Aufwertung der Rotalge Gracilaria gracilis durch einen Bioraffinerieansatz

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir verschiedene Protokolle, die auf eine integrierte Aufwertung von Gracilaria gracilis abzielen: Ernte von Wildarten, Eigenzucht und Extraktion von bioaktiven Inhaltsstoffen. Die antioxidative, antimikrobielle und zytotoxische Wirkung der Extrakte wird ebenso bewertet wie die Nährwert- und Stabilitätsbewertung von Lebensmitteln, die mit ganzer Algenbiomasse und Pigmenten angereichert sind.

Zusammenfassung

Das Interesse an Algen als reichlich vorhandener Rohstoff zur Gewinnung wertvoller und zielführender bioaktiver Inhaltsstoffe wächst kontinuierlich. In dieser Arbeit untersuchen wir das Potenzial von Gracilaria gracilis, einer essbaren Rotalge, die weltweit wegen ihres kommerziellen Interesses als Quelle für Agar und andere Inhaltsstoffe für kosmetische, pharmakologische, Lebensmittel- und Futtermittelanwendungen angebaut wird.

Die Wachstumsbedingungen von G. gracilis wurden durch vegetative Vermehrung und Sporulation optimiert, während die physikalisch-chemischen Bedingungen manipuliert wurden, um einen großen Biomassebestand zu erreichen. Grüne Extraktionsmethoden mit Ethanol und Wasser wurden über die Algenbiomasse durchgeführt. Das bioaktive Potenzial der Extrakte wurde durch eine Reihe von In-vitro-Assays hinsichtlich ihrer Zytotoxizität, ihrer antioxidativen und antimikrobiellen Eigenschaften bewertet. Darüber hinaus wurde getrocknete Algenbiomasse in Nudelformulierungen eingearbeitet, um den Nährwert der Lebensmittel zu erhöhen. Aus G. gracilis extrahierte Pigmente wurden auch als natürlicher Farbstoff in Joghurt eingearbeitet und ihre Stabilität bewertet. Beide Produkte wurden einer halbgeschulten sensorischen Jury unterzogen, die darauf abzielt, die beste Endformulierung zu erreichen, bevor sie auf den Markt kommen.

Die Ergebnisse belegen die Vielseitigkeit von G. gracilis , unabhängig davon, ob es als Gesamtbiomasse, Extrakte und/oder Pigmente angewendet wird. Durch die Implementierung mehrerer optimierter Protokolle ermöglicht diese Arbeit die Entwicklung von Produkten mit dem Potenzial, von den Lebensmittel-, Kosmetik- und Aquakulturmärkten zu profitieren und die ökologische Nachhaltigkeit und eine blaue Kreislaufwirtschaft zu fördern.

Darüber hinaus wird die verbleibende Algenbiomasse im Einklang mit einem Bioraffinerieansatz als Biostimulans für das Pflanzenwachstum verwendet oder in Kohlenstoffmaterialien umgewandelt, die bei der Wasseraufbereitung der hauseigenen Aquakultursysteme von MARE-Polytechnic in Leiria, Portugal, verwendet werden.

Einleitung

Algen können als interessanter natürlicher Rohstoff angesehen werden, von dem die Pharma-, Lebensmittel-, Futtermittel- und Umweltbranche profitieren kann. Sie biosynthetisieren eine Vielzahl von Molekülen, von denen viele in terrestrischen Organismen nicht vorkommen und relevante biologische Eigenschaften aufweisen ^1,2. Es müssen jedoch Algen-optimierte Anbauprotokolle implementiert werden, um einen großen Biomassebestand zu gewährleisten.

Die Anbaumethoden müssen immer die Art der Algen-Thalli und die allgemeine Morphologie berücksichtigen. Gracilaria gracilis ist ein klonales Taxon, d.h. das Bindungsorgan produziert mehrere vegetative Achsen. Die Fortpflanzung durch Fragmentierung (vegetative Fortpflanzung) wird somit erreicht, da jede dieser Achsen vollständig in der Lage ist, ein unabhängiges Leben vom Hauptthallus³ anzunehmen. Klonale Taxa können mit einfachen und schnellen einstufigen Kultivierungsmethoden erfolgreich integriert werden, da große Mengen an Biomasse durch die Spaltung des Thallus in kleine Fragmente gewonnen werden, die sich schnell regenerieren und zu neuen, genetisch identischen Individuen heranwachsen. Dabei können sowohl haplontische als auch diplontische Thalli verwendet werden. Obwohl die Gattung einen komplexen haplo-diplontischen isomorphen triphasischen Lebenszyklus aufweist, ist eine Sporulation nur selten erforderlich, es sei denn, eine genetische Erneuerung der Bestände ist erforderlich, um verbesserte Ernten zu erzielen. In diesem Fall entstehen sowohl Tetrasporen (haplontische Sporen, die durch Meiose gebildet werden) als auch Carposporen (diplontische Sporen, die durch Mitose gebildet werden) makroskopische Thalli, die dann durch vegetative Vermehrung gezüchtet und vermehrt werden können⁴. Wachstumszyklen werden von den Umweltbedingungen und dem physiologischen Zustand der Individuen bestimmt, neben anderen biologischen Faktoren wie der Entstehung von Epiphyten und der Adhäsion anderer Organismen. Daher ist die Optimierung der Wachstumsbedingungen von entscheidender Bedeutung, um eine hohe Produktivität zu gewährleisten und Biomasse von guter Qualität zu produzieren⁵.

Die Extraktion bioaktiver Verbindungen aus Algen, einschließlich G. gracilis, kann durch verschiedene Methoden erreicht^{werden 6,7}. Die Wahl der Extraktionsmethode hängt von den spezifischen Verbindungen von Interesse, der Zielanwendung und den Eigenschaften der Algen ab. In dieser Studie konzentrierten wir uns auf die Lösungsmittelextraktion, bei der grüne Lösungsmittel wie Wasser oder Ethanol verwendet werden, um bioaktive Verbindungen aus der Algenbiomasse aufzulösen und zu extrahieren. Die Extraktion kann durch Mazeration vielseitig und effektiv durchgeführt werden und kann für eine Vielzahl von Verbindungen verwendet werden. Es handelt sich um eine einfache und weit verbreitete Methode, bei der Biomasse über einen längeren Zeitraum in einem Lösungsmittel eingeweicht wird, typischerweise bei Raum- oder leicht erhöhten Temperaturen. Das Lösungsmittel wird gerührt, um den Extraktionsprozess zu verbessern. Nach der gewünschten Extraktionszeit wird das Lösungsmittel durch Filtration oder Zentrifugation vom Feststoff getrennt.

