黄化トウモロコシ葉プロトプラストの自動リキッドハンドリングを使用したハイスループットの導入遺伝子発現研究を可能にする

要約

このプロトコルでは、自動リキッドハンドラーを使用したランダム化トランスフェクションレイアウトの作成、黄化トウモロコシ葉のプロトプラスト単離プロトコール、およびリキッドハンドラーを使用した96ウェルトランスフェクション手順について説明します。

要約

近年、植物バイオテクノロジーの分野は目覚ましい進歩を遂げており、さまざまな目的で植物を操作し、操作する能力に革命をもたらしています。しかし、この分野の研究が多様化し、ますます高度化するにつれて、安定した形質転換に進むための戦略を絞り込むために、早期に、効率的で、信頼性が高く、ハイスループットなトランジエントスクリーニングソリューションの必要性がより明らかになっています。近年再登場した方法の1つは、植物プロトプラストの利用であり、多くの種、組織、および発生段階で単離およびトランスフェクションの方法が利用可能です。この研究では、96ウェルプレート内でのプラスミドの無作為化調製のための簡単な自動プロトコール、黄化したトウモロコシ葉のプロトプラストの単離方法、および自動トランスフェクション手順について説明します。 植物バイオテクノロジーにおける自動化ソリューションの採用は、植物プロトプラストトランスフェクションのためのこれらの新しい液体処理プロトコルに代表されるように、手動の方法に対する大きな進歩を表しています。自動化を活用することで、研究者は従来の方法の限界を簡単に克服し、効率を高め、科学の進歩を加速させることができます。

概要

植物プロトプラストトランスフェクションは、細胞壁を欠く植物細胞に外来遺伝物質を導入する極めて重要な技術であり、過去半世紀で植物バイオテクノロジー研究を支える多数の種を網羅しています。しかし、これらの方法の利用は、単離ごとに数百万のプロトプラストが産生される場合でも、痛みを伴い、範囲が限られる可能性があります。従来の植物プロトプラストトランスフェクション法は、手間がかかり、時間がかかり、ばらつきやすく、技術的にも厳しいため、再現性の低いニッチなシステムになってしまう^{ことがよくあります1}。しかし、近年の自動化ソリューションによってもたらされた可能性は、この60年の歴史を持つ若い技術に新たな命を吹き込む可能性を照らし出しています^2,3。材料調製、ポリエチレングリコール(PEG)インキュベーション、その後のトランスフェクション試薬の分注など、重要でありながら反復的なステップを自動化する可能性を秘めているため、研究者は物理的な取り扱い要件や人為的ミスのその他の潜在的な原因を大幅に削減できます⁴。さらに、自動リキッドハンドリングシステムによる精密な制御と均一性により、一貫性と再現性のあるトランスフェクション結果が得られます。

プロトプラストの単離は、チョッピング、消化、インキュベーション、ろ過、遠心分離を含む細心の注意を払ったプロセスですが、これらのプロトコルのトランスフェクション部分は、自動化されたリキッドハンドラー向けにカスタマイズされています。ほとんどのプロトプラストトランスフェクションプロトコルの手順はPEG媒介であり、単離されたプロトプラストをPEGおよび精製プラスミドDNAの存在下で正確な濃度(種および組織によって異なります)で指定の時間混合することにより、これらの細胞はプラスミドDNAを取り込むことができます⁵。このトランスフェクションに続いて、一連の洗浄ステップが続き、最終的には一晩のインキュベーション⁶が行われます。インキュベーション期間後、すべてが適切に設計され、提供された場合、実験は目的の成分の発現および/または異なる調節成分を評価する可能性をもたらす⁷。この手順に関連するすべての吸引、分注、および攪拌/混合ステップは、通常、手動ピペットで処理されます。このようなプロトコールを一度に1つの個々の反応で手作業で実行するのは面倒で、サンプル間に不必要なばらつきが生じるだけでなく、いつでも評価できる容量も制限されます。哺乳類または昆虫の細胞の操作および製薬業界での化学合成のための自動化されたプロトコルは、数年前から実践されてきました^4,8,9。植物材料の自動液体処理を含むProtoplastの利用とプロトコルは増加しています10,11,12,13。

