Réalisation d’études d’expression de transgènes à haut débit à l’aide de la manipulation automatisée de liquides pour les protoplastes de feuilles de maïs étiolées

Résumé

Ce protocole décrit la création d’un schéma de transfection aléatoire à l’aide d’un manipulateur de liquide automatisé, d’un protocole d’isolement du protoplaste pour les feuilles de maïs étiolées et d’une procédure de transfection à 96 puits à l’aide d’un manipulateur de liquide.

Résumé

Le domaine de la biotechnologie végétale a connu des progrès remarquables ces dernières années, révolutionnant la capacité de manipuler et d’organiser des plantes à diverses fins. Cependant, à mesure que la recherche dans ce domaine gagne en diversité et devient de plus en plus sophistiquée, le besoin de solutions de dépistage transitoire précoces, efficaces, fiables et à haut débit pour affiner les stratégies menant à une transformation stable est plus évident. Une méthode qui a réapparu ces dernières années est l’utilisation du protoplaste végétal, pour lequel des méthodes d’isolement et de transfection sont disponibles dans de nombreuses espèces, tissus et stades de développement. Ce travail décrit un protocole automatisé simple pour la préparation aléatoire d’un plasmide dans une plaque de 96 puits, une méthode pour l’isolement du protoplaste de feuille de maïs étiolée et une procédure de transfection automatisée. L’adoption de solutions automatisées en biotechnologie végétale, illustrée par ces nouveaux protocoles de manipulation des liquides pour la transfection des protoplastes végétaux, représente une avancée significative par rapport aux méthodes manuelles. En tirant parti de l’automatisation, les chercheurs peuvent facilement surmonter les limites des méthodes traditionnelles, améliorer l’efficacité et accélérer les progrès scientifiques.

Introduction

La transfection de protoplastes végétaux, l’introduction de matériel génétique étranger dans des cellules végétales dépourvues de parois cellulaires, est une technique essentielle et, au cours du dernier demi-siècle, elle a englobé de nombreuses espèces à l’appui de la recherche en biotechnologie végétale. Cependant, l’utilisation de ces méthodes peut être douloureuse et de portée limitée, même avec des millions de protoplastes produits par isolement. Les méthodes traditionnelles de transfection de protoplastes végétaux sont souvent laborieuses, longues, sujettes à la variabilité et techniquement exigeantes, ce qui conduit à des systèmes de niche à faible reproductibilité¹. Cependant, le potentiel introduit par les solutions automatisées ces dernières années met en lumière la possibilité de donner un nouveau souffle à cette technique vieille de 60 ans ^2,3. Grâce à la possibilité d’automatiser des étapes cruciales mais répétitives telles que la préparation des matériaux, l’incubation du polyéthylène glycol (PEG) et la distribution ultérieure de réactifs par transfection, les chercheurs peuvent réduire considérablement les exigences de manipulation physique et d’autres sources potentielles d’erreur humaine⁴. De plus, le contrôle précis et l’uniformité offerts par les systèmes automatisés de manipulation des liquides garantissent des résultats de transfection cohérents et reproductibles.

Alors que l’isolement des protoplastes est un processus méticuleux qui implique le hachage, la digestion, l’incubation, la filtration et la centrifugation, la partie transfection de ces protocoles est conçue sur mesure pour les manipulateurs de liquides automatisés. La procédure pour la plupart des protocoles de transfection de protoplastes est médiée par le PEG, et le mélange du protoplaste isolé en présence de PEG et d’ADN plasmidique purifié pendant une durée spécifiée à une concentration précise (en fonction de l’espèce et du tissu) permet à ces cellules d’absorber l’ADN plasmidique⁵. Cette transfection est suivie d’une série d’étapes de lavage, qui aboutissent à une incubation d’une nuit⁶. Après la période d’incubation, si tout a été conçu et livré correctement, l’expérience aboutit à l’expression de la composante d’intérêt et/ou au potentiel d’évaluation des différentes composantes réglementaires⁷. Toutes les étapes d’aspiration, de distribution et d’agitation/mélange associées à cette procédure seraient normalement gérées par une pipette manuelle. L’exécution d’un tel protocole à la main, une réaction individuelle à la fois, est laborieuse et introduit des variations inutiles entre les échantillons tout en limitant la capacité pouvant être évaluée à un moment donné. Les protocoles automatisés de manipulation de cellules de mammifères ou d’insectes et de synthèse chimique dans l’industrie pharmaceutique sont en pratique depuis plusieurs années ^4,8,9. L’utilisation de Protoplast et les protocoles impliquant la manipulation automatisée de liquides de matières végétales sont en hausse 10,11,12,13.