Wasser ist aufgrund seiner Sicherheit, Verfügbarkeit und Kompatibilität mit einer Vielzahl von Lebensmitteln ein häufig verwendetes Lösungsmittel in Lebensmittelanwendungen. Die Wasserextraktion eignet sich für polare Verbindungen wie Polysaccharide, Peptide und bestimmte Phenole. Es kann jedoch sein, dass es unpolare Verbindungen nicht effektiv extrahiert. Ethanol ist auch ein weit verbreitetes Lösungsmittel in Lebensmittelanwendungen und kann für die Extraktion einer Vielzahl von bioaktiven Molekülen, einschließlich phenolischer Verbindungen, Flavonoide und bestimmter Pigmente, wirksam sein. Ethanol ist allgemein als sicher für die Verwendung in Lebensmitteln anerkannt und kann leicht verdampft werden, wobei die extrahierten Verbindungen zurückbleiben. Es ist erwähnenswert, dass bei der Wahl der Extraktionsmethode Faktoren wie Effizienz, Selektivität, Kosteneffizienz und Umweltauswirkungen berücksichtigt werden sollten. Die Optimierung von Extraktionsparametern wie Lösungsmittelkonzentration, Extraktionszeit, Temperatur und Druck ist entscheidend, um optimale Ausbeuten an bioaktiven Verbindungen aus G. gracilis oder anderen Algen zu erzielen.

Es wurde festgestellt, dass Algen eine antimikrobielle Aktivität gegen eine Vielzahl von Mikroorganismen aufweisen, darunter Bakterien, Pilze und Viren⁸. Diese Aktivität wird bioaktiven Komponenten zugeschrieben, darunter Phenole, Polysaccharide, Peptide und Fettsäuren. Mehrere Studien haben ihre Wirksamkeit gegen Krankheitserreger wie Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp. und Pseudomonas aeruginosa unter anderem nachgewiesen⁹. Die antimikrobielle Aktivität von Algen wird auf das Vorhandensein bioaktiver Verbindungen zurückgeführt, die mikrobielle Zellwände, Membranen, Enzyme und Signalwege stören können¹⁰. Diese Verbindungen können das mikrobielle Wachstum stören, die Bildung von Biofilmen hemmen und die Immunantwort modulieren.

Rote Algen, auch Rhodophyten genannt, sind eine Gruppe von Algen, die eine antimikrobielle Aktivität gegen eine Vielzahl von Mikroorganismen aufweisen können. Innerhalb dieser Gruppe enthält G. gracilis verschiedene bioaktive Verbindungen, die zu seiner berichteten antimikrobiellen Aktivität beitragen können. Während die spezifischen Moleküle variieren können, sind die gemeinsamen Klassen, über die in G. gracilis berichtet wurde und antimikrobielle Eigenschaften besitzen können, Polysaccharide, Phenole, Terpenoide und Pigmente¹¹. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass das Vorhandensein und die Mengen dieser Komponenten je nach Faktoren wie dem Ort der Algensammlung, der Saisonalität, dem physiologischen Zustand des Thallis und den Umweltbedingungen variieren können. Daher können die spezifische Klasse und Konzentration der antimikrobiellen Verbindungen in G. gracilis entsprechend variieren.

Es wurde auch festgestellt, dass G. gracilis antioxidative Eigenschaften besitzt, die verschiedene phenolische Verbindungen enthalten, von denen gezeigt wurde, dass sie freie Radikale abfangen und oxidativen Stress reduzieren¹².Antioxidantien tragen dazu bei, die Zellen vor Schäden durch reaktive Sauerstoffspezies zu schützen und haben potenzielle gesundheitliche Vorteile. Die antioxidative Kapazität kann direkt durch verschiedene Methoden bewertet werden, einschließlich der 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)-Radikalfängeraktivität und indirekt durch die Quantifizierung des Gesamtpolyphenolgehalts (TPC)¹³.

Auch wenn ein Inhaltsstoff eine ausgeprägte Bioaktivität aufweist, ist seine Zytotoxizitätsbewertung bei der Bewertung natürlicher und synthetischer Substanzen, die in Kontakt mit lebenden Zellen oder Geweben verwendet werden sollen, unerlässlich. Es gibt mehrere Methoden zur Messung der Zytotoxizität, jede mit Vor- und Nachteilen. Insgesamt bieten sie eine Reihe von Möglichkeiten, die schädlichen Auswirkungen vieler Substanzen auf Zellen zu bewerten und gleichzeitig die Mechanismen von Zellschädigung und Zelltod zu untersuchen¹⁴.

In dieser Arbeit verwenden wir den 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay, eine kolorimetrische Methode, die von Mosmann (1983)¹⁵ eingeführt wurde. Diese Methode misst die Reduktion von Tetrazoliumsalzen zu einem violetten Formazanprodukt durch stoffwechselaktive Zellen. Je höher die Menge an Formazankristallen, desto höher ist die Anzahl lebensfähiger Zellen, was ein indirektes Maß für die Zytotoxizität darstellt¹⁴. Da in dieser Arbeit G. gracilis-Wasser und Ethanolextrakte in dermokosmetische Formulierungen eingearbeitet werden sollen, wird die in vitro Zytotoxizitätsbewertung in einer Keratinozyten (HaCaT)-Zelllinie durchgeführt.

In Bezug auf die Lebensmittelanwendung sind Algen im Allgemeinen kalorienarm und nährstoffreich an Ballaststoffen, essentiellen Elementen und Aminosäuren, Polysacchariden, mehrfach ungesättigten Fettsäuren, Polyphenolen und Vitaminen ^2,16. G. gracilis ist da keine Ausnahme und hat einen interessanten Nährwert. Freitas et al. (2021)⁴ fanden heraus, dass kultivierte G. gracilis im Vergleich zu wilden Algen einen höheren Protein- und Vitamin-C-Gehalt aufwies und den Gesamtlipidspiegel beibehielt. Dies kann einen wirtschaftlichen und ökologischen Vorteil darstellen, da die Produktion ernährungsphysiologisch der Ausbeutung wilder Ressourcen vorzuziehen ist. Darüber hinaus sind die Verbraucher zunehmend besorgt über die Art der Lebensmittel, die sie essen, daher ist es wichtig, neue Zutaten für die Anreicherung von Lebensmitteln einzuführen und neue Ressourcen zu verwenden, um Extrakte zu erhalten, die einem Produkt einen Mehrwert verleihen und ein "sauberes Etikett" beanspruchen können. Außerdem ist der derzeitige Markt sehr wettbewerbsintensiv und erfordert die Entwicklung neuer Produkte und innovativer Strategien, um die Hersteller von ihren Mitbewerbern abzuheben¹⁷.

Die Anreicherung von Produkten mit geringem Nährwert, wie z. B. Nudeln, mit Meeresressourcen, einschließlich Algen, ist eine Strategie, um diese Ressource als neues Lebensmittel einzuführen, und eine Marktdifferenzierungsstrategie durch ein Produkt mit ausgeprägtem Nährwert. Auf der anderen Seite ist G. gracilis eine Quelle für natürliche rote Pigmente wie Phycobiliproteine¹⁸, die ein hohes Potenzial für Anwendungen in der Lebensmittelindustrie haben. Diese Algen haben in mehreren Bereichen großes Interesse gezeigt, und ihre Anwendung kann mit den gesamten Algen, Extrakten und/oder der verbleibenden Biomasse erfolgen. In dieser Arbeit zeigen wir einige Beispiele für solche Anwendungen.