植物プロトプラストトランスフェクションのための自動リキッドハンドリングプロトコルの採用は、研究アプリケーションにとって大きな期待が寄せられています。研究者は、より大きな遺伝ライブラリを探索し、特定の遺伝子機能を加速してスクリーニングし、植物のストレスに関連する複雑な遺伝的相互作用をより包括的に調査することができます¹⁴。96ウェルポッドと蛍光スクリーニングを組み合わせた自動化アプローチの拡張性により、ハイスループットな実験が可能になり、科学者は植物バイオテクノロジーの進歩を促進できるデータと洞察を迅速に生成できます¹¹。しかし、このスループットの増加に伴い、数千とは言わないまでも数百のデータポイントが生成されるため、結果を混乱させる可能性のあるエラーの原因を説明する追加の品質管理が必要となる¹⁵。多くの科学分野で寄与因子として特定されている要素の1つが、エッジ効果です。いくつかの緩和戦略は、この現象に対抗するために、井戸間スペースまたは最も外側の井戸を水で満たすために使用するか、または満たすのに最適なプレートを提案するでしょう^16,17。しかし、これらの戦略では時間がかかってしまうため、特定の使い捨てが利用できない場合、より少ない金額で決済するか、延期するしか選択肢はありません。あるいは、ブロッキングスキームを介してこの影響を考慮した戦略を見ても、スループットや実行の遅延は犠牲になりません。

この黄化トウモロコシ葉プロトプラストプロトプロトコルと 、図1 に示す2つの自動化法は、標準的なプロトプラスト法の複数の部分、トランスフェクションに使用する容器へのプラスミド物質の割り当て、およびトランスフェクション自体を自動化することにより、プロトプラスト実験に固有の変動性に対処しようとしています。これらの方法は、十分に特徴付けられた、シンプルで効率的なプロトプラストプラットフォームであるため、黄化トウモロコシ葉プロトプラストプラットフォームで実証されています。上記で詳述されているすべてのステップは、類似または同じバッファー溶液を使用するプロトプラストトランスフェクションプロトコルにすぐにアクセスできます。ただし、これらの技術を採用する前に、プロトプラスト源の組織と種のユニークな特性に特別な注意を払う必要があります。自動化によるこれらの改善により、個々の実験用の材料調製が簡素化され、1つずつの逐次トランスフェクションから同時に処理される96回のトランスフェクションまで、スループットが大幅に向上します。この作業では、プレートの位置バイアスを説明するためにランダム化された不完全ブロックを利用することの正当性も示します。

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プロトコル

1. トランスフェクションプレートの作製

1. デッキレイアウトの作成:DNAプレートのランダム化法を作成するには、リキッドハンドラーソフトウェアを開きます。メニューバーの 「新規メソッド 」ボタンをクリックして、新しいメソッドを作成します。スタートラインとフィニッシュラインの間に インストゥルメントセットアップ ラインを追加するには、左パネルの インストゥルメントセットアップ ボタンを押します。
   注:この自動化されたプロトコルに続く関連するスクリーンショットは 、補足図1、補足図2、および 補足図3にあります。
2. 「Instrument Setup」行をクリックし、Labwareカテゴリーメニューから正しいラボウェアを見つけて、補足図1に示すようにデッキレイアウトにドラッグします。
   注:実験器具が事前に定義されていない場合は、製造元の仕様に従ってリキッドハンドラーにプログラムする必要がありますが、そのような指示はこのプロトコルの範囲外です。
3. ファイル設定からの転送:ステップパレットの[ ファイルから転送 ]ボタンを押し、[インストゥルメント設定]ラインの下に [ファイルから転送 ]ラインを配置します。チップの選択と交換が 補足図3に示されているとおりであることを確認してください。
4. ファイルにヘッダー行があり、列情報が正しいことを確認します。
5. Source Areaを押してアクティブにし、デッキレイアウトからSource Plateをクリックし、ターゲットプレートを定義して、ピペットするDNAの量を入力します。
6. Customizeボタンを押して、壁へのチップタッチなど、ピペッティング技術を詳細に定義します。
7. 転写するプラスミドDNAの量を指定します。このプロトコールでは、トランスフェクション(ウェル)あたり20 μLの1 μg/μLプラスミドDNAを使用します。
   注:プロトプラストトランスフェクションの前にトランスフェクションプレートに転写されるプラスミドDNAの量は、使用するプロトプラストプラットフォームによって異なります。
8. ファイルからの転送.csvドキュメントを作成します。
   1. このドキュメントは 2 つの列で構成されています。最初のカラム、すなわち、チューブラック内のストックプラスミドDNAの位置を示すFromカラム、すなわちサンプル1を調製します。これはA01型でしょう。この転送は 3 回 (3 回の担当者) 発生するため、3 行は From 列に A01 を示す必要があります。
   2. 2番目のカラム、すなわちToカラムを調製し、96ウェルプレートのプラスミドコンストラクト宛先ウェルを特定するために使用します。たとえば、サンプル 1 (A01) は B02、D04、H07 です。これを.csvとして保存します file リキッドハンドラーソフトウェアと互換性があります。
9. プロトコールを実行する前に、デッキ位置がロードされていること、ラボウェアが正しく定義されていること、ランダマイゼーションドキュメントにチューブラック内のすべてのサンプルDNAのウェル位置が含まれていること、およびプロトコールを実行するのに十分なプラスミドサンプルがチューブ内にあることを確認してください。
10. 「Transfer From File」ステップの 「File Properties 」メニューを展開し、作成した.csvファイルを選択してプロトコルを実行します。
11. プロトコールが正常に完了したら、トランスフェクションプレートをアルミホイルシールで覆います。トランスフェクションプレートは、使用する準備ができるまで-20°Cで保存してください。単離された黄化トウモロコシ葉のプロトプラストは、ステップ3.3でこのトランスフェクションプレートに追加されます。

