הפעלת מחקרי ביטוי טרנסגנים בתפוקה גבוהה באמצעות טיפול אוטומטי בנוזלים עבור פרוטופלסטים בעלי עלי תירס אטיוליים

Summary

פרוטוקול זה מתאר יצירת פריסת טרנספקציה אקראית באמצעות מטפל נוזלים אוטומטי, פרוטוקול בידוד פרוטופלסט לעלי תירס אטיולטי, והליך טרנספקציה של 96 בארות באמצעות מטפל בנוזלים.

Abstract

תחום הביוטכנולוגיה של הצמח חווה התקדמות יוצאת דופן בשנים האחרונות, שחוללה מהפכה ביכולת לתפעל ולהנדס צמחים למטרות שונות. עם זאת, ככל שהמחקר בתחום זה גדל במגוון והופך מתוחכם יותר ויותר, ברור יותר הצורך בפתרונות סינון חולפים מוקדמים, יעילים, אמינים ובעלי תפוקה גבוהה כדי לצמצם אסטרטגיות המתקדמות לטרנספורמציה יציבה. שיטה אחת שצצה מחדש בשנים האחרונות היא ניצול פרוטופלסט צמחי, שעבורו קיימות שיטות בידוד וטרנספקציה במינים, רקמות ושלבי התפתחות רבים. עבודה זו מתארת פרוטוקול אוטומטי פשוט להכנה אקראית של פלסמיד בתוך צלחת של 96 בארות, שיטה לבידוד של פרוטופלסט עלי תירס אטיולטי, והליך טרנספקציה אוטומטי. אימוץ פתרונות אוטומטיים בביוטכנולוגיה של צמחים, המודגם על ידי פרוטוקולי טיפול בנוזלים חדשניים אלה להעברת פרוטופלסט צמחי, מייצג התקדמות משמעותית על פני שיטות ידניות. על ידי מינוף אוטומציה, חוקרים יכולים להתגבר בקלות על המגבלות של שיטות מסורתיות, לשפר את היעילות ולהאיץ את ההתקדמות המדעית.

Introduction

טרנספקציה של פרוטופלסט צמחי, החדרת חומר גנטי זר לתאי צמחים נטולי דפנות תאים, היא טכניקה מרכזית, ובחצי המאה האחרונה מקיפה מינים רבים התומכים במחקר ביוטכנולוגיה של צמחים. עם זאת, השימוש בשיטות אלו יכול להיות כואב ומוגבל בהיקפו, אפילו עם מיליוני פרוטופלסטים המיוצרים בכל בידוד. שיטות מסורתיות של טרנספקציה של פרוטופלסט צמחי הן לרוב מייגעות, גוזלות זמן, נוטות לשונות ותובעניות מבחינה טכנית, מה שמוביל למערכות נישה עם יכולת שחזור נמוכה¹. עם זאת, הפוטנציאל שהציגו פתרונות אוטומטיים בשנים האחרונות מאיר את האפשרות להפיח חיים חדשים בטכניקה הצעירה הזו בת 60 שנה ^2,3. עם הפוטנציאל של אוטומציה של שלבים חיוניים אך חוזרים על עצמם כגון הכנת חומרים, דגירה של פולי-אתילן גליקול (PEG) וחלוקת ריאגנטים לאחר מכן, חוקרים יכולים להפחית משמעותית את דרישות הטיפול הפיזי ומקורות פוטנציאליים אחרים לטעויות אנוש⁴. יתר על כן, הבקרה המדויקת והאחידות המוצעות על ידי מערכות אוטומטיות לטיפול בנוזלים מבטיחות תוצאות העברה עקביות וניתנות לשחזור.

