade e sensibilidade a drogas, eles são amplamente utilizados para estudar cânceres em 3D e poderiam melhorar o desenvolvimento de drogas eficazes para diferentes tipos de^câncer3.

Para estudar qualquer doença, há uma necessidade crítica de modelos relevantes e convenientes. A criação de modelos para estudos de imunologia do câncer é um desafio porque o sistema imunológico consiste em vários tipos celulares. Cada tipo de célula tem vários subtipos e um amplo espectro de estados de ativação. Esses diferentes tipos de células imunes interagem com células cancerosas e outros componentes tumorais, influenciando o resultado da doença. Os métodos de cultura de células in vitro 2D falham em recapitular essas interações celulares complexas, pois não têm traduzibilidade e são incapazes de prever a ação de um fármaco no nível do sistema (por exemplo, em tecidos)^4,5. Além disso, os modelos de camundongos também têm limitações severas devido às diferenças fundamentais entre os sistemas imunológico humano e murino. Sistemas de cultura 3D podem, portanto, preencher as lacunas atuais nos modelos disponíveis, fornecendo um método alternativo e melhorando nossa compreensão da imunologia do câncer⁶. Especificamente, modelos esferoides podem ser usados para testar imunoterapias, principalmente para avaliar a eficiência da triagem de drogas e anticorpos terapêuticos para aumentar a infiltração de células imunes e efeitos antitumorais contra os alvos esferoides⁷. Além disso, o potencial dos TCMS compostos por células em diferentes estados metabólicos e proliferativos para estudar as interações entre células do estroma (por exemplo, linfócitos, macrófagos, fibroblastos) e células cancerosas e para o desenvolvimento de novas estratégias anticâncer tem sido amplamente^demonstrado8. Assim, há uma necessidade vital de corroborar plataformas preditivas e precisas para impulsionar o processo de teste de drogas, levando em consideração a fisiopatologia do microambiente tumoral.

O câncer de mama (CB) é o câncer mais frequente diagnosticado em mulheres no mundo. A classificação clínica dessa doença heterogênea baseia-se na presença de receptores transmembrana, por exemplo, receptores de estrogênio (RE) e progesterona (RP) (coletivamente chamados de receptores hormonais, HR), juntamente com a superexpressão ou amplificação da proteína/oncogene receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2). Com base na expressão imunoistoquímica desses receptores, quatro subtipos são comumente reconhecidos: luminal A (HR+/HER2-), luminal B (HR+/HER2+), HER2-positivo (HR-/HER2+) e triplo-negativo câncer de mama (HR-/HER2-). O grupo HER2+ constitui 10-15% dos casos de CB e é caracterizado por alta expressão de HER2 com ausência de RE e RP, tendo pior prognóstico em relação aos tumores luminais e necessitando de drogas específicas direcionadas contra^{a proteína} HER2/neu9.

O desenvolvimento de CB é um processo de várias etapas, sendo o diagnóstico precoce essencial para o sucesso do tratamento da doença¹⁰. No entanto, apesar das opções personalizadas de tratamento do BC recentemente surgidas (por exemplo, terapias endócrinas e de anticorpos anti-HER2), o CB continua a desafiar os oncologistas. Assim como a cirurgia, a quimioterapia e a radioterapia, essas terapias personalizadas também podem ter efeitos adversos graves e os pacientes podem desenvolver resistência a esses agentes, tornando-se um desafio a longo prazo determinar a melhor estratégia^11,12. Assim, uma melhor compreensão da interação entre o tumor e seu microambiente é essencial e espera-se que forneça novas direções para o desenvolvimento de novos tratamentos que levem em conta as especificidades dos diferentes subtipos de CB¹³. Uma nova onda de imunoterapias, tais como conjugados de drogas de anticorpos, terapias adotivas de células T, vacinas e novos anticorpos monoclonais direcionados a HER2 (mAbs) estão sendo estudados em uma ampla população de pacientes com tumores que expressam HER2¹⁴.

O trastuzumabe, por exemplo, representa uma modalidade de tratamento eficiente para HER2+ CB. Como parte de seu modo de ação, o trastuzumabe medeia atividades dependentes do receptor gama cristalizável de fragmentos (FcγR). Os FcγRs distinguem-se pela sua afinidade pelo fragmento Fc e pela resposta imune que iniciam. A ativação do FcγRIIIa (CD16A) em células natural killer (NK) é crucial para mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), enquanto o desencadeamento de FcγRIIa (CD32A) e FcγRIIIa em macrófagos induz fagocitose celular dependente de anticorpos (ADCP)¹⁵. Estudos em modelos animais mostraram que camundongos sem receptores FcγRI (CD64) e FcγRIII (CD16) foram incapazes de iniciar respostas imunes protetoras contra antígenos tumor-específicos, revelando que o ADCC é provavelmente um importante mecanismo de ação para o mAb Trastuzumabe¹⁶.