Protokoll

1. Ernte und Aufbereitung von Biomasse

1. Ernten Sie die Proben von G. gracilis bei Ebbe und transportieren Sie sie schnell in dunklen, gekühlten Boxen ins Labor, um Trocknung, Licht und Lufteinwirkung zu vermeiden.
2. Waschen Sie jeden Thallus im Labor mit fließendem Meerwasser und reinigen Sie ihn gründlich, um Ablagerungen, nekrotische Teile, Epiphyten und andere Organismen von der Oberfläche zu entfernen.
3. Halten Sie die wilde Biomasse in konstant belüftetem Meerwasser (31-35 PSU) in einem Klimaraum (20 ± 1 °C) mit geringer Bestrahlungsstärke durch Tageslicht, kaltweiße Lampen und Leuchtstofflampen und photoperiodisch auf 16:08 Uhr (hell: dunkel) für 7 Tage. Während dieser Zeit dürfen keine Nährmedien zugeführt werden. So können sich die Algen langsam an die neuen Bedingungen im Innenraum gewöhnen.

2. Bestandspflege

1. Schneiden Sie nach der Eingewöhnungszeit gesunde Algenspitzen mit einer sterilen Klinge ab. In Anlehnung an Redmond et al. (2014)¹⁹ und unter sterilen Bedingungen wird jede Spitze durch ein zuvor in Petrischalen zubereitetes Agar-Gel (1,0 % bakteriologischer Agar, im Verhältnis 1:1 destilliertes Wasser/Meerwasser) gezogen, um alle verbleibenden Verunreinigungen zu entfernen. Führen Sie den Agar-Zug dreimal für jede Spitze durch und ziehen Sie die Spitze immer durch unbenutzte Teile des Agar-Gels.
2. Gläser in Salzsäurelösung (HCl, 15%) sauer waschen und gründlich mit destilliertem Wasser abspülen. Sterilisieren Sie alle Werkzeuge, Glaswaren, Agar, Meerwasser und destilliertes Wasser, die im Reinigungsprozess verwendet werden, im Autoklaven (121 °C, 15 min).
   ACHTUNG: Beachten Sie das vom Lieferanten gelieferte Sicherheitsdatenblatt von HCl.
3. Die Spitzen wachsen in sterilisiertem Meerwasser bei 35 psu, ergänzt mit Von Stosch Enriched Solution (VSE), die für rote Algen modifiziert wurde, nach Redmond et al. (2014)¹⁹. Geben Sie Germaniumdioxid (GeO₂) in das Medium (1 ml/L), um das Wachstum von epiphytischen Kieselalgen zu verhindern.
   ACHTUNG: Beachten Sie das vom Lieferanten gelieferte Sicherheitsdatenblatt von GeO₂ .
   HINWEIS: Spitzen, die einen Pigmentverlust aufweisen, wie er durch teilweise oder vollständige Verfärbungen beobachtet wird, stehen unter Stress oder sind bereits tot und sollten entsorgt werden.

3. Anbau und Scale-up

1. Nach der Akklimatisierungsphase werden nach dem Zufallsprinzip etwa 8-10 gesunde Spitzen in 250-ml-Flachbodenkolben in einem Klimaraum verteilt, der auf 20 ± 1 °C eingestellt ist, mit dem weißen kühlen Licht von 20 ± 0,5 μmol Photonen ^{m-2 s-1} (1500 Lux), einer Photoperiode von 16 h: 8 h (hell: dunkel) und sterilem Meerwasser, das mit VSE-Nährmedien angereichert ist, die jede Woche erneuert werden.
2. Führen Sie wöchentliche Gewichtsmessungen durch und vermeiden Sie es, die Thalli übermäßig zu belasten²⁰. Entfernen Sie dazu vorsichtig die Spitzen aus dem Nährmedium, spülen Sie sie vorsichtig ab und wiegen Sie die Milligramm auf einer Laborwaage ab.
   HINWEIS: Dieses Verfahren kann zusammen mit der wöchentlichen Erneuerung der Nährmedien durchgeführt werden.
3. Thalli kann in diesen Kolben bis zu einer Dichte von 2 g/L wachsen. Führen Sie an dieser Stelle eine Empfängerskalierung durch (250 ml, 1 l und 5 l). Füllen Sie den Anbau in offene weiße Behälter von 50 l und mehr im Freien, wenn das Volumen 5 l erreicht.
4. Berechnen Sie die relative Wachstumsrate (RGR) nach Patarra et al. (2017)²¹ :
   RGR (% vw/Tag) = ([Ln (fw) - Ln (iw)]/t) x 100
   Dabei sind iw und fw das Anfangs- bzw. Endfrischgewicht, ausgedrückt in Gramm, und t die Zeit in Tagen.
   HINWEIS: In diesem Laboraufbau erreicht die RGR Werte von bis zu 21 % pro Tag. Die Biomasseernte kann jederzeit durchgeführt werden. Biomasse muss schnell aufbereitet werden, um einen Abbau zu verhindern, entweder durch Ofentrocknung, Gefriertrocknung oder einfach gefroren (-20 °C), je nach Verwendungszweck. Die getrocknete Biomasse kann bei Raumtemperatur (RT) konserviert oder auch gefroren gelagert werden.

4. Extraktionsverfahren

HINWEIS: Um die In-vitro-Zytotoxizität, die antioxidativen und antimikrobiellen Eigenschaften von G. gracils-Extrakten zu bewerten, werden bei der Herstellung zwei verschiedene Parameter berücksichtigt: die Extraktionstemperatur und die Art des Lösungsmittels.

1. Um die Extraktionen durchzuführen, wird die Biomasse von G. gracilis im Ofen getrocknet und die Biomasse gemahlen (z. B. in einer Haushaltskaffeemühle), bis das Pulver durch ein 200-μm-Sieb läuft.
2. Die getrocknete Biomasse (10 g) wird gewogen und in 100 ml Lösungsmittel (absolutes Ethanol oder steriles Wasser) aufgelöst.
3. In einem lichtgeschützten Gefäß 30 min einrühren.
4. Führen Sie sequentielle Ethanol- > Wasser und Wasser- > Ethanolextraktionen bei RT, 40 °C und 70 °C durch.
5. Führen Sie für jede Temperatur die Extraktionen mit Ethanol und Wasser zweimal getrennt durch.
6. Trennen Sie die flüssigen Extrakte von der verbleibenden Biomasse durch Filtration durch Filterpapier (Whatman No.1), gefolgt von Zentrifugation bei 8000 x g für 10 min bei RT.
7. Verwenden Sie die verbleibende Algenbiomasse für die weitere Extraktion mit dem anderen Lösungsmittel wieder. Wenn eine Probe zuerst mit Ethanol extrahiert wurde, extrahieren Sie sie anschließend mit Wasser und umgekehrt.
8. Die wässrigen Extrakte werden gefriergetrocknet und die Ethanolextrakte in einem Rotationsverdampfer bei 40 °C eingedampft.
9. Lagern Sie die getrockneten Extrakte bei 4 °C.
10. Lösen Sie die Extrakte in einer Konzentration von 50 mg/ml (antimikrobielle Assays) oder 10 mg/ml (antioxidative Assays) auf. Die wässrigen Extrakte werden in sterilem Wasser und die ethanolischen Extrakte in absolutem Ethanol gelöst.