בעוד שבידוד פרוטופלסט הוא תהליך קפדני הכולל קיצוץ, עיכול, דגירה, סינון וצנטריפוגה, חלק הטרנספקציה של פרוטוקולים אלה מותאם למטפלים בנוזלים אוטומטיים. ההליך עבור רוב פרוטוקולי הטרנספקציה של פרוטופלסט הוא מתווך PEG, וערבוב הפרוטופלסט המבודד בנוכחות PEG ו-DNA פלסמיד מטוהר למשך זמן מוגדר בריכוז מדויק (תלוי במין וברקמה) מאפשר לתאים אלה לקלוט את ה-DNA של הפלסמיד⁵. לאחר טרנספקציה זו באה סדרה של שלבי שטיפה, ששיאם בדגירה של לילה⁶. לאחר תקופת הדגירה, אם הכל תוכנן ונמסר כראוי, הניסוי מביא לביטוי של מרכיב העניין ו/או הפוטנציאל להעריך רכיבים רגולטוריים שונים⁷. כל שלבי השאיפה, החלוקה והתסיסה/ערבוב הקשורים להליך זה יטופלו בדרך כלל על ידי פיפטה ידנית. ביצוע פרוטוקול כזה ביד, תגובה בודדת אחת בכל פעם, הוא מייגע ומציג שונות מיותרת בין הדגימות תוך הגבלת היכולת שניתן להעריך בכל זמן נתון. פרוטוקולים אוטומטיים למניפולציה של תאי יונקים או חרקים וסינתזה כימית בתעשיית התרופות קיימים כבר מספר שנים ^4,8,9. ניצול פרוטופלסט ופרוטוקולים הכוללים טיפול אוטומטי בנוזלים בחומרים צמחיים נמצאים בעלייה 10,11,12,13.

אימוץ פרוטוקולי טיפול אוטומטיים בנוזלים להעברת פרוטופלסט צמחי טומן בחובו הבטחה גדולה ליישומי מחקר. חוקרים יכולים לחקור ספריות גנטיות גדולות יותר, לסנן תפקודי גנים ספציפיים בקצב מואץ, ולחקור אינטראקציות גנטיות מורכבות הקשורות ללחץ^{צמחי באופן} מקיף יותר. יכולת ההרחבה של גישות אוטומטיות המשתמשות בתרמילים של 96 בארות בשילוב עם סינון פלואורסצנטי מאפשרת ניסויים בתפוקה גבוהה ומאפשרת למדענים לייצר במהירות נתונים ותובנות שיכולים להניע התקדמות בביוטכנולוגיה של צמחים¹¹. עם זאת, עם עלייה זו בתפוקה, המובילה ליצירת מאות, אם לא אלפי נקודות נתונים, חייבת להיות בקרת איכות נוספת הלוקחת בחשבון את כל מקורות השגיאה שעלולים לבלבל את התוצאות¹⁵. אלמנט אחד שזוהה כגורם תורם בדיסציפלינות מדעיות רבות הוא אפקט הקצה. כמה אסטרטגיות הקלה יציעו את הצלחת הטובה ביותר לשימוש או מילוי חלל בין בארות או את הבארות החיצוניות ביותר במים כדי להילחם בתופעה^{זו 16,17}. עם זאת, אסטרטגיות אלו מוסיפות זמן, ואם חד פעמי ספציפי אינו זמין, האפשרות היחידה היא להסתפק בפחות או לדחות. לחלופין, הסתכלות על אסטרטגיות שמסבירות את האפקט הזה באמצעות סכימת חסימה אינה מקריבה את התפוקה או העיכוב לביצוע.

פרוטוקול פרוטופלסט עלי תירס אטיולי זה ושתי השיטות האוטומטיות שלו המוצגות באיור 1 מבקשים לטפל בשונות הטבועה בניסויי פרוטופלסט על ידי אוטומציה של חלקים מרובים של שיטת הפרוטופלסט הקנונית, הקצאת חומר פלסמיד לכלי המשמש לטרנספקציה והטרנספקציה עצמה. שיטות אלו מודגמות עבור פלטפורמת הפרוטופלסט של עלי תירס אטיולטים מכיוון שהיא פלטפורמת פרוטופלסט מאופיינת היטב, פשוטה ויעילה. כל השלבים המפורטים בפנים נגישים באופן מיידי לפרוטוקולי טרנספקציה של פרוטופלסט, המשתמשים בפתרונות מאגר דומים או זהים. עם זאת, יש לשקול תשומת לב מיוחדת למאפיינים הייחודיים של רקמת מקור פרוטופלסט ומינים לפני אימוץ טכניקות אלה. שיפורים אלה באמצעות אוטומציה מפשטים את הכנת החומר לניסויים בודדים ומשפרים משמעותית את התפוקה, מהעברה רציפה אחד אחד ל-96 טרנספקציות המטופלות בו זמנית. עבודה זו תראה גם הצדקה לשימוש בבלוקים אקראיים לא שלמים כדי להסביר את הטיית מיקום הצלחת.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. יצירת צלחת טרנספקציה