L’adoption de protocoles automatisés de manipulation de liquides pour la transfection de protoplastes végétaux est très prometteuse pour les applications de recherche. Les chercheurs peuvent explorer de plus grandes bibliothèques génétiques, dépister des fonctions génétiques spécifiques à un rythme accéléré et étudier plus complètement les interactions génétiques complexes liées au stress des plantes¹⁴. L’évolutivité des approches automatisées utilisant des pods de 96 puits combinée au criblage par fluorescence permet des expériences à haut débit et permet aux scientifiques de générer rapidement des données et des informations qui peuvent alimenter les progrès de la biotechnologie végétale¹¹. Cependant, avec cette augmentation du débit, conduisant à la génération de centaines, voire de milliers de points de données, il doit y avoir un contrôle qualité supplémentaire qui tient compte de toutes les sources d’erreur susceptibles de fausser les résultats¹⁵. L’effet de bord est un élément qui a été identifié comme un facteur contributif dans de nombreuses disciplines scientifiques. Certaines stratégies d’atténuation suggéreront la meilleure plaque à utiliser ou à remplir l’espace entre les puits ou les puits les plus extérieurs avec de l’eau pour lutter contre ce phénomène^16,17. Cependant, ces stratégies ajoutent du temps, et si un jetable spécifique n’est pas disponible, la seule option est de se contenter de moins ou de reporter. Par ailleurs, l’examen des stratégies qui tiennent compte de cet effet via un schéma de blocage ne sacrifie pas le débit ou le délai d’exécution.

Ce protocole de protoplaste de feuille de maïs étiolée et ses deux méthodes automatisées illustrées à la figure 1 cherchent à répondre à la variabilité inhérente aux expériences de protoplaste en automatisant plusieurs parties de la méthode canonique des protoplastes, l’allocation de matériel plasmidique au récipient utilisé pour la transfection et la transfection elle-même. Ces méthodes sont démontrées pour la plate-forme de protoplaste de feuille de maïs étiolée, car il s’agit d’une plate-forme de protoplaste bien caractérisée, simple et efficace. Toutes les étapes détaillées ici sont immédiatement accessibles aux protocoles de transfection protoplaste, qui utilisent des solutions tampons similaires ou identiques. Cependant, une attention particulière aux caractéristiques uniques des tissus et des espèces sources de protoplastes doit être prise en compte avant l’adoption de ces techniques. Ces améliorations grâce à l’automatisation simplifient la préparation du matériel pour des expériences individuelles et améliorent considérablement le débit, passant d’une transfection séquentielle une par une à 96 transfections traitées simultanément. Ce travail montrera également la justification de l’utilisation de blocs incomplets randomisés pour tenir compte du biais de position des plaques.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

