Возможность проведения высокопроизводительных исследований экспрессии трансгенов с использованием автоматизированной работы с жидкостями для этиолированных протопластов листьев кукурузы

Резюме

В этом протоколе описывается создание рандомизированной схемы трансфекции с использованием автоматизированного обработчика жидкостей, протокола выделения протопластов для этиолированных листьев кукурузы и 96-луночной процедуры трансфекции с использованием обработчика жидкостей.

Аннотация

В последние годы в области биотехнологии растений произошли замечательные успехи, которые произвели революцию в области манипулирования и конструирования растений для различных целей. Однако по мере того, как исследования в этой области становятся все более разнообразными и все более сложными, потребность в ранних, эффективных, надежных и высокопроизводительных решениях для скрининга переходных процессов для сужения стратегий, ведущих к стабильной трансформации, становится все более очевидной. Одним из методов, появившихся в последние годы, является использование растительных протопластов, для которых методы выделения и трансфекции доступны у многих видов, тканей и стадий развития. В данной работе описывается простой автоматизированный протокол рандомизированного получения плазмиды в 96-луночном планшете, метод выделения этиолированных протопластов листьев кукурузы и автоматизированная процедура трансфекции. Внедрение автоматизированных решений в биотехнологии растений, примером которых являются эти новые протоколы обработки жидкостей для трансфекции растительных протопластов, представляет собой значительный шаг вперед по сравнению с ручными методами. Используя автоматизацию, исследователи могут легко преодолеть ограничения традиционных методов, повысить эффективность и ускорить научный прогресс.

Введение

Трансфекция растительных протопластов, введение чужеродного генетического материала в растительные клетки, лишенные клеточных стенок, является ключевым методом и за последние полвека охватывает множество видов в поддержку исследований в области биотехнологии растений. Тем не менее, использование этих методов может быть болезненным и ограниченным по масштабу, даже при миллионах протопластов, производимых на одну изоляцию. Традиционные методы трансфекции растительных протопластов часто являются трудоемкими, трудоемкими, подверженными изменчивости и технически сложными, что приводит к созданию нишевых систем с низкой воспроизводимостью^. Тем не менее, потенциал, который открывают автоматизированные решения в последние годы, высвечивает возможность вдохнуть новую жизнь в эту 60-летнюю молодую технику ^2,3. Благодаря потенциалу автоматизации критически важных, но повторяющихся этапов, таких как подготовка материала, инкубация полиэтиленгликоля (ПЭГ) и последующее дозирование реагентов для трансфекции, исследователи могут значительно снизить требования к физической обработке и другие потенциальные источники человеческих ошибок^. Кроме того, точный контроль и однородность, обеспечиваемые автоматизированными системами обработки жидкостей, обеспечивают стабильные и воспроизводимые результаты трансфекции.

В то время как выделение протопластов является тщательным процессом, включающим измельчение, сбраживание, инкубацию, фильтрацию и центрифугирование, трансфекционная часть этих протоколов специально разработана для автоматизированных обработчиков жидкостей. Процедура для большинства протоколов трансфекции протопластов является ПЭГ-опосредованной, и смешивание выделенного протопласта в присутствии ПЭГ и очищенной плазмидной ДНК в течение определенного периода времени в точной концентрации (в зависимости от вида и ткани) позволяет этим клеткам поглощать плазмидную ДНК⁵. За этой трансфекцией следует серия этапов промывки, кульминацией которых является ночная инкубация⁶. После инкубационного периода, если все было спроектировано и поставлено должным образом, эксперимент приводит к выражению интересующего компонента и/или потенциалу оценки различных регуляторных компонентов^. Все этапы аспирации, диспенсирования и перемешивания/смешивания, связанные с этой процедурой, обычно выполняются с помощью ручной пипетки. Выполнение такого протокола вручную, по одной отдельной реакции за раз, является трудоемким и вносит ненужные различия между образцами, а также ограничивает емкость, которую можно оценить в любой момент времени. Автоматизированные протоколы манипуляций с клетками млекопитающих или насекомых и химического синтеза в фармацевтической промышленности практикуются уже несколько лет ^4,8,9. Использование протопластов и протоколов, включающих автоматизированную обработку жидких растительных материалов, находится на подъеме 10,11,12,13.

