使用自动化液体处理对黄化玉米叶原生质体进行高通量转基因表达研究

摘要

该方案描述了使用自动液体处理器创建随机转染布局、用于黄化玉米叶的原生质体分离方案以及使用液体处理器的 96 孔转染程序。

摘要

近年来，植物生物技术领域取得了显着进步，彻底改变了为各种目的纵和工程植物的能力。然而，随着该领域研究的多样性增加和日益复杂，对早期、高效、可靠和高通量瞬时筛选解决方案的需求更加明显，以缩小实现稳定转化的策略。近年来重新出现的一种方法是利用植物原生质体，其分离和转染方法可用于许多物种、组织和发育阶段。这项工作描述了一种在 96 孔板内随机制备质粒的简单自动化方案、一种分离黄化玉米叶原生质体的方法以及一种自动转染程序。 在植物生物技术中采用自动化解决方案，以这些用于植物原生质体转染的新型液体处理方案为例，代表了对手动方法的重大进步。通过利用自动化，研究人员可以轻松克服传统方法的局限性，提高效率并加速科学进步。

引言

植物原生质体转染，即将外来遗传物质引入没有细胞壁的植物细胞中，是一项关键技术，在过去的半个世纪中，它涵盖了许多物种，以支持植物生物技术研究。然而，这些方法的使用可能是痛苦的并且范围有限，即使每次分离会产生数百万个原生质体。传统的植物原生质体转染方法通常费力、耗时、易产生变异性且技术要求高，导致生态位系统重现性低¹。然而，近年来自动化解决方案带来的潜力为这项拥有 60 年历史的年轻技术注入新活力的可能性 ^2,3。由于有可能自动执行关键但重复的步骤，例如材料制备、聚乙二醇 （PEG） 孵育和随后的转染试剂分配，研究人员可以显著降低物理处理要求和人为错误的其他潜在来源⁴。此外，自动化液体处理系统提供的精确控制和均一性确保了一致且可重现的转染结果。

原生质体分离是一个细致的过程，涉及切碎、消化、孵育、过滤和离心，而这些方案的转染部分是为自动化液体处理器量身定制的。大多数原生质体转染方案的程序是 PEG 介导的，将分离的原生质体在 PEG 和纯化质粒 DNA 存在下以精确浓度（取决于物种和组织）混合指定持续时间，可使这些细胞吸收质粒 DNA⁵。转染后进行一系列洗涤步骤，最终进行过夜孵育⁶。潜伏期过后，如果一切都设计正确且交付正确，则实验将导致目标组分的表达和/或评估不同调节组分的潜力⁷。与此程序相关的所有吸液、分液和搅拌/混合步骤通常由手动移液器处理。手动执行此类方案（一次一个单独的反应）非常费力，并且会在样品之间引入不必要的变化，同时还会限制在任何给定时间可评估的容量。制药工业中用于纵哺乳动物或昆虫细胞和化学合成的自动化方案已经实践了几年 ^4,8,9。原生质体利用和涉及植物材料自动液体处理的方案正在上升 10,11,12,13。

采用自动化液体处理方案进行植物原生质体转染为研究应用带来了巨大的前景。研究人员可以探索更大的遗传文库，加速筛选特定基因功能，并更全面地研究与植物胁迫相关的复杂遗传相互作用¹⁴。利用 96 孔舱与荧光筛选相结合的自动化方法的可扩展性可实现高通量实验，并使科学家能够快速生成数据和见解，从而推动植物生物技术的进步¹¹。然而，随着通量的增加，导致生成数百甚至数千个数据点，必须进行额外的质量控制，以解决任何可能混淆结果的错误来源¹⁵。在许多科学学科中，一个已被确定为影响因素的因素是边缘效应。一些缓解策略会建议最好的板使用或用水填充井间空间或最外层的井来对抗这种现象^16,17。然而，这些策略会增加时间，如果特定的一次性产品不可用，唯一的选择是减少或推迟。或者，通过阻塞方案查看考虑这种影响的策略不会牺牲吞吐量或执行延迟。