1. יצירת פריסת סיפון: כדי ליצור שיטת אקראיות של לוחות DNA, פתח את תוכנת הטיפול בנוזלים. לחץ על הלחצן שיטה חדשה משורת התפריטים כדי ליצור שיטה חדשה. הוסף קו הגדרת מכשיר בין קווי ההתחלה והסיום על ידי לחיצה על לחצן הגדרת המכשיר בלוח השמאלי.
   הערה: ניתן למצוא צילומי מסך רלוונטיים העוקבים אחר פרוטוקול אוטומטי זה באיור משלים 1, איור משלים 2 ואיור משלים 3.
2. לחץ על קו הגדרת מכשירים , מצא את תוכנת המעבדה הנכונה מתפריט הקטגוריה Labware וגרור אותם לפריסת הסיפון כפי שמוצג באיור משלים 1.
   הערה: אם תוכנת המעבדה לא הוגדרה בעבר, יהיה צורך לתכנת אותה לתוך המטפל בנוזלים בהתאם למפרט היצרן, אך הוראות כאלה אינן כלולות בפרוטוקול זה.
3. העברה מ-file הגדרה: לחץ על העברה מ-File כפתור בלוחות השלבים והצב את העברה מ-File שורה מתחת לקו ההתקנה של המכשיר. ודא שבחירת הקצה והחלפתו הם כפי שמוצג באיור משלים 3.
4. בדוק שלקובץ יש שורת כותרת וודא שפרטי העמודה נכונים.
5. לחץ על אזור המקור כדי להפעיל אותו ולחץ על לוחית המקור מפריסת הסיפון, הגדר את לוחית היעד והזן את כמות ה-DNA שיש לזרום.
6. לחץ על כפתור התאמה אישית כדי להגדיר את טכניקת הפיפטינג בפירוט, כגון נגיעות קצה על הקיר.
7. ציין את כמות ה-DNA של הפלסמיד שיש להעביר. פרוטוקול זה משתמש ב-20 מיקרוליטר של 1 מיקרוגרם/מיקרוליטר DNA פלסמיד לכל טרנספקציה (ובכן).
   הערה: כמות ה-DNA של הפלסמיד המועברת לצלחת הטרנספקציה לפני טרנספקציה של הפרוטופלסט תהיה תלויה בפלטפורמת הפרוטופלסט שבה נעשה שימוש.
8. צור קובץ העברה מקובץ .csv מסמך.
   1. מסמך זה מורכב משתי עמודות. הכן את העמודה הראשונה, כלומר העמודה מאת, המציינת את מיקום ה-DNA של הפלסמיד בתוך מתלה הצינור, כלומר עבור דגימה 1; זה יהיה טוב A01. מכיוון שהעברה זו מתרחשת שלוש פעמים (שלוש חזרות), שלוש שורות צריכות לציין A01 בעמודה מאת.
   2. הכן את העמודה השנייה, כלומר לעמודה, המשמשת לציון יעד מבנה הפלסמיד היטב של צלחת 96 הבארות. לדוגמה, דגימה 1 (A01) יכולה להיות B02, D04 ו-H07. שמור את זה כקובץ .csv כדי להיות תואם לתוכנת הטיפול בנוזלים.
9. לפני הפעלת הפרוטוקול, בדוק שעמדות הסיפון נטענות, תוכנת המעבדה מוגדרת כהלכה, מסמך האקראיות כולל מיקומי באר עבור כל ה-DNA של הדגימה במדף הצינורות, ושיש מספיק דגימת פלסמיד בצינורות כדי לבצע את הפרוטוקול.
10. הרחב את תפריט מאפייני הקובץ של השלב העברה מקובץ, בחר את הקובץ .csv שנוצר והפעל את הפרוטוקול.
11. כסו את לוחות הטרנספקציה באטם רדיד אלומיניום כאשר הפרוטוקול הושלם בהצלחה. אחסן צלחות העברה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות לשימוש. הפרוטופלסט המבודד של עלי תירס אטיולטים יתווסף ללוח טרנספקציה זה בשלב 3.3.

