通过生物精炼方法对红海藻 gracilaria gracilis 进行增值

摘要

在这里，我们描述了旨在对 Gracilaria gracilis进行综合增值的几种协议：野生物种收获，内部生长和生物活性成分的提取。评估了提取物的抗氧化、抗菌和细胞毒性作用，以及富含全海藻生物质和色素的食物的营养和稳定性评估。

摘要

人们对海藻作为一种丰富的原料，以获得有价值的多目标生物活性成分的兴趣不断增长。在这项工作中，我们探索了 Gracilaria gracilis的潜力，这是一种可食用的红海藻，因其商业利益而在全球范围内种植，作为化妆品、药理学、食品和饲料应用的琼脂和其他成分的来源。

通过无性繁殖和孢子形成优化了G. gracilis的生长条件，同时操纵了物理化学条件，以实现较大的生物量储量。在海藻生物质上使用乙醇和水进行绿色提取方法。通过一组关于提取物细胞毒性、抗氧化和抗菌特性的体外测定来评估提取物的生物活性潜力。此外，干海藻生物质被纳入意大利面配方中，以增加食物的营养价值。从G. gracilis中提取的色素也已作为天然着色剂掺入酸奶中，并对其稳定性进行了评估。这两款产品都经过了半培训的感官小组的评估，旨在在进入市场之前实现最佳的最终配方。

结果支持 G. gracilis 的多功能性，无论是作为整个生物质，提取物和/或色素使用。通过实施几个优化的协议，这项工作允许开发具有潜在利润的产品，以促进食品、化妆品和水产养殖市场，促进环境可持续性和蓝色循环经济。

此外，根据生物精炼方法，残留的海藻生物质将用作植物生长的生物刺激剂或转化为碳材料，用于葡萄牙莱里亚MARE-Polytechnic内部水产养殖系统的水净化。

引言

海藻可以被视为一种有趣的天然原料，可以从制药、食品、饲料和环境部门获利。它们生物合成了一整套分子，其中许多分子在陆地生物中没有发现，具有相关的生物学特性^1,2。然而，需要实施海藻优化的养殖方案，以确保大量的生物量储存。

栽培方法必须始终考虑海藻菌体的性质和整体形态。 Gracilaria gracilis 是一个克隆类群，这意味着附着器官产生多个营养轴。因此，实现了通过碎片化（无性繁殖）的繁殖，因为这些轴中的每一个都完全能够采用独立于主菌体³ 的生命。克隆类群可以通过简单快速的一步培养方法成功整合，因为通过将菌体分解成小片段来获得大量的生物量，这些碎片可以快速再生并生长成新的、基因相同的个体。在此过程中可以使用单倍体和双倍体。尽管该属表现出复杂的单倍双克隆同构三相生命周期，但很少需要孢子形成，除非需要对种群进行遗传更新以实现改良作物。在这种情况下，四孢子（由减数分裂形成的单倍孢子）和果孢子（由有丝分裂形成的双孢子）都会产生宏观的菌体，然后可以通过无^{性繁殖生长}和繁殖4。生长周期取决于环境条件和个体的生理状态，以及其他生物因素，例如附生植物的出现和其他生物的粘附。因此，优化生长条件对于确保高生产力和生产优质生物质至关重要

研究方案

1. 生物质收获和制备

1. 在退潮时收获 G. gracilis 标本，并将它们迅速运送到实验室，装在黑暗、冷却的盒子里，以避免干燥、光线和空气暴露。
2. 在实验室中，用流动的海水清洗每个菌体并彻底清洁以去除表面的碎屑、坏死部分、附生植物和其他生物。
3. 将野生生物量保持在恒定充气的海水（31-35 psu）中，在气候室（20±1°C）中，由日光冷白光和荧光灯提供低辐照度，光周期设置为16：08（光：暗）7天。在此期间，不要提供任何营养培养基;这使海藻能够慢慢适应新的室内条件。

2. 库存维护

1. 适应期过后，用无菌刀片切开健康的海藻尖端。按照Redmond等人（2014）¹⁹ ，在无菌条件下，将每个尖端拖过先前在培养皿中制备的琼脂凝胶（1.0%细菌琼脂，蒸馏水/海水比例为1：1）以除去任何残留的污染物。对每个吸头进行三次琼脂拖动，并始终将吸头拖过琼脂凝胶的未使用部分。
2. 用盐酸溶液（HCl，15%）酸洗玻璃器皿，并用蒸馏水彻底冲洗。通过高压灭菌器（121°C，15分钟）对清洁过程中使用的所有工具，玻璃器皿，琼脂，海水和蒸馏水进行消毒。
   注意：请参阅供应商提供的 HCl 安全数据表。
3. 根据 Redmond 等人 （2014）¹⁹ 的说法，尖端在 ....