5. Antimikrobielle Aktivität

HINWEIS: Die ethanolischen und wässrigen Extrakte sollten einzeln gegen Bacillus subtilis subsp. spizizenii (DSM 347), Escherichia coli (DSM 5922) und Listonella anguillarum (DSM 21597) getestet werden. Antimikrobielle Tests müssen gemäß den Empfehlungen des National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2012)²² durchgeführt werden. Alle Kulturen stammen aus der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ). L. anguillarum wurde auf tryptischer Sojabrühe (TSB) oder tryptischem Sojaagar (TSA) gezüchtet, die mit 1 % Natriumchlorid (NaCl) ergänzt wurde. Die restlichen beiden Stämme wurden auf LB-Medium (VWR Chemicals) gezüchtet. Die Kulturen Bacillus subtilis subsp. spizizenii (DSM 347) und Listonella anguillarum (DSM 21597) wurden bei 30 °C inkubiert, während Escherichia coli (DSM 5922) bei 37 °C gemäß den Anweisungen des Lieferanten inkubiert wurde. Die Bouillon-Mikrodilutionsmethode kann zur Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität in einem flüssigen Medium verwendet werden, und dies sollte auf der Mikroskala durchgeführt werden, damit das antimikrobielle Potenzial schnell und effizient bestimmt werden kann. Diese kostengünstige Methode ermöglicht es, Ergebnisse in nur 24 Stunden zu erhalten, und eignet sich daher, um in einem frühen Stadium die besten Extraktionsbedingungen zu bestimmen, die es ermöglichen, für einen bestimmten mikrobiellen Stamm Ergebnisse in Bezug auf die wachstumshemmende Wirkung zu erzielen. Die Methodik erfordert jedoch die Verwendung steriler Mikrotiterplatten mit einem Deckel, der speziell für das mikrobielle Wachstum geeignet ist, sowie die Verfügbarkeit eines Mikroplatten-Readers für die Wellenlänge von 600 nm.

1. Führen Sie die Bouillon-Mikrodilutionstests mit unbehandelten und runden 96-Well-Mikrotiterplatten mit 170 μl Muller-Hinton-Bouillon (MHB) durch, die mit 10 μl standardisiertem Inokulum (bei 0,5 McFarland-Standard) und 20 μl jedes Extrakts (50 mg/ml) beimpft wurden.
2. Inkubieren Sie die Platten 24 Stunden lang bei der optimalen Temperatur für jeden Stamm.
3. Nachweis der antimikrobiellen Aktivität durch Verringerung der sichtbaren Trübung, gemessen durch Aufzeichnung der optischen Dichte (OD ₆₀₀) in einem Mikroplatten-Spektralphotometer bei 0 h und 24 h.
4. Drücken Sie die Ergebnisse als Prozentsatz der Hemmung aus:
   
   wobei Abs. ext die Differenz in der gemessenen Absorption zwischen 0 h und 24 h in den Vertiefungen ist, die einen Bakterienstamm enthalten, der in Gegenwart des Extrakts wächst, und Abs sich auf dasselbe Maß in Vertiefungen bezieht, die den Bakterienstamm und das Lösungsmittel enthalten.
5. Zu dieser Methode gehören Kontrollreaktionen, wobei Vertiefungen nur das Kulturmedium enthalten, das die Negativkontrolle darstellt, aber auch Vertiefungen mit Medium, das mit dem Standardstamm beimpft wurde, der dem Lösungsmittel (Ethanol oder Wasser) zugesetzt wurde, und Medium mit dem Bakterienstamm und dem Positivkontrollantibiotikum (Chloramphenicol).

6. Antioxidative Aktivität und Quantifizierung der Gesamtpolyphenole

1. Gesamtgehalt an Polyphenolen
   HINWEIS: Der Gesamtpolyphenolgehalt (TPC) wird mit der Folin-Ciocalteu-Methode²³ berechnet und an den Mikromaßstab angepasst.
   1. In jede Vertiefung einer lichtgeschützten 96-Well-Mikrotiterplatte werden 158 μl Reinstwasser, 2 μl der Probe und 10 μl Folin-Ciocalteu-Reagenz gegeben.
      ACHTUNG: Beachten Sie das Sicherheitsdatenblatt des vom Lieferanten gelieferten Folin-Ciocalteu-Reagenz.
   2. Nach 2 min werden 30 μl Na2CO3 (20 %) zugegeben.
   3. Nach 1 h Inkubation im Dunkeln bei RT werden die Proben spektrophotometrisch bei 755 nm gemessen.
   4. Verwenden Sie Gallussäure (mit der die Kalibrierungskurve gezeichnet werden kann) oder Reinstwasser (2 μl) als Kontrollen.
   5. Die Ergebnisse werden als Gallussäure-Äquivalente (mg GAE/g-Extrakt) ausgedrückt.
2. 2,2 Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) Radikalfängeraktivität
   HINWEIS: Die antioxidative Aktivität der Extrakte wird wie von Duan et al. (2006)²⁴ beschrieben bewertet, angepasst an die Mikroskala
   1. In eine lichtgeschützte 96-Well-Mikroplatte geben Sie 2 μl jeder Probe (in einer Konzentration von 10 mg/ml) und 198 μl DPPH, gelöst in absolutem Ethanol (0,1 mM).
      ACHTUNG: Beachten Sie das vom Lieferanten gelieferte Sicherheitsdatenblatt von DPPH.
   2. Lassen Sie die Reaktion 30 Minuten lang bei RT im Dunkeln laufen. Messen Sie die Absorption bei 517 nm in einem Mikroplatten-Spektralphotometer.
   3. Führen Sie eine Kontrollreaktion mit 2 μl absolutem Ethanol/destilliertem Wasser und 198 μl DPPH-Lösung durch. Führen Sie eine Blindmessung mit 2 μl Extrakt und 198 μl absolutem Ethanol durch.
   4. Drücken Sie die Ergebnisse als Prozentsatz der DPPH-Hemmung mit der folgenden Gleichung aus:
      
      wobei As die Absorption des Algenextrakts, Ab die Absorption der Blindproben und Ac die Absorption der Kontrolle ist.