2. בידוד פרוטופלסט עלי תירס אטיולטי.

1. כדי להתחיל בבידוד של פרוטופלסט עלי תירס אטיולטים, השג רקע גנטי תואם פרוטופלסט כגון NP222 ששימש כאן¹⁸. הכן רק 3 מאגרים, כלומר מאגרי MMg, W5 ו-WI, המפורטים בטבלה 1 לפני תחילת הניסוי ושמור על 4 מעלות צלזיוס. הכן תמיסת עיכול ו-PEG ביום הניסוי לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
2. יש לעקר 25 זרעים על ידי טבילתם בתמיסת אקונומיקה מסחרית של 25% וניעורם על שייקר פלטפורמה סיבובית למשך כ-15 עד 20 דקות בטמפרטורת החדר.
3. לאחר התסיסה יש לשטוף היטב את הזרעים באמצעות מים סטריליים (DI). חזור על שלב השטיפה 5 פעמים. שתו את הזרעים במים סטריליים למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
4. זרעו את הזרע על אדמה לחה וחיטוי למחרת. הוסף כדורי חרס יבשים כדי לנדף עודף לחות מהאדמה כדי למנוע זיהום פטרייתי.
5. מגדלים את שתילי התירס בתא גידול קל של 16 שעות בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס (לחות יחסית (לחות יחסית (30%) למשך כ -3 ימים עד שהקולאופטיל נמצא 1-2 ס"מ מעל האדמה ואז מעבירים לתא חשוך עם אותה טמפרטורה ו- RH למשך 5 - 7 ימים נוספים.
6. קצרו את רקמת העלים האמיתית הראשונה על ידי חיתוך ממש מעל הצווארון הראשון.
7. יש לעקר את רקמת העלים לזמן קצר ב-25% אקונומיקה מסחרית ו-250 מיקרוליטר של תמיסת 20% טווין 20 למשך דקה אחת. שוטפים היטב את חומר העלים פי 5 במי DI.
8. יבשו (בעדינות) את רקמת עלה התירס עם רקמות נטולות מוך, ובעזרת להב חד הסירו ~1.5 ס"מ הן מהקצה והן מהבסיס של כל להב עלה.
9. חותכים את רקמת העלים הנותרת לרצועות רוחביות צרות (0.5 מ"מ - 1 מ"מ) ומניחים בצלחת פטרי בגודל 100X25 מ"מ.
10. יש לעקר 25 מ"ל מתמיסת העיכול דרך מסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר ישירות לתוך צלחת הפטרי המכילה את הרקמה הפרוסה.
11. ואקום חודר לרקמת העלים עם תמיסת עיכול על ידי הפעלת ואקום למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר במייבש ואקום בלחץ של כ-75 mbar.
    הערה: לחץ ואקום ביתי עבור מעבדות אקדמיות ופרטיות רבות אמור להספיק לשלב זה.
12. מניחים על שייקר פלטפורמה סיבובית ומנערים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך ב-60 סל"ד למשך 2.5 עד 3 שעות. כאשר נותרו 10 דקות לסוף תקופת העיכול, הגדל את המהירות ל 90 סל"ד.
13. יוצקים את תמיסת העיכול וכל חומר צמחי לא מעוכל דרך משפך על גבי מסנן מסננת של 40 מיקרומטר לתוך צינור של 50 מ"ל.
14. צנטריפוגה את התמיסה בתוך צינור 50 מ"ל ב-150 x גרם למשך 4 דקות כדי לגלול את הפרוטופלסט. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה ב-10 - 15 מ"ל של תמיסת חיץ MMg.
15. חזור על הצנטריפוגה והסר את הסופרנטנט. השעו מחדש במאגר MMg טרי של 5 - 10 מ"ל.
16. בעזרת המוציטומטר, מדוד בזהירות את צפיפות הפרוטופלסט המבודד. השעיה לצפיפות משוערת של 5 x 10⁵ פרוטופלסטים למ"ל.
17. אפשר לבודד לנוח על קרח במשך ~30 דקות לפני הטרנספקציה. במהלך תקופה זו, הכינו את תמיסת ה-PEG. ממיסים לחלוטין PEG לתמיסה באמצעות אמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ומשאירים אותו שם עד לטרנספקציה.