1. Création de plaques de transfection

1. Création de l’agencement du deck : pour créer une méthode de randomisation des plaques d’ADN, ouvrez le logiciel de traitement des liquides. Cliquez sur le bouton Nouvelle méthode dans la barre de menu pour créer une nouvelle méthode. Ajoutez une ligne de configuration de l’instrument entre les lignes de début et de fin en appuyant sur le bouton de configuration de l’instrument sur le panneau de gauche.
   REMARQUE : Les captures d’écran pertinentes qui suivent ce protocole automatisé se trouvent dans les figures supplémentaires 1, 2 et 3.
2. Cliquez sur la ligne Instrument Setup (Configuration de l’instrument ), recherchez le matériel de laboratoire approprié dans le menu des catégories Labware et faites-le glisser sur la disposition du pont, comme illustré à la figure supplémentaire 1.
   REMARQUE : Si le matériel de laboratoire n’est pas défini au préalable, il devra être programmé dans le manipulateur de liquide conformément aux spécifications du fabricant, mais ces instructions ne relèvent pas du champ d’application de ce protocole.
3. Transfert à partir de la configuration du fichier : Appuyez sur le bouton Transférer à partir d’un fichier dans les palettes d’étapes et placez la ligne Transférer à partir d’un fichier sous la ligne de configuration de l’instrument. Assurez-vous que la sélection et le remplacement de l’embout sont comme indiqué dans la figure supplémentaire 3.
4. Vérifiez que le fichier a une ligne d’en-tête et assurez-vous que les informations de la colonne sont correctes.
5. Appuyez sur la zone Source pour l’activer et cliquez sur la plaque source dans la disposition de la carte, définissez la plaque cible et saisissez la quantité d’ADN à pipeter.
6. Appuyez sur le bouton Personnaliser pour définir en détail la technique de pipetage, comme les touches de pointe sur la paroi.
7. Spécifiez la quantité d’ADN plasmidique à transférer. Ce protocole utilise 20 μL d’ADN plasmidique de 1 μg/μL par transfection (puits).
   REMARQUE : la quantité d’ADN plasmidique qui est transférée à la plaque de transfection avant la transfection du protoplast dépendra de la plateforme de protoplast utilisée.
8. Créez un transfert à partir d’un fichier .csv document.
   1. Ce document est composé de deux colonnes. Préparez la première colonne, c’est-à-dire la colonne De, qui indique l’emplacement de l’ADN plasmidique de base dans le support de tubes, c’est-à-dire pour l’échantillon 1 ; ce serait bien A01. Comme ce transfert se produit trois fois (trois répétitions), trois rangées doivent indiquer A01 dans la colonne De.
   2. Préparez la deuxième colonne, c’est-à-dire la colonne À, utilisée pour spécifier le puits de destination de la construction plasmidique de la plaque à 96 puits. Par exemple, l’échantillon 1 (A01) pourrait être B02, D04 et H07. Enregistrez-le en tant que fichier .csv pour qu’il soit compatible avec le logiciel de traitement des liquides.
9. Avant d’exécuter le protocole, vérifiez que les positions des ponts sont chargées, que le matériel de laboratoire est correctement défini, que le document de randomisation comprend les emplacements des puits pour tout l’ADN de l’échantillon dans le rack de tubes et qu’il y a suffisamment d’échantillon plasmidique dans les tubes pour exécuter le protocole.
10. Développez le menu Propriétés du fichier de l’étape Transférer à partir d’un fichier, sélectionnez le fichier .csv créé et exécutez le protocole.
11. Couvrir les plaques de transfection d’un sceau en feuille d’aluminium lorsque le protocole a été complété avec succès. Stockez les plaques de transfection à -20 °C jusqu’au moment de l’utiliser. Le protoplaste isolé et étiolé des feuilles de maïs sera ajouté à cette plaque de transfection à l’étape 3.3.