Внедрение автоматизированных протоколов работы с жидкостями для трансфекции растительных протопластов имеет большие перспективы для исследовательских применений. Исследователи могут изучать более обширные генетические библиотеки, проводить скрининг конкретных функций генов в ускоренном темпе и более^{всесторонне исследовать} сложные генетические взаимодействия, связанные со стрессом растений. Масштабируемость автоматизированных подходов с использованием 96-луночных капсул в сочетании с флуоресцентным скринингом позволяет проводить эксперименты с высокой производительностью и позволяет ученым быстро генерировать данные и идеи, которые могут способствовать прогрессу в биотехнологии растений^. Однако с увеличением пропускной способности, приводящим к созданию сотен, если не тысяч точек данных, необходим дополнительный контроль качества, учитывающий любые источники ошибок, которые могут исказить^{результаты.} Одним из элементов, который был определен в качестве фактора, способствующего развитию во многих научных дисциплинах, является эффект края. Некоторые стратегии смягчения последствий предложат наилучшую плиту для использования или заполнения межскважинного пространства или самых внешних скважин водой для борьбы с этим явлением^16,17. Тем не менее, эти стратегии увеличивают время, и если конкретного одноразового продукта нет, единственный вариант — согласиться на меньшее или отложить. С другой стороны, изучение стратегий, которые учитывают этот эффект с помощью схемы блокировки, не приводит к потере пропускной способности или задержки выполнения.

Этот протокол этиолированных протопластов листьев кукурузы и два его автоматизированных метода, показанные на рисунке 1 , направлены на решение проблемы изменчивости, присущей экспериментам с протопластами, путем автоматизации нескольких частей канонического метода протопластов, распределения плазмидного материала в сосуде, используемом для трансфекции, и самой трансфекции. Эти методы продемонстрированы на примере этиолированной платформы протопластов листьев кукурузы, поскольку она является хорошо охарактеризованной, простой и эффективной платформой для протопластов. Все описанные здесь шаги немедленно доступны протоколам трансфекции протопластов, в которых используются аналогичные или те же буферные решения. Тем не менее, особое внимание следует уделить уникальным характеристикам исходной ткани и видов протопластов, прежде чем внедрять эти методы. Эти усовершенствования за счет автоматизации упрощают подготовку материала для отдельных экспериментов и значительно повышают производительность: от последовательной трансфекции по одной до 96 трансфекций, выполняемых одновременно. В этой работе также будет показано обоснование использования рандомизированных неполных блоков для учета смещения положения пластин.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Создание трансфекционной пластины