7. Bewertung der Zytotoxizität in Epidermiszellen

HINWEIS: Die zytotoxische Wirkung der wässrigen und Ethanolextrakte von G. gracilis in vitro wird in menschlichen Keratinozyten (HaCaT-Zellen - 300493) durch den kolorimetrischen MTT-Assay untersucht, wie zuvor beschrieben²⁵. Die Zellen wurden von Cell Lines Services, Germany (CLS) erworben und die Methode wurde in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien und CLS-Anweisungen durchgeführt.
ACHTUNG: Siehe das vom Lieferanten gelieferte Sicherheitsdatenblatt von MTT)

1. Pflege von Zellkulturen
   1. Kultivierung von HaCaT-Zellen in Dulbecco's Modified Eagle High Glucose Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 1 % antibiotischer/antimykotischer Lösung (Amphotericin B, 0,25 mM; Penicillin, 60 mM; Streptomycin, 100 mM).
   2. Verwenden Sie Trypsin-EDTA, um die Zellen zu dissoziieren.
      HINWEIS: Die Subkultur von HaCaT-Zellen wird durchgeführt, nachdem die Zellen eine vollständige Konfluenz erreicht haben.
   3. Die Zellen werden in einer Kammer bei 37 °C mit 5 %_CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit kultiviert.
   4. Subkulturieren Sie die Zellen gemäß den Anweisungen der Biobank, wenn die Kulturen eine Konfluenz von 80 % bis 85 % erreichen.
2. Bewertung der Zytotoxizität
   1. Nach der Aussaat der Zellen in 96-Well-Platten und der Inkubation über Nacht werden die HaCaT-Zellen (4 x 10⁴ Zellen/Well) mit den zuvor in DMSO (100 mg/ml) gelösten getrockneten Extrakten behandelt. Dann werden 2 μl der Extraktlösung zu 198 μl Medium gegeben und die Platten 24 h lang inkubiert.
   2. Entfernen Sie das Kulturmedium und geben Sie 100 μl MTT (0,5 mg/ml) zu den Zellen. Inkubieren Sie die Zellen für 30 Minuten im Dunkeln bei den oben genannten normalen Kulturbedingungen.
   3. Entfernen Sie die MTT-Lösung und lösen Sie die intrazellulären Formazankristalle mit 100 μl DMSO auf.
   4. Messen Sie die Absorption bei 570 nm mit einem Mikroplatten-Reader. Drücken Sie die Ergebnisse als Prozentsatz der unbehandelten Kontrollzellen aus.

8. Innovation in der Lebensmittelindustrie

1. Neues Lebensmittelprodukt: Nudeln mit Algen
   1. Auswahl der Zutaten und Pasta-Formulierung
      HINWEIS: Die Auswahl der Zutaten wurde in Zusammenarbeit mit einer Nudelfirma getroffen. Die Auswahl der Hauptzutaten (siehe Abschnitt 8.2) erfolgte unter Berücksichtigung ihrer leichten Zugänglichkeit und Kompatibilität mit den bestehenden Produktionslinien, wobei Meeresressourcen genutzt wurden, um Nudeln mit Mehrwert zu erhalten.
      1. Entwerfen Sie nach der Auswahl der Inhaltsstoffe die Formulierung nach dem beabsichtigten Nährwert (Quelle von Ballaststoffen, Vitaminen und Mineralstoffen, niedrig gesättigte Fette), indem Sie die theoretische chemische Zusammensetzung der Formulierungen mithilfe einer Tabelle analysieren.
      2. Wenn die theoretischen Voraussetzungen erfüllt sind, fahren Sie mit der Produktion im Labormaßstab fort, wie in Schritt 8.1.2 beschrieben.
      3. Führen Sie einen sensorischen Test mit einem halbgeschulten Panel (>10 Verkoster) durch, um die Notwendigkeit einer Neuformulierung oder die Akzeptanz der Formulierung für die folgenden Schritte zu validieren.
         HINWEIS: Das Gremium wurde zuvor für die Verkostung von Nudeln geschult und bewertete die vorgestellten Rezepturen hedonisch in Bezug auf Eigenschaften wie Aroma, Geschmack, Geruch, Textur und Aussehen.
   2. Herstellung von Teigwaren
      HINWEIS: Produzieren Sie Chifferi-Nudelproben mit einem Nudelextruder.
      1. Mischen Sie im Gerät zuvor definierte Portionen Reismehl, G. gracilis und Chlorella vulgaris und fügen Sie der Mischung etwa 30 % Wasser hinzu.
      2. Um trockene Teigwaren zu erhalten, trocknen Sie Chifferi 42 Minuten lang bei 68 °C, gefolgt von 5 h und 30 Minuten bei 76 °C, wobei ein industrieller Prozess simuliert wird.
      3. Zum Schluss verpacken und vakuumieren Sie die Proben und lagern sie bis zur weiteren Analyse an einem dunklen Ort bei RT.
   3. Nährwertanalyse
      HINWEIS: Für die Analyse des Nährwertprofils sind getrocknete und mazerierte Proben in dreifacher Ausführung zu verwenden.
      1. Rohproteingehalt: Führen Sie den Gesamtprotein-Assay nach der Kjeldahl-Methode durch, die von Duarte et al. (2022) ²⁶ übernommen wurde, und befolgen Sie die Schritte 8.1.3.2-8.1.3.6.
      2. 1,0 g der Probe (oder destilliertes Wasser für den Blind-Assay) genau abwiegen und mit zwei Kjeldahl-Tabletten und 25 ml_H2SO4 inAufschlussröhrchen mischen.
         ACHTUNG: Beachten Sie das vom Lieferanten gelieferte Sicherheitsdatenblatt von H2 SO₄.
      3. Führen Sie den Aufschluss der Proben in einem Kjeldahl-Fermenter bei 220 °C für 30 Minuten durch, gefolgt von 90 Minuten bei 400 °C.
      4. Nach dem Abkühlen auf RT fügt man 80 ml destilliertes Wasser hinzu und destilliert das gebildete Ammoniak zu 30 ml einer 4%igen_{H3BO3-Lösung}, die Bromkresolgrün und Methylrot enthält. Dieser Schritt erfolgt unter alkalischen Bedingungen (Destillation mit 40% NaOH mit einem Kjeldahl-Destilliergerät).
         VORSICHT: Beachten Sie das Sicherheitsdatenblatt der vom Lieferanten gelieferten H3_BO3-Lösung mit Bromkresolgrün, Methylrot und 40 % NaOH.
      5. Die destillierten Proben werden mit HCl 0,1 M titriert, bis ein Farbumschlag zu einem gräulichen Rosa beobachtet wird.
      6. Berechnen Sie den Rohproteingehalt, der durch den Stickstoffgehalt der Probe dargestellt wird, und drücken Sie ihn in g pro 100 g mit der folgenden Gleichung aus:
         