3. טרנספקציה אוטומטית של פרוטופלסט

הערה: שלבים 3.6 עד 3.15 מנוהלים לחלוטין על ידי המטפל האוטומטי בנוזלים, למעט שתי הפסקות המשתמש בשלבים 3.10 ו-3.13, הדורשות צנטריפוגה ידנית. צילומי מסך רלוונטיים העוקבים אחר פרוטוקול אוטומטי זה ניתן למצוא בתוספת, איור משלים 1, איור משלים 3, איור משלים 4 ואיור משלים 5.

1. הכן את פריסת הסיפון של המטפל בנוזלים להעברה בהתאם לשיטת העברת הפרוטופלסט המתוארת בשלבים הבאים. הרכיבו את החומרים הבאים: לוחית יעד (במקרה זה, תהיה שחורה של 96 בארות עם מיקרו-פלייט תחתון שקוף למדידת פלואורסצנטיות), קופסה אחת של 25 - 250 מיקרוליטר טיפים לאוטומציה רחבת קידוח לשלב שאיבת PEG, חמש קופסאות של 25 - 250 מיקרוליטר טיפים לאוטומציה של פיפטה עבור שלבי הטיפול בנוזלים הנותרים, שלוש שקתות פלסטיק כמאגרי ריאגנטים, צלחת ריקה אחת של 96 בארות לאיסוף פסולת, פתרונות שטיפת חיץ טרנספקציה שנותרו, W5 ו-WI.
2. מיד לפני תחילת הליך ההעברה, יש לסנן את תמיסת ה-PEG דרך יחידת מסנן ואקום חד פעמית סטרילית של 0.22 מיקרומטר לתוך צינור טרי של 50 מ"ל.
3. מהפרוטופלסט המושעה מחדש במאגר MMg, הוסף 100 מיקרוליטר (כ -50,000 פרוטופלסט) לכל באר של צלחת הטרנספקציה המוכנה מראש ומופשרת. לשם כך, שפכו את תמיסת החיץ המכילה פרוטופלסט לשוקת סטרילית של 10 מ"ל והשתמשו בפיפטה רב ערוצית. המשך בתסיסה עדינה של השוקת כדי למנוע מהפרוטופלסט להתיישב מחוץ לתמיסה במהלך שלב העברה ידני זה.
4. יוצקים את תמיסת ה-PEG לשוקת המתאימה ומניחים את לוחית הטרנספקציה, המכילה כעת פרוטופלסט ו-DNA פלסמיד המכיל לוחית טרנספקציה, שהוכנה באמצעות שלב 1, במיקום שצוין בהתאם לפריסת הסיפון.
5. כדי ליצור שיטת טרנספקציה של פרוטופלסט, פתח את תוכנת המטפל בנוזלים ובצע את השלבים המתוארים להלן.
   1. העברת כלי מעבדה בין חפיסות: החלף את תיבת הקצה הריקה בסיפון טעינת הקצה בחדשה באמצעות הפקודה Move Labware. בחר את החפיסות מ ו אל מהתצוגה תצורה .
   2. עבור נפחים גדולים מ-200 מיקרוליטר: אל תחליף את הקצוות בין ההעברות. עצות טעינה עבור שלב ההעברה הראשון ופריקה לאחר שלב ההעברה האחרון, מה שדורש לציין נכון את אפשרויות הטעינה/פריקה עבור כל שלב העברה כמו באיור משלים 3.
6. יצירת פריסת סיפון: בדומה לשיטת יצירת לוחות הטרנספקציה, כדי ליצור שיטת טרנספקציה אוטומטית של DNA, פתח את תוכנת הטיפול בנוזלים. לחץ על לחצן שיטה חדשה משורת התפריטים כדי ליצור שיטה חדשה. הוסף קו הגדרת מכשיר בין קווי ההתחלה והסיום על ידי לחיצה על לחצן הגדרת המכשיר בלוח השמאלי. צור פריסת סיפון בהתאם לפריסת הסיפון המוצגת באיור משלים 1.
7. ערבוב תאים/DNA: הוסף שלב לערבוב פרוטופלסט ו-DNA לפני הוספת PEG באמצעות כפתור פעולת המכשיר והגדרת המכשיר (ניעור מיקום אוטומטי של תוכנת מעבדה או ALP), מהירות טלטול (1500 סל"ד) וזמן ניעור (10 שניות).