1. Создание схемы деки: Чтобы создать метод рандомизации ДНК-пластин, откройте программное обеспечение для обработки жидкостей. Нажмите кнопку «Новый метод » в строке меню, чтобы создать новый метод. Добавьте линию Instrument Setup между линиями Start и Finish, нажав кнопку Instrument Setup на левой панели.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующие скриншоты, которые следуют вместе с этим автоматизированным протоколом, можно найти на дополнительном рисунке 1, дополнительном рисунке 2 и дополнительном рисунке 3.
2. Нажмите на строку «Настройка инструмента », найдите нужную лабораторную посуду в меню категории «Лабораторная посуда » и перетащите ее на схему деки, как показано на дополнительном рисунке 1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если лабораторное оборудование ранее не определено, то его необходимо запрограммировать в манипулятор жидкостей в соответствии со спецификацией производителя, но такие инструкции выходят за рамки данного протокола.
3. Настройка переноса из файла: Нажмите кнопку Перенести из файла на палитре шагов и поместите строку Перенести из файла ниже строки Настройка инструмента. Убедитесь, что выбор и замена наконечника показаны на дополнительном рисунке 3.
4. Убедитесь , что в поле Файл есть строка заголовка , и убедитесь, что информация в столбце верна.
5. Нажмите на область источника , чтобы активировать ее, и щелкните на исходной пластине на макете деки, определите целевую пластину и введите количество ДНК для пипетирования.
6. Нажмите кнопку «Настроить», чтобы подробно определить технику пипетирования, например, касаться кончиком стены.
7. Укажите количество плазмидной ДНК для переноса. В этом протоколе используется 20 мкл 1 мкг/мкл плазмидной ДНК на трансфекцию (лунку).
   Примечание: количество плазмидной ДНК, которая переносится на трансфекционную пластину до трансфекции протопластов, будет зависеть от используемой платформы протопластов.
8. Создайте перенос из файла .csv документа.
   1. Этот документ состоит из двух колонок. Подготовьте первый столбец, т.е. столбец From, в котором указано расположение стоковой плазмидной ДНК внутри штатива для пробирок, т.е. для образца 1; это было бы хорошо A01. Поскольку этот перенос происходит три раза (три повторения), три строки должны обозначать A01 в столбце «От».
   2. Подготовьте вторую колонку, т.е. колонку To, используемую для указания ячейки назначения плазмидной конструкции 96-луночного планшета. Например, образцом 1 (A01) могут быть B02, D04 и H07. Сохраните его как файл .csv для совместимости с программным обеспечением для работы с жидкостями.
9. Перед запуском протокола убедитесь, что позиции на палубе загружены, лабораторное оборудование правильно определено, документ рандомизации включает местоположения всех образцов ДНК в штативе для пробирок, а также что в пробирках достаточно образца плазмиды для выполнения протокола.
10. Разверните меню «Свойства файла » на шаге «Передача из файла», выберите .csv созданный файл и запустите протокол.
11. Накройте трансфекционные пластины уплотнителем из алюминиевой фольги, когда протокол будет успешно выполнен. Храните трансфекционные пластины при температуре -20 °C до использования. Изолированный этиолированный протопласт листьев кукурузы будет добавлен в эту трансфекционную пластину на этапе 3.3.

2. Выделение протопластов этиолированных листьев кукурузы