这种黄化玉米叶片原生质体方案及其 图 1 中所示的两种自动化方法旨在通过自动化经典原生质体方法的多个部分、将质粒材料分配给用于转染的容器以及转染本身来解决原生质体实验固有的可变性。这些方法在黄化玉米叶原生质体平台上得到了证明，因为它是一个特征明确、简单且高效的原生质体平台。其中详述的所有步骤都可以立即用于原生质体转染方案，该方案使用相似或相同的缓冲液溶液。然而，在采用这些技术之前，应特别注意原生质体来源组织和物种的独特特性。这些通过自动化进行的改进简化了用于单个实验的材料制备，并显著提高了通量，从逐个顺序转染到同时处理 96 个转染。这项工作还将展示使用随机不完整块来解释板位置偏差的合理性。

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研究方案

1. 转染板创建

1. 工作台布局创建：要创建 DNA 板随机化方法，请打开液体处理器软件。单击菜单栏中的 New Method 按钮以创建新方法。通过按左侧面板上的 Instrument Setup（仪器设置）按钮，在 Start（开始）和 Finish（结束）行之间添加 Instrument Setup（仪器设置）行。
   注意：与此自动化协议一起遵循的相关屏幕截图可以在 补充图 1、补充图 2 和 补充图 3 中找到。
2. 单击 仪器设置 行，从 实验室器皿类别 菜单中找到正确的实验室器皿，然后将它们拖到工作台布局上，如 补充图 1 所示。
   注意：如果实验室器皿之前未定义，则需要根据制造商的规格将其编程到液体处理器中，但此类说明不在本协议的范围内。
3. 从文件设置传输：按步骤调色板中的 “从文件传输 ”按钮，然后将“ 从文件传输 ”行放在“仪器设置”行下方。确保尖端的选择和更换如 补充图 3 所示。
4. 选中 File has a header row 并确保列信息正确。
5. 按 Source 区域将其激活，然后单击 Source Plate 中的台 面布局，定义目标板，并输入要移液的 DNA 量。
6. 按 Customize 按钮详细定义移液技术，例如吸头接触墙壁。
7. 指定要转移的质粒 DNA 的量。该方案每次转染（孔）使用 20 μL 1 μg/μL 质粒 DNA。
   注：在原生质体转染之前转移到转染板中的质粒 DNA 量将取决于所使用的原生质体平台。
8. 创建 从文件.csv文档的传输 。
   1. 本文档由两列组成。准备第一列，即 From 列，它指示储备质粒 DNA 在试管架内的位置，即样品 1;这将是 A01。由于此转移发生 3 次（3 次），因此在 From 列中应有三行表示 A01。
   2. 准备第二列，即 To 列，用于指定 96 孔板的质粒构建目标孔。例如，样本 1 （A01） 可以是 B02、D04 和 H07。将其另存为 .csv 文件，以便与液体处理器软件兼容。
9. 在运行方案之前，请检查工作台位置是否已加载，实验室器皿是否定义正确，随机化文件包括试管架中所有样品 DNA 的孔位置，以及试管中是否有足够的质粒样品来执行方案。
10. 展开 Transfer From File 步骤的 File Properties 菜单，选择创建的 .csv 文件并运行协议。
11. 方案成功完成后，用铝箔密封盖住转染板。将转染板储存在 -20 °C 直至准备使用。在步骤 3.3 中，分离的黄化玉米叶原生质体将添加到该转染板中。