2. Isolement des protoplastes de feuilles de maïs étiolées

1. Pour commencer l’isolement du protoplaste de feuille de maïs étiolée, obtenez un fond génétique compatible avec le protoplaste tel que NP222 qui a été utilisé ici¹⁸. Avant le début de l’expérience, on ne doit préparer que 3 tampons MMg, W5 et WI, à savoir les tampons MMg, W5 et WI, et les conserver à 4 °C. Préparez la solution de digestion et le PEG le jour de l’expérience pour de meilleurs résultats.
2. Stérilisez en surface 25 graines en les immergeant d’abord dans une solution d’eau de Javel commerciale à 25 % et en les secouant sur une plate-forme rotative pendant environ 15 à 20 minutes à température ambiante.
3. Après l’agitation, rincez abondamment les graines à l’aide d’eau stérile (DI). Répétez l’étape de rinçage 5 fois. Buvez les graines dans de l’eau stérile pendant la nuit à température ambiante.
4. Semez la graine sur un sol humide et autoclavé le lendemain. Ajoutez des granulés d’argile sèche pour évacuer l’excès d’humidité du sol afin d’éviter la contamination fongique.
5. Cultivez les plants de maïs dans une chambre de croissance légère de 16 h à 28 °C (humidité relative (HR) de 30 %) pendant environ 3 jours jusqu’à ce que le coléoptile soit à 1 à 2 cm au-dessus du sol, puis transférez-les dans une chambre sombre avec la même température et la même HR pendant 5 à 7 jours supplémentaires.
6. Récoltez le premier vrai tissu foliaire en le coupant juste au-dessus du premier collet.
7. Stériliser brièvement les tissus foliaires avec de l’eau de Javel commerciale à 25 % et 250 μL de solution Tween 20 % pendant 1 min. Rincez abondamment le matériau foliaire 5 fois avec de l’eau DI.
8. Séchez (doucement) le tissu foliaire du maïs avec des tissus non pelucheux et, à l’aide d’une lame tranchante, retirez ~1,5 cm de l’extrémité et de la base de chaque limbe.
9. Coupez le tissu foliaire restant en bandes transversales étroites (0,5 mm - 1 mm) et placez-les dans une boîte de Pétri de 100 x 25 mm.
10. Stérilisez par filtre 25 ml de la solution de digestion à travers un filtre à seringue de 0,22 μm directement dans la boîte de Pétri contenant le tissu tranché.
11. Le vide s’infiltre dans le tissu foliaire avec la solution de digestion en appliquant le vide pendant 30 minutes à température ambiante dans un dessiccateur sous vide à une pression d’environ -75 mbar.
    REMARQUE : La pression du vide domestique pour de nombreux laboratoires universitaires et privés devrait être suffisante pour cette étape.
12. Placer sur un agitateur à plate-forme rotative et agiter à 25 °C dans l’obscurité à 60 tr/min pendant 2,5 à 3 h. Lorsqu’il reste 10 minutes jusqu’à la fin de la période de digestion, augmentez la vitesse à 90 tr/min.
13. Versez la solution de digestion et toute matière végétale non digérée à travers un entonnoir au-dessus d’un filtre à tamis de 40 μm dans un tube de 50 ml.
14. Centrifuger la solution à l’intérieur du tube de 50 mL à 150 x g pendant 4 min pour granuler le protoplaste. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 10 à 15 mL de solution tampon MMg.
15. Répétez la centrifugation et retirez le surnageant. Remettre en suspension dans 5 à 10 mL de tampon MMg frais.
16. À l’aide d’un hémocytomètre, mesurez soigneusement la densité du protoplaste isolé. Remettre en suspension à une densité approximative de 5 x 10⁵ protoplastes par mL.
17. Laisser reposer l’isolat sur de la glace pendant ~30 minutes avant la transfection. Pendant ce temps, préparez la solution PEG. Dissoudre complètement le PEG dans une solution à l’aide d’un bain-marie à 37 °C et le laisser là jusqu’à la transfection.