Uma vez que as células NK recorrem ao Abs ligado às células tumorais para a morte de células cancerosas pelo ADCC, a expressão dos receptores Fc é crítica para um tratamento eficaz com Trastuzumabe¹⁷ (Figura 1). Além disso, sua ação é eficientemente balanceada por uma estimulação de receptores ativadores e inibitórios, por exemplo, receptores Killer-cell immunoglobulin-like (KIR)¹⁸.

Gráfico 1. Mecanismo do ADCC no contexto de uma resposta antitumoral. O receptor Fcγ de uma célula natural killer (NK) reconhece a região Fc de um anticorpo, que anteriormente se ligou a um antígeno de superfície em uma célula cancerosa. Essa sinapse imunológica leva à degranulação da célula NK, que libera mediadores citotóxicos como granzimas e perforina. Essas moléculas contribuem para a formação de poros na membrana celular e ativam vias apoptóticas causando morte celular programada da célula-alvo (imagem criada com Biorender.com). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O desenvolvimento de imunoterapia para HER2+ BC representa um campo em evolução. Neste caso, deve-se considerar interações entre vários componentes do sistema imunológico. Além disso, publicações anteriores testaram extensivamente terapias combinadas envolvendo todos os tipos de terapias tradicionais, imunes ou celulares para identificar combinações sinérgicas¹⁹.

Vários modelos 3D de HER2+ BC já foram usados para a descoberta de drogas. Por exemplo, Balalaeva e col. utilizaram esferoides SKBR-3 superexpressando HER2 para avaliar a citotoxicidade da imunotoxina direcionada para HER2 4D5scFv-PE40²⁰. Em outro estudo, um sistema de cultura HER2+ BC baseado em Matrigel 3D foi estabelecido para medir o crescimento celular em resposta ao trastuzumabe e agentes endócrinos²¹. Esses estudos destacam a importância de modelos esferoides tumorais de células cancerosas HER2 superexpressarem uma estratégia eficaz para melhorar clinicamente as respostas^{terapêuticas22}.

Nosso grupo identificou previamente o Sunitinibe, um inibidor multidirecionado da tirosina quinase, como um inibidor do ADCC dependente de trastuzumabe em células JIMT-1 HER2+ BC em um ensaio de cultura 2D. O estudo revelou que o Sunitinib induz autofagia e prejudica a função de morte das células NK, diminuindo a expressão de HER2 e aumentando a fixação superficial das células JIMT-17.

Aqui estabelecemos um novo modelo 3D esferoide de ADCC (células cancerosas NK.92.CD16+Trastuzumab+JIMT-1-EGFP) para ser usado para aplicações de triagem de alto rendimento e, a fim de validar os achados acima mencionados, Sunitinib foi usado como um composto modelo. Primeiro, geramos EGFP expressando células JIMT-1¹⁷ e crescemos esferoides a partir dessas células. O ADCC foi induzido por células NK juntamente com trastuzumabe, e os esferoides foram mantidos em cultura na presença ou ausência de compostos teste por 24 h (Figura 2). A quantificação do ADCC baseia-se na detecção de morte de células cancerosas apoptóticas (coloração da Anexina V) usando um sistema de Análise de Alto Conteúdo.

Gráfico 2. ADCC em um sistema de co-cultura esferoide 3D. Nossas configurações experimentais são baseadas em um sistema esferoide 3D que pode modelar com mais precisão o microambiente in vivo em comparação com modelos 2D. As células de câncer de mama JIMT-1 EGFP foram semeadas em um fundo repelente de células côncavas para formar um aglomerado celular de forma redonda, chamado esferoide. O ADCC foi então iniciado com a adição do NK92. células natural killer CD16 (relação E:T = 20:1) e um anticorpo monoclonal anti-HER2, o trastuzumabe. O modelo experimental mostrou-se eficiente e facilmente aplicável para a identificação de compostos modificadores do ADCC (imagem criada com Biorender.com). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Demonstramos que a aquisição de dados dessa maneira pode ser feita em tempo real e é estatisticamente robusta para o uso em rastreamento de alto conteúdo na descoberta de medicamentos contra o câncer. É importante ressaltar que este modelo permite uma validação estendida de um conjunto maior de compostos, e pode ser aplicado a vários ensaios de interesse.