2. 黄化玉米叶原生质体分离

1. 为了开始分离黄化玉米叶原生质体，获得原生质体相容的遗传背景，例如此处使用的 NP222¹⁸。在实验开始前，仅准备 表 1 中列出的 3 种缓冲液，即 MMg、W5 和 WI 缓冲液，并保持在 4 °C。 在实验当天准备消化液和 PEG 以获得最佳结果。
2. 首先将 25 颗种子浸入 25% 商业漂白剂溶液中，然后在旋转平台振荡器上在室温下摇动约 15 至 20 分钟，对它们进行表面灭菌。
3. 搅拌后，使用无菌水 （DI） 彻底冲洗种子。重复漂洗步骤 5 次。将种子在室温下用无菌水中浸泡过夜。
4. 第二天将种子播种在潮湿、高压灭菌的土壤上。添加干粘土颗粒以吸走土壤中多余的水分，以防止真菌污染。
5. 将玉米幼苗在 28 °C（相对湿度 （RH） 为 30%）的 16 小时光照生长室中生长约 3 天，直到胚芽鞘高于土壤 1-2 厘米，然后转移到具有相同温度和 RH 的暗室中再生长 5 - 7 天。
6. 通过在第一个项圈上方切割第一个真正的叶组织来收获第一个真正的叶组织。
7. 在 25% 商业漂白剂和 250 μL 20% 吐温 20 溶液中对叶组织进行短暂表面消毒 1 分钟。用去离子水彻底冲洗叶子材料 5 次。
8. 用无绒纸巾拍干（轻轻）玉米叶组织，并使用锋利的刀片从每个叶片的尖端和底部去除 ~1.5 厘米。
9. 将剩余的叶组织切成窄 （0.5 mm - 1 mm） 的横向条，并放入 100 x 25 mm 培养皿中。
10. 通过 0.22 μm 注射器过滤器将 25 mL 消化溶液直接过滤到含有切片组织的培养皿中。
11. 通过在真空干燥器中以大约 -75 mbar 的压力在室温下施加真空 30 分钟，用消化溶液真空渗透叶组织。
    注意：许多学术和私人实验室的室内真空压力应该足以完成此步骤。
12. 置于旋转平台振荡器上，在 25 °C 下黑暗中以 60 RPM 摇动 2.5 至 3 小时。当距离消化期结束还有 10 分钟时，将速度提高到 90 RPM。
13. 将消化液和任何未消化的植物材料通过 40 μm 筛网过滤器顶部的漏斗倒入 50 mL 试管中。
14. 将 50 mL 试管内的溶液以 150 x g 离心 4 分钟，使原生质体沉淀。去除上清液，将沉淀重悬于 10 - 15 mL MMg 缓冲液中。
15. 重复离心并去除上清液。重悬于 5 - 10 mL 新鲜 MMg 缓冲液中。
16. 使用血细胞计数器，仔细测量分离的原生质体的密度。重悬至大约 5 x 10⁵ 个原生质体/mL 的密度。
17. 转染前，将分离物在冰上静置 ~30 分钟。在此期间，准备 PEG 溶液。使用 37 °C 水浴将 PEG 完全溶解到溶液中，并放置至转染。

3. 自动化原生质体转染

注：步骤 3.6 至 3.15 完全由自动液体处理器管理，但步骤 3.10 和 3.13 处的两个用户暂停需要手动离心。与该自动化方案相关的屏幕截图可以在补充 、补充图 1、补充图 3、补充图 4 和 补充图 5 中找到。