1. Чтобы начать выделение этиолированных протопластов листьев кукурузы, получают совместимый с протопластами генетический фон, такой как NP222, который использовали здесь¹⁸. Перед началом эксперимента подготовьте только 3 буфера, а именно буферы MMg, W5 и WI, перечисленные в таблице 1 , и поддерживайте при температуре 4 °C. Приготовьте раствор для дигезирования и ПЭГ в день эксперимента для достижения наилучших результатов.
2. Поверхностная стерилизация 25 семян путем погружения их в 25% раствор коммерческого отбеливателя и встряхивания на встряхивателе с вращающейся платформой в течение примерно 15-20 минут при комнатной температуре.
3. После перемешивания семена тщательно промойте с помощью стерильной воды (DI). Повторите шаг полоскания 5 раз. Замочите семена в стерильной воде на ночь комнатной температуры.
4. Посейте семена во влажную, автоклавную почву на следующий день. Добавьте сухие глиняные гранулы, чтобы отвести лишнюю влагу из почвы и предотвратить грибковое заражение.
5. Выращивайте рассаду кукурузы в 16-часовой светлой камере для выращивания при температуре 28 °C (относительная влажность (RH) 30%) в течение примерно 3 дней, пока колеоптиля не окажется на высоте 1-2 см над почвой, а затем перенесите в темную камеру с той же температурой и относительной влажностью еще на 5-7 дней.
6. Соберите первую настоящую ткань листьев, разрезав ее чуть выше первого воротника.
7. Поверхность кратковременно простерилизовать в 25% коммерческом отбеливателе и 250 мкл 20% раствора Tween 20 в течение 1 минуты. Тщательно промойте листовой материал 5 раз деионизированной водой.
8. Слегка обсушите ткань листьев кукурузы безворсовыми салфетками и с помощью острого лезвия удалите ~1,5 см как от кончика, так и от основания каждой листовой пластинки.
9. Оставшуюся ткань листа нарежьте узкими (0,5 мм - 1 мм) поперечными полосками и поместите в чашку Петри размером 100 х 25 мм.
10. Отфильтруйте и стерилизуйте 25 мл раствора для сбраживания через шприц-фильтр 0,22 мкм непосредственно в чашку Петри, содержащую нарезанную ткань.
11. Вакуумная инфильтрация тканей листа раствором для сбраживания путем применения вакуума в течение 30 минут при комнатной температуре в вакуумном эксикаторе при давлении примерно -75 мбар.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Давление вакуума в помещении для многочисленных академических и частных лабораторий должно быть достаточным для этого этапа.
12. Поместите на встряхиватель с вращающейся платформой и встряхивайте при температуре 25 °C в темноте со скоростью 60 об/мин в течение 2,5–3 часов. Когда до конца периода сбраживания осталось 10 минут, увеличьте скорость до 90 об/мин.
13. Вылейте раствор для сбраживания и любой непереваренный растительный материал через воронку в верхней части ситового фильтра 40 мкм в пробирку объемом 50 мл.
14. Центрифугируйте раствор внутри пробирки объемом 50 мл при давлении 150 x g в течение 4 минут, чтобы гранулировать протопласт. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 10 - 15 мл раствора MMg Buffer.
15. Повторите центрифугирование и удалите надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте в 5 - 10 мл свежего MMg буфера.
16. С помощью гемоцитометра тщательно измерьте плотность выделенного протопласта. Ресуспендирование до приблизительной плотности 5 x 10⁵ протопластов на мл.
17. Дайте изоляту отдохнуть на льду в течение ~30 минут перед трансфекцией. За это время приготовьте раствор ПЭГ. Полностью растворите ПЭГ в растворе с помощью водяной бани при температуре 37 °C и оставьте его там до трансфекции.