         wobei V_s dem HCl-Volumen (mL) entspricht, das bei der Probentitration verwendet wird; V_b entspricht dem Volumen, das im Rohling verwendet wird; N entspricht der HCl-Normalität; w entspricht dem Probengewicht (g).
      7. Gesamtfettgehalt: Bestimmen Sie den Gesamtfettgehalt mit der Folch-Methode, die von Folch et al. (1957)²⁷ übernommen wurde, nach den Schritten 8.1.3.8-8.1.3.14.
      8. Bereiten Sie das Folch-Reagenz vor, indem Sie CHCl₃ und MeOH in einem Verhältnis von 2:1 (v:v) mischen.
         VORSICHT: Beachten Sie das Sicherheitsdatenblatt des vom Lieferanten gelieferten Folch-Reagenzes.
      9. Zu Reagenzgläsern mit 1 g Aliquot Proben werden 5 ml Folch-Reagenz und 0,8 ml destilliertes Wasser hinzugefügt. 1 Min. in einem Wirbel mischen.
      10. Dann weitere 5 ml Folch-Reagenz hinzufügen und 5 Minuten lang homogenisieren. 1,2 ml 0,8%ige NaCl-Lösung hinzufügen und 2 Minuten lang homogenisieren_.
      11. Die Proben werden bei 7000 x g für 10 min zentrifugiert. Die organische Phase (untere Phase) wird durch hydrophile Baumwolle und wasserfreies Natriumsulfat in einen Glaskolben mit rundem Boden filtriert.
      12. Um Probenverluste zu vermeiden, wiederholen Sie die Schritte der Zugabe von 5 ml CHCl₃, der Homogenisierung, Zentrifugation und Filtration unter den gleichen Bedingungen.
      13. Das organische Lösungsmittel wird durch Niederdruckverdampfung aus den gesammelten organischen Phasen entfernt und 4 h bei 105 °C im Ofen gelassen. Kühlen Sie die Proben in einem Exsikkator ab.
      14. Berechnen Sie den Fettgehalt, ausgedrückt in g pro 100 g, mit der folgenden Gleichung:
          
          wobei W₁ das Gewicht des leeren Glaskolbens mit rundem Boden ist; W₂ ist das Ausgangsgewicht der Probe; W₃ ist der Glaskolben mit rundem Boden und dem Probengewicht.
      15. Rohfasergehalt: Bestimmung des Rohfasergehalts nach einer von ISO 6865 (2000) ²⁸ übernommenen Methode gemäß den Schritten 8.1.3.16-8.1.3.22.
      16. 1 g der Probe (W0) wird in einen Glastiegel mit Filterboden (Referenz P2) eingewogen und in den Faseranalysator gegeben.
      17. Der erste Schritt ist die Säurehydrolyse: 150 ml 1,25 %_H2SO4, vorgewärmt, und 2 ml Antischaummittel (n-Octanol) in die Säule jedes Tiegels geben; Bis zum Kochen erhitzen und 30 Minuten ruhen lassen.
      18. Nach dem Entfernen dieses Lösungsmittels dreimal mit deionisiertem Wasser waschen, um mit der basischen Hydrolyse fortzufahren. Geben Sie 150 ml 1,25 % vorgewärmtes NaOH und 5 ml Antischaummittel in die flüssigkeitsfreie Säule und führen Sie den gleichen Erhitzungsvorgang wie bei der Säurehydrolyse durch.
      19. Zum Schluss machen Sie eine dreifache Wäsche mit 150 ml Aceton für die Kaltextraktion.
      20. Nach diesem Vorgang werden die Tiegel vorsichtig aus dem System entnommen und für 1 h bei 150 °C in den Ofen gegeben. Notieren Sie das Endgewicht (W1).
      21. Die Tiegel werden für 3 h bei 500 °C in einen Muffelofen gestellt und anschließend das Endgewicht (W2) notiert.
      22. Berechnen Sie den Rohfasergehalt und drücken Sie die Ergebnisse in Prozent mit der folgenden Gleichung aus:
          % Rohfaser = 100 x (W1-W2)/W0
      23. Fettsäureprofil (FA): Bestimmen Sie das Fettsäureprofil gemäß Fernández et al.(2015)29, indem Sie die Schritte 8.1.3.24-8.1.3.29 befolgen.
          ANMERKUNG: Die Fettsäuremethylester (FAMEs) werden durch direkte säurekatalysierte Transmethylierung der gemahlenen gefriergetrockneten Proben gewonnen. Alle Analysen werden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt.
      24. Zu einer 50 mg Probe werden 2 ml einer 2%igen_{H2SO4-Lösung} in Methanol gegeben und das Gemisch bei 80 °C 2 h lang unter ständigem Rühren eingegossen.
          ACHTUNG: Beachten Sie das Sicherheitsdatenblatt des vom Lieferanten gelieferten Methanols.
      25. Nach dem Abkühlen auf RT wird 1 ml Reinstwasser und 2 ml n-Heptan zu jeder Probe gegeben, das Gemisch 1 Minute lang gewirbelt und 5 Minuten lang zentrifugiert.
          ACHTUNG: Beachten Sie das vom Lieferanten gelieferte Sicherheitsdatenblatt von n-Heptan.
      26. Die obere n-Heptan-Phase (organisch), die die FAMEs enthält, wird zurückgewonnen und in Gaschromatographie-Fläschchen (GC) überführt.
      27. Die Analyse erfolgt in einem Gaschromatographen, der mit einer TR-FAME-Kapillarsäule (60 m × 0,25 mm ID, 0,25 μm Schichtdicke), einem Autosampler und einem Flammenionisationsdetektor (FID) ausgestattet ist.
      28. Stellen Sie den Injektor (Splitless-Modus) auf 250 °C und den Detektor auf 280 °C ein. Stellen Sie die Anfangstemperatur der Säule auf 75 °C ein und halten Sie sie 1 Minute lang. Dann bei 5 °C/min auf 170 °C erhöhen und 10 min halten. Dann bei 5 °C/min auf 190 °C erhöhen und weitere 10 min halten. Zum Schluss bei 2 °C/min auf 240 °C erhöhen und 10 min halten. Verwenden Sie Helium als Trägergas mit einer Durchflussrate von 1,5 ml/min. Zuluft und Wasserstoff mit Durchflussraten von 350 bzw. 35 ml/min.
      29. Bestimmen Sie das FA-Profil, indem Sie die resultierenden Retentionszeiten mit einem Standard vergleichen und die Ergebnisse als Prozentsatz des Gesamtfetts ausdrücken.
      30. Mineralelementprofil: Bestimmen Sie die mit ICP-OES analysierten Mineralelemente (Ca, P, Mg, Na, K, Fe, Cu, Mn, Zn) nach der von Pinto et al. (2022)³⁰ adaptierten Methode und befolgen Sie die Schritte 8.1.3.31-8.1.3.34.
      31. Wiegen Sie etwa 0,4 g jeder trockenen Probe genau ab und fügen Sie 7,5 ml HNO₃ und 2,5 ml HCl hinzu.
          ACHTUNG: Beachten Sie das vom Lieferanten gelieferte Sicherheitsdatenblatt von HNO₃ und HCl.
      32. Der Aufschluss erfolgt in zwei Schritten: Die Temperatur wird in 30 Minuten von RT auf 90 °C erhöht (und weitere 30 Minuten bei dieser Temperatur gehalten), gefolgt von 60 Minuten bei 105 °C.
      33. Kühlen Sie die Probenlösungen ab, verdünnen Sie sie auf 25 ml, filtern Sie sie und bewahren Sie sie in beschrifteten Röhrchen auf. Führen Sie bei jedem Aufschluss den gleichen Prozess mit einem Referenzmaterial und einem Rohling durch. Ermitteln Sie die Konzentration der verschiedenen Elemente mittels ICP-OES.
      34. Die Ergebnisse werden in mg pro 100 g fw ausgedrückt.
      35. Kohlenhydratgehalt: Berechnen Sie den Kohlenhydratgehalt gemäß den Schritten 8.1.3.36-8.1.3.37.
      36. Berechnen Sie den Gehalt an verfügbaren Kohlenhydraten (ohne Ballaststoffe) durch die Differenz der zuvor ermittelten Faktoren pro 100 g nach der folgenden Gleichung gemäß der Ernährungs- und Landwirtschaftsorganisation der Vereinten Nationen (FAO; 2003)³¹
          