Protocolo

1. Configuração do modelo esferoide de proteína fluorescente reforçada por JIMT-1 (EGFP)

1. Para formar um fundo repelente de células em forma de U, revestir a placa de 96 poços com solução de agarose-PBS a 0,5% (30 μL/poço). Incubar a placa à temperatura ambiente durante aproximadamente 30-45 min.
2. Lavar as células JIMT-1-EGFP duas vezes com 2 mL de PBS estéril (a geração da linhagem celular JIMT1-EGFP foi relatada em publicação anterior¹⁷). Utilizar frascos de cultura de tecidos T25 e meio JIMT-1 (meio DMEM/F-12 suplementado com 20% de soro fetal bovino (SFB), 0,3 U/mL de insulina (100 UI/mL, Humulin R) e penicilina-estreptomicina a 1%) para a cultura celular.
3. Adicionar 2 mL de tripsina-EDTA ao balão e incubá-lo por 10 min em incubadora de CO₂ .
4. Toque no balão para verificar se as células JIMT-1 se destacaram após o tempo de incubação.
5. Use 2 mL de meio JIMT-1 para interromper a digestão e coletar a suspensão celular em um tubo de 15 mL.
6. Contar as células em uma câmara de Bürker com azul de tripano a 0,4% (80 μL do corante + 20 μL da suspensão celular) e ajustar o número de células para 20.000 células/mL.
7. Pipetar 100 μL da suspensão celular (2000 células/poço) para cada poço da placa de 96 poços (pré-revestida com solução de agarose-PBS a 0,5%, conforme indicado no ponto 1.1).
8. Permitir que as células se agrupem durante um tempo de incubação de 3 dias a 37 °C em uma incubadora de CO₂ .
9. Verifique regularmente o tamanho e a forma dos esferoides com um microscópio invertido.

2. Revestimento da placa HCS

NOTA: Para evitar a fixação de esferoides JIMT-1-EGFP à superfície de vidro da placa, o revestimento da placa de Triagem de Alto Conteúdo (HCS) é crucial (caso contrário, a análise de alto conteúdo não seria possível).

1. No dia 3 após a indução dos esferoides, revestir a placa de triagem de alto conteúdo de 96 poços com Pluronic-F127 (0,5% em DMSO, 50 μL/poço) e incubar a placa por 45 min à temperatura ambiente.
2. Aspirar a solução de revestimento e lavar os poços duas vezes com meio livre de soro DMEM/F-12 (100 μL/poço).

3. Transferência de esferoides para a placa HCS

1. Usando uma pipeta de 1 mL, transfira os esferoides em triplicatas para a placa HCS de 96 poços com fundo de vidro.

4. Pré-tratamento de esferoides JIMT-1 EGFP com compostos de ensaio

1. Adicionar o composto de ensaio (por exemplo, Sunitinib diluído em DMSO a uma concentração de 40 μM) pipetando 10 μL/poço e adicionar 10 μL de meio JIMT-1 fresco aos poços de controlo (CTL).
2. Incubar a placa durante 1 h numa incubadora CO₂ a 37 °C.

5. Indução do ADCC pela adição das células efetoras

NOTA: As células CD16.176V.NK92 (doravante denominadas células NK) foram cultivadas em α-MEM suplementado com 20% de SFB, 1% de MEM-NEAA, 1% de Na-piruvato, 1% de glutamina, 1% de penicilina-estreptomicina e 100 UI/mL de IL-2.