3. Автоматизированная трансфекция протопластов

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги с 3.6 по 3.15 полностью управляются автоматическим обработчиком жидкостей, за исключением двух пользовательских пауз на шагах 3.10 и 3.13, которые требуют ручного центрифугирования. Соответствующие скриншоты, которые следуют вместе с этим автоматизированным протоколом, можно найти в дополнении, Дополнительный рисунок 1, Дополнительный рисунок 3, Дополнительный рисунок 4 и Дополнительный рисунок 5.

1. Подготовьте схему деки манипулятора для обработки жидкостей в соответствии с методом трансфекции протопластов, описанным в следующих шагах. Соберите следующие материалы: конечную пластину (в данном случае это будет 96-луночная черная пластина с прозрачным дном микропластины для измерения флуоресценции), одну коробку с широкими наконечниками для автоматизации объемом 25 - 250 мкл для этапа аспирации ПЭГ, пять коробок с наконечниками для дозатора объемом 25 - 250 мкл для остальных этапов работы с жидкостью, три пластиковых желоба в качестве резервуаров для реагентов, одна пустая 96-луночная пластина для сбора отходов, оставшаяся трансфекционная буферная промывка растворов, W5 и WI.
2. Непосредственно перед началом процедуры трансфекции фильтруйте стерилизующий раствор ПЭГ через стерильную одноразовую вакуумную фильтрующую установку 0,22 мкм в свежую пробирку объемом 50 мл.
3. Из протопласта, ресуспендированного в буфере MMg, добавьте 100 мкл (примерно 50 000 протопластов) в каждую лунку предварительно подготовленной, размороженной трансфекционной пластины. Для этого нужно налить протопластсодержащий буферный раствор в стерильное корыто объемом 10 мл и использовать многоканальную пипетку. Продолжайте осторожное перемешивание желоба, чтобы предотвратить оседание протопласта из раствора во время этого ручного этапа переноса.
4. Налейте раствор ПЭГ в соответствующее корыто и установите трансфекционную пластину, теперь содержащую протопласт и плазмидную ДНК, содержащую трансфекционную пластину, приготовленную на шаге 1, в указанном месте в соответствии с планировкой палубы.
5. Чтобы создать метод трансфекции протопластов, откройте программное обеспечение для обработки жидкостей и выполните описанные ниже действия.
   1. Перемещение лабораторной посуды между палубами: Замените пустой ящик для чаевых на загрузочной палубе на новый с помощью команды «Переместить лабораторную посуду». Выберите колоды From и To в представлении Configuration .
   2. При объемах более 200 μл: Не заменяйте наконечники между пересадками. Загрузите чаевые для первого шага переноса и выгрузите после последнего шага перемещения, что требует правильного указания параметров загрузки/выгрузки для каждого шага перемещения, как показано на дополнительном рисунке 3.
6. Создание макета деки: Как и в случае с методом создания трансфекционной пластины, чтобы создать автоматизированный метод трансфекции ДНК, откройте программное обеспечение для обработки жидкостей. Нажмите кнопку «Новый метод » в строке меню, чтобы создать новый метод. Добавьте линию настройки инструмента между линиями Start и Finish, нажав кнопку Instrument Setup на левой панели. Создайте схему колоды в соответствии с схемой, показанной на дополнительном рисунке 1.
7. Смешивание клеток/ДНК: Добавьте шаг для смешивания протопластов и ДНК перед добавлением ПЭГ с помощью кнопки действия устройства и настройки устройства (встряхивание, автоматического позиционера лабораторной посуды или ALP), скорости встряхивания (1500 об/мин) и времени встряхивания (10 с).
8. Добавление и смешивание ПЭГ: Чтобы начать трансфекцию, добавьте стадию переноса, чтобы добавить 110 мкл ПЭГ из резервуара ПЭГ с помощью пипетки на 96 капсул. Убедитесь, что правильное исходное и конечное положения запрограммированы в соответствии с заданной планировкой деки. Запрограммируйте этап переноса на аспирацию ПЭГ на расстоянии 1 мм от дна резервуара и нанесение ПЭГ на расстоянии 3 мм от основания 96-луночного планшета, содержащего смесь протопласта и ДНК. Добавьте еще один шаг встряхивания после добавления PEG, скопировав и вставив ранее запрограммированные шаги.
9. Инкубация ПЭГ: Добавьте шаг паузы, нажав кнопку «Пауза », выберите шейкер и введите заранее определенное время инкубации, которое начинается с добавления ПЭГ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Таймер для паузы будет продолжаться, если не произойдет каких-либо прерываний или сбоев в работе световой завесы, которые приведут к появлению сообщения об ошибке. Убедитесь, что в случае необходимости манипуляций с колодой эти сообщения были удалены, прежде чем уйти.
10. Добавление/смешивание буфера W5: Добавьте три линии Transfer по 200 μL для переноса в общей сложности 600 μL буфера W5 на трансфекционную пластину для гашения реакции инкубации PEG. После добавления буфера W5 встряхните и сделайте паузу, чтобы обеспечить центрифугирование трансфекционной пластины.