2. 黄化トウモロコシ葉プロトプラスト分離

1. 黄化トウモロコシ葉プロトプラストの単離を開始するには、ここで使用したNP222などのプロトプラスト適合遺伝的背景を得る¹⁸。実験開始前に 、表1 にリストされているMMg、W5、WIバッファーの3つのバッファーのみを調製し、4°Cに保ちます。 最良の結果を得るために、実験当日に消化液とPEGを準備してください。
2. 最初に25%の市販の漂白剤溶液に25個の種子を沈め、室温で約15〜20分間回転式プラットフォームシェーカーで振とうすることにより、表面滅菌します。
3. 攪拌後、滅菌水(DI)を使用して種子を十分にすすいでください。すすぎ手順を5回繰り返します。種子を滅菌水に室温で一晩浸します。
4. 翌日、湿ったオートクレーブ処理された土壌に種を蒔きます。乾燥した粘土ペレットを追加して、土壌から余分な水分を逃がし、真菌の汚染を防ぎます。
5. トウモロコシの苗を28°C(相対湿度(RH)30%)の16時間の光成長チャンバーで約3日間、鞘葉が土壌から1〜2 cm上になるまで育て、その後、同じ温度とRHの暗いチャンバーに移してさらに5〜7日間育てます。
6. 最初の本葉組織を最初の襟のすぐ上で切って収穫します。
7. 表面を25%市販の漂白剤と250μLの20%Tween 20溶液で1分間短時間滅菌します。葉の材料をDI水で5倍十分に洗い流します。
8. 糸くずの出ないティッシュでトウモロコシの葉のティッシュを(優しく)軽くたたいて乾かし、鋭利な刃を使用して、各葉身の先端と基部の両方から~1.5cm取り除きます。
9. 残りの葉組織を細い(0.5 mm - 1 mm)横帯に切り、100 x 25 mmのシャーレに入れます。
10. 25 mLの消化液を0.22 μmシリンジフィルターで、スライスした組織を含むシャーレに直接フィルター滅菌します。
11. 約-75 mbarの圧力で真空デシケーターに室温で30分間真空を適用することにより、消化溶液を葉組織に真空浸潤します。
    注:このステップには、多数の学術および民間のラボのハウス真空圧で十分です。
12. ロータリープラットフォームシェーカーに載せ、暗闇の中で60RPMの25°Cで2.5〜3時間振とうします。消化期間の終了まで10分が経過したら、速度を90RPMに上げます。
13. 消化液と未消化の植物材料を、40 μmのふるいフィルターの上の漏斗を通して50 mLのチューブに注ぎます。
14. 50 mLチューブ内の溶液を150 x g で4分間遠心分離し、プロトプラストをペレット化します。上清を取り除き、ペレットを10〜15 mLのMMg緩衝液に再懸濁します。
15. 遠心分離を繰り返し、上清を取り除きます。5 - 10 mLの新鮮なMMgバッファーに再懸濁します。
16. 血球計算盤を使用して、単離されたプロトプラストの密度を慎重に測定します。mLあたり約5 x 10⁵ プロトプラストの密度に再懸濁します。
17. トランスフェクションの前に、分離物を氷上で~30分間休ませます。この間に、PEG溶液を調製します。PEGを37°Cのウォーターバスを使用して溶液に完全に溶解し、トランスフェクションまでそのままにしておきます。