1. 根据以下步骤中描述的原生质体转染方法，准备用于转染的液体处理器的甲板布局。组装以下材料：目标板（在本例中为 96 孔黑色，底部透明微孔板用于荧光测量），一盒 25 - 250 μL 大口径自动化吸头，用于 PEG 吸液步骤，五盒 25 - 250 μL 移液器自动化吸头，用于其余液体处理步骤，三个塑料槽作为试剂储液槽， 一个用于废液收集的空 96 孔板、剩余的转染缓冲液洗涤液、W5 和 WI。
2. 在转染程序开始之前，通过 0.22 μm 无菌一次性真空过滤装置将 PEG 溶液过滤消毒到新的 50 mL 试管中。
3. 从重悬于 MMg 缓冲液中的原生质体中，向预先制备的解冻转染板的每个孔中加入 100 μL（约 50,000 个原生质体）。为此，将含有原生质体的缓冲溶液倒入无菌的 10 mL 槽中，并使用多通道移液器。在此手动转移步骤中，继续轻轻搅拌槽，以防止原生质体从溶液中沉淀出来。
4. 将 PEG 溶液倒入适当的槽中，然后根据甲板布局将转染板（现在包含原生质体和含有转染板的质粒 DNA）放置到指定位置，该转染板现在包含使用步骤 1 制备的转染板。
5. 要创建原生质体转染方法，请打开 Liquid Handler 软件并执行下述步骤。
   1. 在样品台之间移动实验室器皿：使用移动实验室器皿命令，将吸头上样台上的空吸头盒更换为新的吸头盒。从 Configuration 视图中选择 From 和 To decks。
   2. 对于大于 200 μL 的体积：请勿在两次转移之间更换吸头。第一个传输步骤的加载提示和最后一个传输步骤之后的卸载，这需要为每个传输步骤正确指定 Loading/Unloading 选项，如 补充图 3 所示。
6. 工作台布局创建：与转染板创建方法一样，要创建 DNA 自动转染方法，请打开液体处理器软件。点击 新方法 菜单栏中的按钮创建新方法。按下左侧面板上的 Instrument Setup（仪器设置）按钮，在 Start （开始） 和 Finish（结束）行之间添加 Instrument Setup（仪器设置）行。根据补充图 1 中所示的甲板布局创建甲板布局。
7. 细胞/DNA 混合：在添加 PEG 之前，使用 “设备作 ”按钮并设置设备（振荡自动实验室器具定位器或 ALP）、振荡速度 （1500 rpm） 和振荡时间 （10 s），添加一个步骤以混合原生质体和 DNA。
8. PEG 添加和混合：要开始转染，添加一个转移步骤，使用 96 吊舱移液管从 PEG 储液槽中加入 110 μL PEG。确保根据指定的卡座布局对正确的源和目标位置进行编程。对转移步骤进行编程，从储液槽底部吸出 PEG 1 mm，并将 PEG 从含有原生质体/DNA 混合物的 96 孔板底部沉积 3 mm。通过复制和粘贴先前编程的步骤，在添加 PEG 后添加另一个振荡步骤。
9. PEG 孵育：通过选择 Pause（暂停 ）按钮添加暂停步骤，选择摇床，然后输入预先确定的孵育时间（从 PEG 添加开始）。
   注意：暂停计时器将继续运行，除非存在任何光幕中断或会导致错误消息的中断。确保在必要作 deck 时，在离开之前清除这些消息。
10. W5 缓冲液添加/混合：添加 3 行 200 μL 的转移线，将总共 600 μL 的 W5 缓冲液转移至转染板中，以淬灭 PEG 孵育反应。加入 W5 缓冲液后，通过摇动和用户暂停以允许离心转染板。
11. 用户暂停 1：将原生质体转染板以 100 x g 离心 4 分钟。将转染板（现在已包含沉淀的原生质体）放回适当的卡板位置。通过单击 Pause 按钮添加用户暂停，但现在 Pause the whole system and display the message 选项已选中。
    注：在液体处理器继续执行其余方案之前，需要清除暂停消息弹出窗口。
12. 去除上清液：添加两行转移以去除 400 μL 上清液并转移至废液板。为避免在去除上清液期间误吸细胞，请将与底部的距离设置为 6 mm。
13. WI 添加/混合 添加 3 行转移，将 580 μL WI 缓冲液转移至转染板中。通过复制和粘贴先前编程的步骤，在 WI 添加后添加另一个振荡步骤。继续执行下一个用户暂停。
14. 用户暂停 2：将原生质体转染板以 100 x g 离心 4 分钟。将转染板（现在已包含沉淀的原生质体）放回适当的卡板位置。
15. 去除上清液：添加四行转移以去除 680 μL 上清液并转移至废液板。为避免在去除上清液期间误吸细胞，请将与底部的距离设置为 6 mm。
16. 将原生质体转移到微孔板：该方案的最终转移由两个 150 μL 转移步骤组成。在每个单独的步骤之前，在距转染板底部 2 mm 处以 50 μL/s 的速度重复吸出原生质体，并在 3 mm 处分液。然后，使用相同的移液器吸头，转移到目标微孔板。
    注：在转移到微孔板之前，吸取和分配高于沉淀的缓冲液体积会干扰沉淀在转染板底部的任何剩余原生质体，以确保没有样品损失。由于随机化是在转染板创建过程中完成的，因此自动化方案到此结束。
17. 在第一次荧光测量之前，将微孔板在室温下避光孵育 24 至 48 小时。