8. תוספת וערבוב PEG: כדי להתחיל את הטרנספקציה, הוסף שלב העברה להוספת 110 מיקרוליטר של PEG ממאגר PEG באמצעות פיפט של 96 תרמילים. ודא שמיקומי המקור והיעד הנכונים מתוכנתים בהתאם לפריסת הסיפון שצוינה. תכנת את שלב ההעברה לשאוב PEG 1 מ"מ מתחתית המאגר ולהפקיד את ה-PEG 3 מ"מ מבסיס צלחת 96 הבארות המכילה את תערובת הפרוטופלסט/DNA. הוסף שלב טלטול נוסף לאחר הוספת PEG על ידי העתקה והדבקה של השלבים שתוכנתו בעבר.
9. דגירה של PEG: הוסף שלב הפסקה על ידי בחירה בלחצן השהיה , בחר את השייקר והזן את זמן הדגירה שנקבע מראש, שמתחיל מתוספת PEG.
   הערה: שעון העצר של ההשהיה ימשיך אלא אם כן יהיו הפרעות או שיבושים בווילון האור שיגרמו להודעת שגיאה. ודא שאם יש צורך במניפולציה של החפיסה, הודעות אלה נמחקות לפני שאתה מתרחק.
10. הוספה/ערבוב של מאגר W5: הוסף שלוש שורות העברה של 200 מיקרוליטר כדי להעביר בסך הכל 600 מיקרוליטר של מאגר W5 ללוחית הטרנספקציה כדי להרוות את תגובת הדגירה של PEG. עקוב אחר הוספת המאגר W5 על ידי ניעור והפסקת משתמש כדי לאפשר צנטריפוגה של לוחית הטרנספקציה.
11. השהיית משתמש 1: צנטריפוגה את לוחית הטרנספקציה של הפרוטופלסט ב-100 x גרם למשך 4 דקות. החזר את לוחית הטרנספקציה, כעת עם פרוטופלסט מגולגל, בחזרה למצב הסיפון המתאים. הוסף השהיית משתמש על-ידי לחיצה על לחצן השהה , אלא שכעת עם האפשרות השהה את המערכת כולה והצג את ההודעה שנבחרה.
    הערה: יש לנקות את החלון הקופץ של הודעת ההשהיה לפני שהמטפל בנוזלים ימשיך עם שאר הפרוטוקול.
12. הסרת סופרנטנט: הוסיפו שתי שורות של העברה כדי להסיר 400 מיקרוליטר של סופרנטנט והעבירו לצלחת הפסולת. כדי למנוע שאיבת תאים במהלך הסרת סופרנטנט, הגדר את המרחק מהקרקעית כ-6 מ"מ.
13. הוספה/ערבוב WI הוסף 3 קווי העברה כדי להעביר 580 מיקרוליטר של מאגר WI ללוחית הטרנספקציה. הוסף שלב טלטול נוסף לאחר הוספת WI על ידי העתקה והדבקה של השלבים שתוכנתו בעבר. המשך להשהיית המשתמש הבאה.
14. הפסקת משתמש 2: צנטריפוגה את לוחית הטרנספקציה של הפרוטופלסט ב-100 x גרם למשך 4 דקות. החזר את לוחית הטרנספקציה, כעת עם פרוטופלסט מגולגל, בחזרה למצב הסיפון המתאים.
15. הסרת סופרנטנט: הוסיפו ארבע שורות של העברה כדי להסיר 680 מיקרוליטר של סופרנטנט והעבירו לצלחת הפסולת. כדי למנוע שאיבת תאים במהלך הסרת סופרנטנט, הגדר את המרחק מהקרקעית כ-6 מ"מ.
16. העברת פרוטופלסטים למיקרו-פלטה: ההעברה הסופית של פרוטוקול זה מורכבת משני שלבי העברה של 150 מיקרוליטר. לפני כל שלב בודד, שאפו שוב ושוב פרוטופלסטים ב-50 מיקרוליטר לשנייה ב-2 מ"מ מתחתית לוחית הטרנספקציה והוציאו ב-3 מ"מ. לאחר מכן, תוך שימוש באותם קצות פיפטה, העבירו למיקרו-פלטת היעד.
    הערה: שאיבה וחלוקה של נפח חיץ מעל הגלולה לפני ההעברה למיקרופלייט תפריע לכל הפרוטופלסטים שנותרו בתחתית לוחית הטרנספקציה כדי להבטיח שאין אובדן דגימה. מכיוון שהאקראיות נעשתה במהלך יצירת לוחית הטרנספקציה, זה מסכם את הפרוטוקול האוטומטי.
17. דגרו את המיקרו-צלחת בטמפרטורת החדר בחושך למשך 24 עד 48 שעות לפני מדידת הקרינה הראשונה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