1. Recolher as células NK do balão num tubo de 15 ml. Contar as células com azul de tripano (80 μL do corante + 20 μL da suspensão celular) e ajustar a densidade celular para a razão efetor / alvo (E:T) de 20:1 (40.000 células NK/poço).
2. Manchar as células NK com 10 μM Cell Tracker Blue (CTB, 1 μL em 1 mL de meio α-MEM NK) e colocá-las em uma incubadora CO₂ a 37 °C por 1 h.
3. Centrifugar as células NK a 150 x g por 3 min à temperatura ambiente duas vezes para lavar o excesso do corante com 1 mL de meio α-MEM.
4. Ressuspender o pellet de células NK em 1 mL de meio JIMT-1 fresco.
5. Adicionar as células NK coradas juntamente com o anticorpo anti-HER2 (Ab) (trastuzumabe, dissolvido em H₂O destilado estéril) aos esferoides alvo do JIMT-1 pipetando 55 μL/poço de células NK coradas com CTB e 55 μL/poço de 10 μg/mL Ab em meio JIMT-1 (o volume total de tratamento adicionado para o ADCC é de 110 μL/poço e a concentração final de Sunitinib é de 20 μM).
   NOTA: Para a seleção da concentração de Ab e da relação E:T, nos baseamos em nossa publicação anterior¹⁷. Experimentos preliminares foram realizados com diferentes relações E:T e concentrações de trastuzumabe para avaliar qual foi o mais efetivo na indução de ADCC em esferoides (Figura Suplementar S1).
6. Adicionar 110 μL/poço de meio JIMT-1 fresco para poços de controle (CTL).
7. Incubar a placa durante 24 h numa incubadora de CO₂ a 37 °C.
   NOTA: Como as células NK92 são conhecidas por exercerem funções citotóxicas não específicas, para controle use células JIMT-1 co-incubadas com ambas as células NK isoladamente e com um controle de isótipo ou um F(ab')₂ Ab. Já o F(ab')2-trastuzumabe (TR-F(ab')₂) foi utilizado como LCT negativo. O fragmento TR-F(ab')₂ foi preparado conforme relatado por Tóth et ^al.19 e adicionado no mesmo volume que o trastuzumabe juntamente com células NK conforme descrito em 5.5. A concentração foi ajustada para 6,6 μg/mL, correspondendo a uma concentração equimolar com Trastuzumabe²³.

6. Coloração de esferoides da anexina V-647

1. Para medir a morte celular apoptótica, corar os esferoides com conjugado Annexin V-Alexa Fluor 647 por 1 h em meio JIMT-1 (1:100) por pipetagem de 50 μL/poço.

7. Exames por imagem

NOTA: A placa é imageada em 24 h após a adição das células efetoras NK às células alvo. Para geração de imagens, um analisador de alto conteúdo e um software de análise de imagem são usados.

1. Selecione o tipo de microplaca na lista de placas usando a opção Tipo de placa . Use a placa de triagem de alto conteúdo (HCS) de 96 poços.
2. Selecione o foco automático de dois picos, pois o ensaio é realizado em placas com objetiva de 10x com abertura numérica de 0,3 (NA), usando as opções Autofocus e Objective , respectivamente. Escolha o modo confocal com a opção Modo Opcional e aplique o Binning 2 usando a opção Binning .
3. Para esferoides de imagem, selecione os canais apropriados usando a opção Seleção de canal . Para detectar as células JIMT-1 transduzidas por EGFP escolha EGFP (tempo de integração 200 ms, potência do laser 50%, altura da pilha 2,0 μm; ex: 488 nm em: 500-550 nm), e para detectar células apoptóticas use Alexa 647 (tempo de integração 100 ms, potência do laser 50%, altura da pilha 10,0 μm; ex: 640 nm em: 650-760 nm). Para visualizar as células NK dentro dos esferoides, escolha o seguinte canal: DAPI (tempo de integração 100 ms, potência do laser 50%, altura da pilha 2,0 μm; ex: 405 nm em: 435-480 nm).
4. Na opção Seleção de layout , selecione pilhas Z, pois as células nos esferoides tendem a estar em diferentes planos focais do microscópio. 10 planos (com distância de 10 μm) são suficientes para cobrir toda a região esferoide. Defina os valores do primeiro plano e do último plano em 0 μm e 90 μm, respectivamente.
   NOTA: Antes de iniciar a medição, imagens de amostra podem ser tiradas com a função de instantâneo para verificar as configurações corretas.
5. Defina o número de poços e campos para geração de imagens usando a opção Definir layout .

8. Análise de alto conteúdo (ACS)

NOTA: Analise as imagens com o software Harmony ou exporte imagens para análise usando um software de terceiros preferido. Para a análise da eficiência do ADCC, a intensidade de fluorescência da Anexina V 647 é medida. As células-alvo mortas pelo ADCC aparecem na área periférica dos esferoides. Portanto, as células positivas da Anexina V são medidas neste "anel" esferoide. Para validar esse método, foram realizadas análises com diferentes parâmetros para avaliar qual era o mais confiável e que produzia os melhores resultados (Figura Suplementar S2). Um poço ADCC é mostrado no vídeo para demonstrar passo-a-passo o processo de análise de imagens.