3. Transfection automatisée de protoplastes

REMARQUE : Les étapes 3.6 à 3.15 sont entièrement gérées par le manipulateur de liquides automatisé, à l’exception des deux pauses de l’utilisateur aux étapes 3.10 et 3.13, qui nécessitent une centrifugation manuelle. Des captures d’écran pertinentes qui suivent ce protocole automatisé se trouvent dans le supplément, la figure supplémentaire 1, la figure supplémentaire 3, la figure supplémentaire 4 et la figure supplémentaire 5.

1. Préparez l’aménagement du plateau de l’appareil de traitement des liquides pour la transfection conformément à la méthode de transfection des protoplastes décrite dans les étapes suivantes. Assemblez les matériaux suivants : Plaque de destination (dans ce cas, il s’agirait d’une plaque noire de 96 puits avec une microplaque inférieure transparente pour la mesure de la fluorescence), une boîte d’embouts d’automatisation à large alésage de 25 à 250 μL pour l’étape d’aspiration PEG, cinq boîtes d’embouts d’automatisation de pipette de 25 à 250 μL pour les étapes de manipulation de liquide restantes, trois auges en plastique comme réservoirs de réactifs, une plaque vide de 96 puits pour la collecte des déchets, les solutions de lavage tampon de transfection restantes, W5 et WI.
2. Immédiatement avant le début de la procédure de transfection, stérilisez la solution de PEG à travers une unité de filtre sous vide stérile jetable de 0,22 μm dans un tube frais de 50 ml.
3. À partir du protoplaste remis en suspension dans le tampon MMg, ajoutez 100 μL (environ 50 000 protoplastes) dans chaque puits de la plaque de transfection prépréparée et décongelée. Pour ce faire, versez la solution tampon contenant du protoplaste dans une auge stérile de 10 ml et utilisez une pipette multicanaux. Continuez à agiter doucement l’auge pour éviter que le protoplaste ne se dépose de la solution pendant cette étape de transfert manuel.
4. Versez la solution de PEG dans l’auge appropriée et déposez la plaque de transfection, contenant maintenant du protoplaste et de l’ADN plasmidique contenant de la plaque de transfection, préparée à l’aide de l’étape 1, à l’endroit spécifié selon la disposition du pont.
5. Pour créer une méthode de transfection protoplaste, ouvrez le logiciel de traitement des liquides et effectuez les étapes décrites ci-dessous.
   1. Déplacement du matériel de laboratoire entre les plateaux : remplacez la boîte d’embouts vide sur le plateau de chargement des embouts par une nouvelle à l’aide de la commande Déplacer le matériel de laboratoire. Sélectionnez les platines De et À dans la vue Configuration .
   2. Pour des volumes supérieurs à 200 μL : Ne pas remplacer les pointes entre les transferts. Chargez les pointes pour la première étape de transfert et déchargez après la dernière étape de transfert, ce qui nécessite que les options de chargement/déchargement soient correctement spécifiées pour chaque étape de transfert, comme dans la figure supplémentaire 3.
6. Création de l’agencement de la plate-forme : à l’instar de la méthode de création de plaques de transfection, pour créer une méthode de transfection automatisée de l’ADN, ouvrez le logiciel de traitement des liquides. Cliquez sur le bouton Nouvelle méthode dans la barre de menu pour créer une nouvelle méthode. Ajoutez une ligne de configuration de l’instrument entre les lignes de début et de fin en appuyant sur le bouton de configuration de l’instrument sur le panneau de gauche. Créez un plan de pont conformément à la disposition de pont illustrée à la figure supplémentaire 1.
7. Mélange cellule/ADN : ajoutez une étape pour mélanger le protoplaste et l’ADN avant l’ajout de PEG à l’aide du bouton d’action de l’appareil et de la configuration de l’appareil (positionneur automatisé de matériel de laboratoire ou ALP), de la vitesse d’agitation (1500 tr/min) et du temps d’agitation (10 s).
8. Ajout et mélange de PEG : Pour initier la transfection, ajoutez une étape de transfert pour ajouter 110 μL de PEG à partir du réservoir de PEG à l’aide d’une pipette à 96 pods. Assurez-vous que les positions correctes de la source et de la destination sont programmées en fonction de la disposition de la platine spécifiée. Programmez l’étape de transfert pour aspirer le PEG à 1 mm du fond du réservoir et déposer le PEG à 3 mm de la base de la plaque de 96 puits contenant le mélange protoplaste/ADN. Ajoutez une autre étape d’agitation après l’ajout de PEG en copiant et collant les étapes précédemment programmées.
9. Incubation PEG : Ajoutez une étape de pause en sélectionnant le bouton Pause , sélectionnez l’agitateur et entrez le temps d’incubation prédéterminé, qui commence à partir de l’ajout de PEG.
   REMARQUE : La minuterie de la pause se poursuivra à moins qu’il n’y ait des interruptions ou des perturbations de la barrière immatérielle qui entraîneraient un message d’erreur. Assurez-vous que si une manipulation du jeu est nécessaire, ces messages sont effacés avant de s’éloigner.
10. Ajout/mélange de tampon W5 : Ajouter trois lignes de transfert de 200 μL pour transférer un total de 600 μL de tampon W5 sur la plaque de transfection pour éteindre la réaction d’incubation PEG. Suivre l’ajout du tampon W5 en secouant et en faisant une pause utilisateur pour permettre la centrifugation de la plaque de transfection.