כדי להשיג נתונים תצפיתיים התומכים בכך שהשפעות קצה עשויות להשפיע על מדידות התגובה; מחקר פיילוט נערך כדי לאשר את החשדות הללו. עבור מחקר זה, השיטות לעיל יושמו על שלוש צלחות משוכפלות של 96 בארות עם רמת טיפול אחת בלבד; כל הפרוטופלסטים הועברו באמצעות pSYN11250¹⁹, פלסמיד ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כתב יד זה מתאר פרוטוקול לאוטומציה של יצירת לוחות טרנספקציה ובידוד פרוטופלסט עלי תירס עם טרנספקציה אוטומטית. להשלמה מוצלחת של חלק יצירת לוחות הטרנספקציה של הפרוטוקול, הוא דורש רובוט אוטומטי לטיפול בנוזלים המצויד בתרמיל בעל 8 ערוצים. עבור פרוטוקול הטרנספקציה, מומלץ תרמיל...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(2)β-mercaptoethanol	Sigma	M6250
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrate	Sigma	69892
50mL centrifuge tubes with flat cap sterile	Fisher	22-010-064
96 Well Optical Btm Plt PolymerBase Black w/Lid Cell Culture Sterile PS .4mL Well	Fisher	12-566-70
Axygen Biomek FX/NX Robotic Tips, non-sterile, Wide Bore	Fisher	14-222-096
Axygen Robotic Tips 30uL filter, sterile, racked	Fisher	14-222-103
Bel-Art SP Scienceware Lab Companion Round Style Vacuum Desiccators	Fisher	08-648-10
Bemis 2 IN. X 250 Ft. Roll Laboratory Parafilm	Fisher	13-374-16
Biomek FXP	Beckman Coulter	902508
Calcium chloride dihydrate	Sigma	C5080
Chemglass Life Sciences Disposable Hemocytometer	Fisher	50-131-1352
Clorox Germicidal Bleach, Concentrated	Fisher	NC1871274
Corning Microplate Aluminum Sealing Tape	Fisher	07-200-684
Corning 96-Well assay Blocks, 2mL, 96 well standard	Fisher	07-200-701
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	10197777001
D-Mannitol	Sigma	M9546
Fisherbrand 60mL Plastic Syringe	Fisher	14-955-461
Fisherbrand Sterile Cell Strainer 40um	Fisher	22-363-547
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, Stackable, 100 mm x 25 mm, Case of 325	Fisher	FB0875711
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	M2670
Millex Syringe-driven Filter Unit Sterile 33mm PES .22um	Fisher	SLGPR33RS
Millex Syringe-driven Filter Unit Sterile 33mm PVDF.45um	Fisher	SLHAR33SS
MillliporeSigma Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units 50mL PES	Fisher	SCGP00525
Poly(ethylene glycol) 4000	Sigma	81240
Redi-Earth Plug & Seedling Mix	Wyatt Quarles	GP92747
Regular Duty Single Edge Razor Blades steel back .009RD	Fisher	12-640
Research Products International Corp Cellulase RS	Fisher	50-213-232
Research Products International Corp Macerozyme R-10	Fisher	50-213-444
Sodium chloride	Sigma	S7653
Tray Insert - 36 Cell - 6x6 Nested	Hummert	11635000
Tween-20	Sigma	P1379
VACUUBRAND ME1 Vacuum Pump, 100-120V, 50/60 Hz, US plug	VWR	97058-164