1. Identifique os esferoides pela fluorescência EGFP das células JIMT-1 usando a opção Localizar regiões de textura e filtre-os por tamanho (> 25.000 μm²).
2. Remova objetos de borda pela opção Selecionar População .
3. Uma vez que as células positivas (apoptóticas) da anexina V aparecem na periferia dos esferoides, meça a intensidade da anexina neste "anel" apoptótico, seleccionado pela opção Seleccionar região (borda exterior -90%) para determinar a morte celular apoptótica.
4. Expresse os valores de intensidade da anexina V como intensidade média.

Resultados

EGFP expressando células JIMT-1 foram geradas, e esferoides foram cultivados a partir dessas células. O sunitinibe foi usado como um composto de teste, pois foi demonstrado anteriormente que afeta o curso do ADCC¹⁷. Os esferoides foram deixados aglomerar por 72 h. No dia 3, 10 μg/mL de trastuzumabe (ou equimolar 6,6 μg/mL TR-F(ab')₂¹⁹) e células NK (20:1) foram adicionados aos esferoides na presença ou ausência de 20 μM de Sunitinib (1 h pré-tratamento),...

Discussão

Apesar das melhorias significativas no tratamento da CB nas últimas décadas, os pacientes ainda desenvolvem regularmente resistência aos medicamentos ou experimentam efeitos colaterais negativos²⁴. A alta morbidade e mortalidade ligadas à CB exigem uma investigação contínua sobre os mecanismos moleculares subjacentes, assim como plataformas robustas de triagem para identificar novas moléculas acionáveis para o desenvolvimento terapêutico²⁵. Essas estratégias requ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well glass bottom Cell Carrier Ultra microplates	PerkinElmer, Waltham, MA, USA	LLC 6055302	for spheroids measurements
96-well tissue culture plates	TPP	92096	for cell seeding
α-MEM medium	Sigma	M8042	in NK medium
Agarose	Sigma	A9539	for spheroids seeding
Annexin V-Alexa Fluo 647 conjugate	Invitrogen-ThermoFisher Scientific	A23204	for apoptosis measurement with HCS
CD16.176 V.NK-92 cells	Dr. Kerry S. Campbell (the Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA on behalf of Brink Biologics, Inc. San Diego, CA)	ATCC CRL-2407	for cell culture
Cell Tracker Blue	Invitrogen-Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)	C2110	for staining of NK cells
DMEM/F-12 medium	Sigma	D8437	in JIMT1-EGFP medium
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418	for coating HCS plate before transfering the spheroids
Fetal bovine serum (FBS)	Biosera	FB-1090/500	JIMT-1-EGFP and NK medium
Glutamine	Gibco	35,050–061	in NK medium
GraphPad Prism 8.0.1	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA		for statistical analysis
Harmony software	PerkinElmer, Waltham, MA, USA		for HCA
IL-2	Proleukin, Novartis Hungária Kft., Budapest, Hungary	PHC0026	in NK medium
Insulin (Humulin R)	Eli Lilly	HI0219	JIMT-1-EGFP medium
JIMT-1 breast cancer cells			for cell culture
MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA)	Gibco	11,140–050	in NK medium
Na-pyruvate	Lonza	BE13-115E	in NK medium
Opera Phenix High-Content Analysis equipment	PerkinElmer, Waltham, MA, USA	HH14001000	for HCA
PBS (Posphate buffered saline)	Lonza	BE17-517Q	for washing the cells
Penicillin-Streptomycin	Biosera	LM-A4118	JIMT-1-EGFP and NK medium
pLP-1, pLP-2, pLP-VSV-G, pWOXEGFP	Invitrogen, (Prof. József Tzsér, University of Debrecen)		for JIMT-1-EGFP cell line
Pluronic-F127	Sigma	P2443	for coating HCS plate before transfering the spheroids
Sunitinib malate	SigmaAldrich	PZ0012	for treatments
Trastuzumab Ab (humanized anti-HER2 monoclonal antibody)	Herzuma®, EGIS Pharmaceuticals, Budapest, Hungary	NDC-63459-303-43	for treatments
Trastuzumab-F(ab')2	Gift from Prof. György Vereb and Árpád Ször	Department of Biophysics and Cell Biology, University of Debrecen	for treatments
Trypan blue 0.4% solution	Sigma	T8154	for cell counting
Trypsin-EDTA 1X in PBS	Biosera	LM-T1706	for cells detachment