3. プロトプラストトランスフェクションの自動化

注:ステップ3.6から3.15は、手動遠心分離が必要なステップ3.10と3.13の2つのユーザー一時停止を除いて、自動リキッドハンドラーによって完全に管理されます。この自動化されたプロトコルに続く関連するスクリーンショットは、補足、 補足図1、補足図3、補足図4、および 補足図5にあります。

1. トランスフェクション用のリキッドハンドラーのデッキレイアウトを、次の手順で説明するprotoplastトランスフェクション方法に従って準備します。次の材料を組み立てます:宛先プレート(この場合、蛍光測定用の透明な底部マイクロプレートを備えた96ウェルブラック)、PEG吸引ステップ用の25〜250μLワイドボア自動化チップ1箱、残りの液体処理ステップ用の25〜250μLピペット自動化チップ5箱、試薬リザーバーとしての3つのプラスチックトラフ、 廃棄物収集用の空の96ウェルプレート1枚、残りのトランスフェクションバッファー洗浄液、W5およびWI。
2. トランスフェクション手順を開始する直前に、0.22 μmの滅菌済み使い捨て真空フィルターユニットを介してPEG溶液を新鮮な50 mLチューブにろ過滅菌します。
3. MMgバッファーに再懸濁したプロトプラストから、100 μL(約50,000個のプロトプラスト)を、あらかじめ調製し、解凍したトランスフェクションプレートの各ウェルに加えます。これを行うには、プロトプラスト含有緩衝液を滅菌済みの10 mLトラフに注ぎ、マルチチャンネルピペットを使用します。この手動移送ステップ中にプロトプラストが溶液から落ち着くのを防ぐために、トラフの穏やかな攪拌を続けます。
4. PEG溶液を適切なトラフに注ぎ、ステップ1を使用して調製したトランスフェクションプレート(プロトプラストおよびトランスフェクションプレートを含むプラスミドDNAを含むトランスフェクションプレートを含む)を、デッキレイアウトに従って指定された場所に置きます。
5. プロトプラストトランスフェクション法を作成するには、リキッドハンドラーソフトウェアを開き、以下で説明する手順を実行します。
   1. デッキ間での実験器具の移動: Move Labware コマンドを使用して、チップローディングデッキの空のチップボックスを新しいチップボックスと交換します。「Configuration」ビューから「From」デッキと「To」デッキを選択します。
   2. 200μLを超える容量の場合:転送間でチップを交換しないでください。最初の転送ステップのロードヒントと最後の転送ステップの後のアンロードでは、 補足図3に示すように、各転送ステップでロード/アンロードオプションを正しく指定する必要があります。
6. デッキレイアウト作成:トランスフェクションプレート作成法と同様に、DNA自動トランスフェクション法を作成するには、リキッドハンドラーソフトウェアを開きます。メニューバーの 「新規メソッド 」ボタンをクリックして、新しいメソッドを作成します。スタートラインとフィニッシュラインの間に インストゥルメントセットアップ ラインを追加するには、左パネルの インストゥルメントセットアップ ボタンを押します。 補足図1に示すデッキレイアウトに従ってデッキレイアウトを作成します。
7. 細胞/DNAの混合:PEGを添加する前に、 Device Action ボタンを使用してプロトプラストとDNAを混合するステップを追加し、デバイスのセットアップ(振とう自動実験器具ポジショナーまたはALP)、振とう速度(1500 rpm)、振とう時間(10秒)を設定します。
8. PEGの添加と混合:トランスフェクションを開始するには、トランスファーステップを追加し、96ポッドピペットを使用してPEGリザーバーから110μLのPEGを添加します。正しいソースと宛先の位置が、指定されたデッキレイアウトに従ってプログラムされていることを確認してください。リザーバーの底部から PEG 1 mm を吸引し、プロトプラスト/DNA 混合物を含む 96 ウェルプレートの基部から PEG 3 mm を堆積させるように、トランスファーステップをプログラムします。以前にプログラムされたステップをコピーして貼り付けることにより、PEG追加後に別の振とうステップを追加します。
9. PEGインキュベーション: 一時停止 ボタンを選択し、シェーカーを選択して、PEG添加から始まる所定のインキュベーション時間を入力して、一時停止ステップを追加します。
   メモ: 一時停止のタイマーは、ライトカーテンの中断やエラーメッセージの中断がない限り、続行されます。デッキの操作が必要な場合は、立ち去る前にこれらのメッセージがクリアされていることを確認してください。
10. W5バッファーの添加/混合:200 μLのトランスファーを3ライン追加して、合計600 μLのW5バッファーをトランスフェクションプレートにトランスファーし、PEGインキュベーション反応をクエンチします。W5バッファーの添加に続いて、振とうし、ユーザーが一時停止してトランスフェクションプレートを遠心分離します。
11. 一時停止1:プロトプラストトランスフェクションプレートを100 x g で4分間遠心分離します。ペレット状のプロトプラストを塗布したトランスフェクションプレートを適切なデッキ位置に戻します。[ 一時停止 ]ボタンをクリックしてユーザーの一時停止を追加しますが、現在は[ システム全体を一時停止し、メッセージを表示する ]オプションが選択されています。
    注:一時停止メッセージのポップアップをクリアすると、リキッドハンドラーが残りのプロトコルを続行できます。
12. 上清の除去:Transferを2行追加して、400μLの上清を除去し、廃棄物プレートに移します。上清除去時の細胞吸引を避けるために、底部からの距離を6mmに設定してください。
13. WI添加/混合 トランスファーを3ライン追加して、580μLのWIバッファーをトランスフェクションプレートに転写します。WIの追加後に、以前にプログラムされたステップをコピーして貼り付けることにより、別の振とうステップを追加します。次のユーザーの一時停止に進みます。
14. 一時停止2:プロトプラストトランスフェクションプレートを100 x g で4分間遠心分離します。ペレット状のプロトプラストを塗布したトランスフェクションプレートを適切なデッキ位置に戻します。
15. 上清の除去:トランスファーを4行追加して680μLの上清を除去し、廃液プレートに移します。上清除去時の細胞吸引を避けるために、底部からの距離を6mmに設定してください。
16. マイクロプレートへのプロトプラストの移管:このプロトコールの最終移管は、2つの150 μLの移管ステップで構成されています。各ステップの前に、トランスフェクションプレートの底部から 2 mm で 50 μL/s でプロトプラストを繰り返し吸引し、3 mm で分注します。次に、同じピペットチップを使用して、目的のマイクロプレートに移します。
    注:マイクロプレートに移す前にペレットより上の緩衝液量を吸引して分注すると、トランスフェクションプレートの底にペレット化された残りのプロトプラストが乱れ、サンプルの損失がなくなります。トランスフェクションプレートの作成中にランダム化が行われたため、これで自動プロトコルは終了です。
17. マイクロプレートを室温の暗所で24〜48時間インキュベートしてから、最初の蛍光測定を行います。