11. Пауза для пользователя 1: Центрифугируйте протопластовую трансфекционную пластину при давлении 100 x g в течение 4 минут. Верните трансфекционную пластину, теперь с гранулированным протопластом, обратно в соответствующее положение деки. Добавьте пользователю паузу нажатием кнопки Пауза , за исключением того, что теперь с помощью паузы вся система и отображение выбранного варианта сообщения .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всплывающее окно с сообщением о паузе должно быть удалено, прежде чем обработчик жидкостей продолжит работу с остальной частью протокола.
12. Удаление надосадочной жидкости: Добавьте две строки Переноса, чтобы удалить 400 μл надосадочной жидкости и перенести на пластину для отходов. Чтобы избежать аспирации клеток во время удаления надосадочной жидкости, установите расстояние от дна 6 мм.
13. Добавление/смешивание WI Добавьте 3 строки Transfer для переноса 580 μL буфера WI на трансфекционную пластину. Добавьте еще один шаг встряхивания после добавления WI, скопировав и вставив ранее запрограммированные шаги. Перейдите к следующей паузе пользователя.
14. Пауза для пользователя 2: Центрифугируйте протопластную трансфекционную пластину при давлении 100 x g в течение 4 минут. Верните трансфекционную пластину, теперь с гранулированным протопластом, обратно в соответствующее положение деки.
15. Удаление надосадочной жидкости: Добавьте четыре строки Переноса, чтобы удалить 680 мкл надосадочной жидкости и перенести на пластину для отходов. Чтобы избежать аспирации клеток во время удаления надосадочной жидкости, установите расстояние от дна 6 мм.
16. Перенос протопластов на микропланшет: Окончательный перенос этого протокола состоит из двух этапов переноса по 150 μL. Перед каждым отдельным этапом повторно аспирируйте протопласты со скоростью 50 мкл/с на расстоянии 2 мм от дна трансфекционной пластины и дозируйте со скоростью 3 мм. Затем, используя те же наконечники для пипетки, перенесите на микропланшет назначения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем буфера для аспирации и дозирования над гранулой перед переносом на микропланшет нарушит все оставшиеся протопласты, гранулированные в нижней части трансфекционной пластины, чтобы гарантировать отсутствие потери образца. Поскольку рандомизация была проведена во время создания трансфекционной пластины, на этом автоматизированный протокол завершен.
17. Инкубируйте микропланшет при комнатной температуре в темноте в течение 24–48 часов перед первым измерением флуоресценции.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Получить данные наблюдений, подтверждающие, что краевые эффекты могут влиять на измерения отклика; Для подтверждения этих подозрений было проведено пилотное исследование. В данном исследовании вышеуказанные методы были применены к трем реплицированным 96-луночным п...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В данной рукописи описан протокол автоматизации создания трансфекционных пластин и выделения этиолированных протопластов листьев кукурузы с помощью автоматизированной трансфекции. Для успешного завершения части протокола, связанной с созданием трансфекционной п...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
(2)β-mercaptoethanol	Sigma	M6250
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrate	Sigma	69892
50mL centrifuge tubes with flat cap sterile	Fisher	22-010-064
96 Well Optical Btm Plt PolymerBase Black w/Lid Cell Culture Sterile PS .4mL Well	Fisher	12-566-70
Axygen Biomek FX/NX Robotic Tips, non-sterile, Wide Bore	Fisher	14-222-096
Axygen Robotic Tips 30uL filter, sterile, racked	Fisher	14-222-103
Bel-Art SP Scienceware Lab Companion Round Style Vacuum Desiccators	Fisher	08-648-10
Bemis 2 IN. X 250 Ft. Roll Laboratory Parafilm	Fisher	13-374-16
Biomek FXP	Beckman Coulter	902508
Calcium chloride dihydrate	Sigma	C5080
Chemglass Life Sciences Disposable Hemocytometer	Fisher	50-131-1352
Clorox Germicidal Bleach, Concentrated	Fisher	NC1871274
Corning Microplate Aluminum Sealing Tape	Fisher	07-200-684
Corning 96-Well assay Blocks, 2mL, 96 well standard	Fisher	07-200-701
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	10197777001
D-Mannitol	Sigma	M9546
Fisherbrand 60mL Plastic Syringe	Fisher	14-955-461
Fisherbrand Sterile Cell Strainer 40um	Fisher	22-363-547
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, Stackable, 100 mm x 25 mm, Case of 325	Fisher	FB0875711
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	M2670
Millex Syringe-driven Filter Unit Sterile 33mm PES .22um	Fisher	SLGPR33RS
Millex Syringe-driven Filter Unit Sterile 33mm PVDF.45um	Fisher	SLHAR33SS
MillliporeSigma Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units 50mL PES	Fisher	SCGP00525
Poly(ethylene glycol) 4000	Sigma	81240
Redi-Earth Plug & Seedling Mix	Wyatt Quarles	GP92747
Regular Duty Single Edge Razor Blades steel back .009RD	Fisher	12-640
Research Products International Corp Cellulase RS	Fisher	50-213-232
Research Products International Corp Macerozyme R-10	Fisher	50-213-444
Sodium chloride	Sigma	S7653
Tray Insert - 36 Cell - 6x6 Nested	Hummert	11635000
Tween-20	Sigma	P1379
VACUUBRAND ME1 Vacuum Pump, 100-120V, 50/60 Hz, US plug	VWR	97058-164