讨论

液体介质中的抗菌活性测试用于评估抗菌物质对悬浮在液体介质中的微生物的有效性，通常用于确定物质抑制生长或杀死微生物的能力^35,36,37,38.它们用于评估微生物对抗菌剂的敏感性，并在试管或微量滴定板中进行，其中不同浓度的抗微生物物质针对目标微生物的标准化悬浮液进行测试^2.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute Ethanol	Aga, Portugal	64-17-5
Ammonium Chloride	PanReac	12125-02-9
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	1397-89-3
Analytical scale balance	Sartorius, TE124S	22105307
Bacillus subtilis subsp. spizizenii	German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)	DSM 347
Biotin	Panreac AppliChem	58-85-5
Centrifuge	Eppendorf, 5810R	5811JH490481
Chloramphenicol	PanReac	56-75-7
CO2 Chamber	Memmert	N/A
Cool White Fluorescent Lamps	OSRAM Lumilux Skywhite	N/A
Densitometer McFarland	Grant Instruments	N/A
DMEM medium	Sigma-Aldrich	D5796
DMSO	Sigma-Aldrich	67-68-5
DPPH	Sigma, Steinheim, Germany	1898-66-4
Escherichia coli (DSM 5922)	German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)	DSM5922
Ethanol 96%	AGA-Portugal	64-17-5
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA)	J.T.Baker	6381-92-6
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524
Filter Paper (Whatman No.1)	Whatman	WHA1001320
Flasks	VWR International, Alcabideche, Portugal	N/A
Folin-Ciocalteu	VWR Chemicals	31360.264
Gallic Acid	Merck	149-91-7
Germanium (IV) Oxide, 99.999%	AlfaAesar	1310-53-8
HaCaT cells – 300493	CLS-Cell Lines Services, Germany	300493
Hot Plate Magnetic Stirrer	IKA, C-MAG HS7	06.090564
Iron Sulfate	VWR Chemicals	10124-49-9
Laminar flow hood	TelStar, Portugal	526013
LB Medium	VWR Chemicals	J106
Listonella anguillarum	German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)	DSM 21597
Manganese Chloride	VWR Chemicals	7773.01.5
Micropipettes	Eppendorf, Portugal	N/A
Microplates	VWR International, Alcabideche, Portugal	10861-666
Microplates	Greiner	738-0168
Microplates (sterile)	Fisher Scientific	10022403
Microplate reader	Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA	1611151E
MTT	Sigma-Aldrich	289-93-1
Muller-Hinton Broth (MHB)	VWR Chemicals	90004-658
Oven	Binder, FD115	12-04490
Oven	Binder, BD115	04-62615
Penicillin	Sigma-Aldrich	1406-05-9
pH meter Inolab	VWR International, Alcabideche, Portugal	15212099
Pippete tips	Eppendorf, Portugal	5412307
Pyrex Bottles Media Storage	VWR International, Alcabideche, Portugal	16157-169
Rotary Evaporator	Heidolph, Laborota 4000	80409287
Rotavapor	IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal	07.524254
Sodium Carbonate (Na2CO3)	Chem-Lab	497-19-8
Sodium Chloride (NaCl)	Normax Chem	7647-14-5
Sodium Phosphate Dibasic	Riedel-de Haën	7558-79-4
SpectraMagic NX	Konica Minolta, Japan		color data analysis software
Spectrophotometer	Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA	5A4T092004
Streptomycin	Sigma-Aldrich	57-92-1
Thiamine	Panreac AppliChem	59-43-8
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049
Tryptic Soy Agar (TSA)	VWR Chemicals	ICNA091010617
Tryptic Soy Broth (TSB)	VWR Chemicals	22091
Ultrapure water	Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany	F5HA17360B
Vacuum pump	Buchi, Switzerland	FIS05-402-103
Vitamin B12	Merck	68-19-9