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结果

获得支持边缘效应可能影响响应测量的观测数据;进行了一项试点研究来证实这些怀疑。在本研究中，将上述方法应用于三个重复的 96 孔板，只有一个处理水平;使用 pSYN11250 19 转染所有原生质体，pSYN11250¹⁹ 是一种组成型表达 ZsGreen 的质粒，目的是显示与第二行相比，板边缘的单元和板的中心区域在响应水平上存在系统差异。板外边缘的 36 个孔定义为模块...

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讨论

本手稿描述了一种通过自动转染自动创建转染板和黄化玉米叶原生质体分离的方案。为了成功完成方案的转染板创建部分，需要一个配备 8 通道 pod 的自动化液体处理机器人。对于转染方案，建议使用 96 孔 pod 进行完整且均匀的 96 孔板转染。转染方法可以使用 8 通道 pod 完成，但需要特别考虑吸液和分液步骤所需的时间，以及可归因于更换色谱柱吸头的时间。有充分证据?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
(2)β-mercaptoethanol	Sigma	M6250
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrate	Sigma	69892
50mL centrifuge tubes with flat cap sterile	Fisher	22-010-064
96 Well Optical Btm Plt PolymerBase Black w/Lid Cell Culture Sterile PS .4mL Well	Fisher	12-566-70
Axygen Biomek FX/NX Robotic Tips, non-sterile, Wide Bore	Fisher	14-222-096
Axygen Robotic Tips 30uL filter, sterile, racked	Fisher	14-222-103
Bel-Art SP Scienceware Lab Companion Round Style Vacuum Desiccators	Fisher	08-648-10
Bemis 2 IN. X 250 Ft. Roll Laboratory Parafilm	Fisher	13-374-16
Biomek FXP	Beckman Coulter	902508
Calcium chloride dihydrate	Sigma	C5080
Chemglass Life Sciences Disposable Hemocytometer	Fisher	50-131-1352
Clorox Germicidal Bleach, Concentrated	Fisher	NC1871274
Corning Microplate Aluminum Sealing Tape	Fisher	07-200-684
Corning 96-Well assay Blocks, 2mL, 96 well standard	Fisher	07-200-701
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	10197777001
D-Mannitol	Sigma	M9546
Fisherbrand 60mL Plastic Syringe	Fisher	14-955-461
Fisherbrand Sterile Cell Strainer 40um	Fisher	22-363-547
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, Stackable, 100 mm x 25 mm, Case of 325	Fisher	FB0875711
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	M2670
Millex Syringe-driven Filter Unit Sterile 33mm PES .22um	Fisher	SLGPR33RS
Millex Syringe-driven Filter Unit Sterile 33mm PVDF.45um	Fisher	SLHAR33SS
MillliporeSigma Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units 50mL PES	Fisher	SCGP00525
Poly(ethylene glycol) 4000	Sigma	81240
Redi-Earth Plug & Seedling Mix	Wyatt Quarles	GP92747
Regular Duty Single Edge Razor Blades steel back .009RD	Fisher	12-640
Research Products International Corp Cellulase RS	Fisher	50-213-232
Research Products International Corp Macerozyme R-10	Fisher	50-213-444
Sodium chloride	Sigma	S7653
Tray Insert - 36 Cell - 6x6 Nested	Hummert	11635000
Tween-20	Sigma	P1379
VACUUBRAND ME1 Vacuum Pump, 100-120V, 50/60 Hz, US plug	VWR	97058-164