      37. Die Ergebnisse werden in g pro 100 g angegeben.
      38. Feuchtigkeits- und Aschegehalt: Schätzen Sie den Feuchtigkeits- und Aschegehalt gemäß den Schritten 8.1.3.39-8.1.3.45.
      39. Porzellantiegel 3 h bei 105 °C inkubieren, in einem Exsikkator abkühlen und wiegen.
      40. 10 g der Probe werden in den Tiegel eingewogen und 3 Stunden lang bei 105 °C in einen Trockenschrank gestellt, bis die Werte der aufeinanderfolgenden Wägungen nicht mehr als 10 mg voneinander abweichen.
      41. Berechnen Sie den Feuchtigkeitsgehalt, ausgedrückt in g pro 100 g fw, mit der folgenden Gleichung:
          
          wobei_W1 das Gewicht des leeren Tiegels,_W2 das Gewicht des Tiegels mit der frischen Probe und W₃ das Gewicht des Tiegels mit der getrockneten Probe ist.
      42. Nach der Feuchtigkeitsgehaltsbestimmung werden die Tiegel mit den getrockneten Proben für 4 h in eine Verbrennungsanlage bei 525 °Cgegeben.
      43. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis sich die aufeinanderfolgenden Gewichtungen nicht mehr als 1 mg unterscheiden.
      44. Kühlen Sie die Proben in einem Exsikkator auf RT ab und wiegen Sie sie dann.
      45. Der Aschegehalt, ausgedrückt in g je 100 g fw, wird nach folgender Gleichung berechnet:
          
          wobei_W1 das Gewicht des leeren Tiegels,_W2 das Gewicht des Tiegels mit frischer Probe, W₃ das Gewicht des Tiegels mit Gewicht ist.
      46. Energiewert: Berechnen Sie den Energiewert gemäß den Schritten 8.1.3.47-8.1.3.48.
      47. Berechnen Sie den energetischen Wert der Proben gemäß der EU-Verordnung: Die Bereitstellung von Lebensmittelinformationen für Verbraucher (Verordnung 1169/2011)³² unter Verwendung der Gleichungen:
          Energie (kcal/ 100 g) = 4 x (g Proteine) + 4 x (g Kohlenhydrate) + 9 x (g Fett) + 2 x (g Ballaststoffe)
          Energie (kJ/ 100 g) = 17 x (g Proteine) + 17 x (g Kohlenhydrate) + 37 x (g Fett) + 8 x (g Ballaststoffe)
      48. Drücken Sie die Ergebnisse in Kilokalorien pro 100 g und Kilojoule pro 100 g aus.
   4. Verbraucherakzeptanz
      1. Bewerten Sie die Verbraucherakzeptanz anhand von Nudelproben, die 8 Minuten lang in destilliertem Wasser gekocht wurden.
      2. Führen Sie einen Verbraucherakzeptanztest durch: Bewerten Sie das visuelle Erscheinungsbild, die Farbe, die Textur, den Geruch, den Meeresgeschmack, den Gesamtgeschmack, die Gesamtbewertung und die Kaufabsicht der Proben.
         HINWEIS: Der Verbraucherakzeptanztest basiert auf hedonischen Tests, bei denen das visuelle Erscheinungsbild, die Farbe, die Textur, der Geruch, der Meeresgeschmack, der Gesamtgeschmack, die Gesamtbewertung und die Kaufabsicht auf einer Skala von 1 bis 9 bewertet werden, wobei 1 eine schlechte Bewertung und 9 eine sehr gute Bewertung ist.
      3. Durchführung von sensorischen Tests in einzelnen sensorischen Kabinen in einem sensorischen Analyselabor (mit Temperatur- und Lichtregelung). Stellen Sie Besteck, Servietten und Glasbecher mit Mineralwasser bereit, um den Gaumen zwischen den Proben zu reinigen.
         HINWEIS: Die Verkoster sind zwischen 16 und 64 Jahre alt und kommen aus allen Bereichen (n > 80).
2. Joghurt
   1. Pigment-Extraktion
      HINWEIS: Führen Sie die Pigmentextraktion mit der in Pereira et al. (2020)¹⁸ beschriebenen Methode durch.
      1. Das Extraktionslösungsmittel, Natriumphosphatpuffer, wird mit 0,1 M Natriumphosphat dibasisch (0,03 M) und einbasischem Natriumphosphat (0,07 M) hergestellt. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH oder HCl auf pH 6,8 ein.
      2. Wiegen Sie 1 g G. gracilis ab und fügen Sie 50 ml Natriumphosphatpuffer (pH 6,8) hinzu. 10 Minuten homogenisieren, gefolgt von 10 Minuten Mazeration mit Mörser und Stößel.
      3. Die Lösung wird in ein Röhrchen überführt und 20 Minuten lang bei 12.298 x g (4 °C) zentrifugiert.
      4. Den Überstand in einem Pool zusammenfassen und langsam 65% Ammoniumsulfat hinzufügen. Wenn das gesamte Ammoniumsulfat gelöst ist, wird die Lösung mit einem Aluminiumblech bedeckt und über Nacht bei 4 °C ausgefällt.
         ACHTUNG: Beachten Sie das vom Lieferanten gelieferte Sicherheitsdatenblatt von Ammoniumsulfat.
      5. Der Niederschlag wird 20 min lang bei 12.298 x g (4 °C) zentrifugiert. Das Pellet wird zurückgewonnen und in destilliertem Wasser (ca. 5 ml) aufgelöst.
      6. Dialyse des Extrakts mit einer Schlauchmembran (14 kDa) gegen Wasser für 24 Stunden, gefolgt von Gefriertrocknung. Lagern Sie den gefriergetrockneten Extrakt bis zur Verwendung lichtgeschützt bei 4 °C.
   2. Zubereitung von Joghurt
      1. Bereiten Sie Naturjoghurt zu, indem Sie 1 l pasteurisierte Milch, 120 g Naturjoghurt, 20 g Zucker und 50 g Milchpulver in einem Thermomixer 5 min, 50 °C, Stufe 3, mischen.
      2. Die Mischung im Thermomixer-Glas bei 37 °C für 12 h in einen Inkubator geben.
      3. Nehmen Sie den Extrakt auf, indem Sie ihn in einer Konzentration von 0,21 % in Joghurt mischen. Lagern Sie die Proben bis zur Analyse in einzelnen Glaskolben bei 4 °C.
      4. Einzelne Portionen Joghurt ohne Pigment (Kontrolle) bis zur Analyse bei 4 °C lagern.
   3. Farbstabilität
      HINWEIS: Bewerten Sie die Stabilität des Pigments in den Joghurts durch Farbanalyse für 12 Tage. Führen Sie eine Farbanalyse mit einem Reflexionskolorimeter, einem 2-Grad-Standardbeobachter und einer D65-Lichtart durch. Die Ergebnisse werden als CIELab-Koordinaten mit den Parametern L (Helligkeit, Schwarz-Weiß, 0 - 100), a* (Grün - Rot, -60 - 60) und b* (Blau - Gelb, -60 - 60) dargestellt. Parameter a* hat positive Werte für rötliche Farben und negative Werte für grünliche Farben. Parameter b* nimmt positive Werte für gelbliche Farben und negative Werte für bläuliche Farben an. L* ist der Parameter der Leuchtkraft, d. h. die Eigenschaft, nach der jede Farbe als äquivalent zu einem Element der Grauskala zwischen Schwarz und Weiß³³ angesehen werden kann.
      1. Kalibrieren Sie das Kolorimeter mit einer weißen Keramikplatte (L* 88,5, a* 0,32, b* 0,33), die vom Hersteller geliefert wird.
      2. Füllen Sie eine Zelle mit ca. 28 g der Probe (oder Kontrolle) und analysieren Sie die Farbe mit einer Farbdatenanalysesoftware.
         HINWEIS: Die für die Farbdatenanalyse verwendete Software war die SpectraMagic NX.
      3. Führen Sie 5 Messwerte in Proben-/Kontrolldreifachen durch.
   4. Sensorische Analyse
      HINWEIS: Führen Sie eine sensorische Bewertung von Joghurts mit Pigmenteinarbeitung mithilfe eines Dreieckstests (ISO 4120, 2004)³⁴ und einer hedonischen Bewertung von Farbe, Geschmack und Gesamtwertschätzung durch.
      1. Geben Sie den Panelisten für den Dreieckstest drei Proben (eine Probe Joghurt mit Pigment und zwei Proben der Kontrolle oder zwei Proben von Joghurt mit Pigment und eine Kontrolle) und bitten Sie sie, eine andere Probe basierend auf Aroma, Textur und Geschmack auszuwählen. Stellen Sie Proben in ähnlichen Volumina zur Verfügung, die mit zufälligen 3-Zahlen-Codes gekennzeichnet sind.
      2. Für die hedonische Bewertung des Joghurts mit Pigment geben Sie den Panelisten eine Probe von Joghurt mit Pigment und bitten Sie sie, die Farbe, den Geschmack und die allgemeine Wertschätzung anhand einer 9-stufigen hedonischen Skala (von extremer Abneigung bis extrem mögen) zu bewerten.