11. Pause utilisateur 1 : Centrifuger la plaque de transfection de protoplaste à 100 x g pendant 4 min. Remettez la plaque de transfection, maintenant avec du protoplaste granulé, dans la position de pont appropriée. Ajoutez une pause utilisateur en cliquant sur le bouton Pause , sauf maintenant avec l’option Mettre en pause l’ensemble du système et afficher le message sélectionnée.
    REMARQUE : La fenêtre contextuelle du message de pause doit être effacée avant que le manipulateur de liquides puisse continuer avec le reste du protocole.
12. Élimination du surnageant : Ajouter deux lignes de Transfer pour éliminer 400 μL de surnageant et transférer sur la plaque de déchets. Pour éviter l’aspiration cellulaire lors de l’élimination du surnageant, réglez la distance par rapport au bas à 6 mm.
13. Ajout/mélange WI Ajouter 3 lignes de Transfer pour transférer 580 μL de tampon WI sur la plaque de transfection. Ajoutez une autre étape d’agitation après l’ajout de WI en copiant et collant les étapes précédemment programmées. Passez à la prochaine pause utilisateur.
14. Pause utilisateur 2 : Centrifuger la plaque de transfection de protoplast à 100 x g pendant 4 min. Remettez la plaque de transfection, maintenant avec du protoplaste granulé, dans la position de pont appropriée.
15. Élimination du surnageant : Ajouter quatre lignes de transfert pour éliminer 680 μL de surnageant et transférer sur la plaque de déchets. Pour éviter l’aspiration cellulaire lors de l’élimination du surnageant, réglez la distance par rapport au bas à 6 mm.
16. Transfert de protoplastes sur microplaque : Le transfert final de ce protocole est composé de deux étapes de transfert de 150 μL. Avant chaque étape individuelle, aspirez à plusieurs reprises les protoplastes à 50 μL/s à 2 mm du bas de la plaque de transfection et distribuez à 3 mm. Ensuite, à l’aide des mêmes pointes de pipette, transférez dans la microplaque de destination.
    REMARQUE : L’aspiration et la distribution du volume tampon au-dessus de la pastille avant le transfert sur la microplaque perturberont tous les protoplastes restants dans la partie inférieure de la plaque de transfection pour s’assurer qu’il n’y a pas de perte d’échantillon. Étant donné que la randomisation a été effectuée lors de la création de la plaque de transfection, le protocole automatisé est terminé.
17. Incuber la microplaque à température ambiante dans l’obscurité pendant 24 à 48 h avant la première mesure de fluorescence.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Pour obtenir des données d’observation soutenant que les effets de bord peuvent affecter les mesures de réponse ; Une étude pilote a été menée pour confirmer ces soupçons. Pour cette étude, les méthodes ci-dessus ont été appliquées à trois plaques répétées de 96 puits avec un seul niveau de traitement ; tous les protoplastes ont été transfectés à l’aide de pSYN11250¹⁹, un plasmide qui exprime constitutivement ZsGreen, dans le but de montre...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Ce manuscrit décrit un protocole permettant d’automatiser la création de plaques de transfection et l’isolement des protoplastes de feuilles de maïs étiolées avec une transfection automatisée. Pour mener à bien la partie du protocole consacrée à la création de plaques de transfection, il faut un robot automatisé de manipulation de liquides équipé d’une nacelle à 8 canaux. Pour le protocole de transfection, une nacelle de 96 puits est recommandée pour une transfection...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
(2)β-mercaptoethanol	Sigma	M6250
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrate	Sigma	69892
50mL centrifuge tubes with flat cap sterile	Fisher	22-010-064
96 Well Optical Btm Plt PolymerBase Black w/Lid Cell Culture Sterile PS .4mL Well	Fisher	12-566-70
Axygen Biomek FX/NX Robotic Tips, non-sterile, Wide Bore	Fisher	14-222-096
Axygen Robotic Tips 30uL filter, sterile, racked	Fisher	14-222-103
Bel-Art SP Scienceware Lab Companion Round Style Vacuum Desiccators	Fisher	08-648-10
Bemis 2 IN. X 250 Ft. Roll Laboratory Parafilm	Fisher	13-374-16
Biomek FXP	Beckman Coulter	902508
Calcium chloride dihydrate	Sigma	C5080
Chemglass Life Sciences Disposable Hemocytometer	Fisher	50-131-1352
Clorox Germicidal Bleach, Concentrated	Fisher	NC1871274
Corning Microplate Aluminum Sealing Tape	Fisher	07-200-684
Corning 96-Well assay Blocks, 2mL, 96 well standard	Fisher	07-200-701
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	10197777001
D-Mannitol	Sigma	M9546
Fisherbrand 60mL Plastic Syringe	Fisher	14-955-461
Fisherbrand Sterile Cell Strainer 40um	Fisher	22-363-547
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, Stackable, 100 mm x 25 mm, Case of 325	Fisher	FB0875711
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	M2670
Millex Syringe-driven Filter Unit Sterile 33mm PES .22um	Fisher	SLGPR33RS
Millex Syringe-driven Filter Unit Sterile 33mm PVDF.45um	Fisher	SLHAR33SS
MillliporeSigma Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units 50mL PES	Fisher	SCGP00525
Poly(ethylene glycol) 4000	Sigma	81240
Redi-Earth Plug & Seedling Mix	Wyatt Quarles	GP92747
Regular Duty Single Edge Razor Blades steel back .009RD	Fisher	12-640
Research Products International Corp Cellulase RS	Fisher	50-213-232
Research Products International Corp Macerozyme R-10	Fisher	50-213-444
Sodium chloride	Sigma	S7653
Tray Insert - 36 Cell - 6x6 Nested	Hummert	11635000
Tween-20	Sigma	P1379
VACUUBRAND ME1 Vacuum Pump, 100-120V, 50/60 Hz, US plug	VWR	97058-164