Ergebnisse

Antimikrobielle Aktivität

Bei der Interpretation der erzielten Ergebnisse ist zu berücksichtigen, dass je höher der Prozentsatz der Hemmung ist, desto größer ist die Wirksamkeit des Extrakts bei der Hemmung des Wachstums dieses spezifischen Stammes und desto interessanter ist der Extrakt folglich als antimikrobielles Mittel. Durch diese Methodik können wir schnell feststellen, welche Extrakte eine größer...

Diskussion

Die antimikrobiellen Aktivitätstests in einem flüssigen Medium werden verwendet, um die Wirksamkeit antimikrobieller Substanzen gegen Mikroorganismen zu bewerten, die in einem flüssigen Medium suspendiert sind, und werden in der Regel durchgeführt, um die Fähigkeit einer Substanz zu bestimmen, das Wachstum zu hemmen oder Mikroorganismen abzutöten^35,36,37,38. Sie werden verwendet, um die E...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute Ethanol	Aga, Portugal	64-17-5
Ammonium Chloride	PanReac	12125-02-9
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	1397-89-3
Analytical scale balance	Sartorius, TE124S	22105307
Bacillus subtilis subsp. spizizenii	German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)	DSM 347
Biotin	Panreac AppliChem	58-85-5
Centrifuge	Eppendorf, 5810R	5811JH490481
Chloramphenicol	PanReac	56-75-7
CO2 Chamber	Memmert	N/A
Cool White Fluorescent Lamps	OSRAM Lumilux Skywhite	N/A
Densitometer McFarland	Grant Instruments	N/A
DMEM medium	Sigma-Aldrich	D5796
DMSO	Sigma-Aldrich	67-68-5
DPPH	Sigma, Steinheim, Germany	1898-66-4
Escherichia coli (DSM 5922)	German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)	DSM5922
Ethanol 96%	AGA-Portugal	64-17-5
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA)	J.T.Baker	6381-92-6
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524
Filter Paper (Whatman No.1)	Whatman	WHA1001320
Flasks	VWR International, Alcabideche, Portugal	N/A
Folin-Ciocalteu	VWR Chemicals	31360.264
Gallic Acid	Merck	149-91-7
Germanium (IV) Oxide, 99.999%	AlfaAesar	1310-53-8
HaCaT cells – 300493	CLS-Cell Lines Services, Germany	300493
Hot Plate Magnetic Stirrer	IKA, C-MAG HS7	06.090564
Iron Sulfate	VWR Chemicals	10124-49-9
Laminar flow hood	TelStar, Portugal	526013
LB Medium	VWR Chemicals	J106
Listonella anguillarum	German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)	DSM 21597
Manganese Chloride	VWR Chemicals	7773.01.5
Micropipettes	Eppendorf, Portugal	N/A
Microplates	VWR International, Alcabideche, Portugal	10861-666
Microplates	Greiner	738-0168
Microplates (sterile)	Fisher Scientific	10022403
Microplate reader	Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA	1611151E
MTT	Sigma-Aldrich	289-93-1
Muller-Hinton Broth (MHB)	VWR Chemicals	90004-658
Oven	Binder, FD115	12-04490
Oven	Binder, BD115	04-62615
Penicillin	Sigma-Aldrich	1406-05-9
pH meter Inolab	VWR International, Alcabideche, Portugal	15212099
Pippete tips	Eppendorf, Portugal	5412307
Pyrex Bottles Media Storage	VWR International, Alcabideche, Portugal	16157-169
Rotary Evaporator	Heidolph, Laborota 4000	80409287
Rotavapor	IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal	07.524254
Sodium Carbonate (Na2CO3)	Chem-Lab	497-19-8
Sodium Chloride (NaCl)	Normax Chem	7647-14-5
Sodium Phosphate Dibasic	Riedel-de Haën	7558-79-4
SpectraMagic NX	Konica Minolta, Japan		color data analysis software
Spectrophotometer	Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA	5A4T092004
Streptomycin	Sigma-Aldrich	57-92-1
Thiamine	Panreac AppliChem	59-43-8
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049
Tryptic Soy Agar (TSA)	VWR Chemicals	ICNA091010617
Tryptic Soy Broth (TSB)	VWR Chemicals	22091
Ultrapure water	Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany	F5HA17360B
Vacuum pump	Buchi, Switzerland	FIS05-402-103
Vitamin B12	Merck	68-19-9