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結果

エッジ効果が応答測定に影響を与えている可能性があることを裏付ける観測データを取得すること。これらの疑惑を確認するために、予備研究が実施されました。この研究では、上記の方法を 3 つのレプリケート 96 ウェルプレートに適用し、1 つの処理レベルのみで行いました。すべてのプロトプラストは、ZsGreenを構成的に発現するプラスミドであるpSYN11250

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ディスカッション

この原稿では、トランスフェクションプレートの作成を自動化し、自動トランスフェクションを使用して黄化トウモロコシ葉のプロトプラスト単離を行うためのプロトコルについて説明します。プロトコルのトランスフェクションプレート作成部分を正常に完了するには、8チャンネルポッドが取り付けられた自動リキッドハンドリングロボットが必要です。トラン?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
(2)β-mercaptoethanol	Sigma	M6250
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrate	Sigma	69892
50mL centrifuge tubes with flat cap sterile	Fisher	22-010-064
96 Well Optical Btm Plt PolymerBase Black w/Lid Cell Culture Sterile PS .4mL Well	Fisher	12-566-70
Axygen Biomek FX/NX Robotic Tips, non-sterile, Wide Bore	Fisher	14-222-096
Axygen Robotic Tips 30uL filter, sterile, racked	Fisher	14-222-103
Bel-Art SP Scienceware Lab Companion Round Style Vacuum Desiccators	Fisher	08-648-10
Bemis 2 IN. X 250 Ft. Roll Laboratory Parafilm	Fisher	13-374-16
Biomek FXP	Beckman Coulter	902508
Calcium chloride dihydrate	Sigma	C5080
Chemglass Life Sciences Disposable Hemocytometer	Fisher	50-131-1352
Clorox Germicidal Bleach, Concentrated	Fisher	NC1871274
Corning Microplate Aluminum Sealing Tape	Fisher	07-200-684
Corning 96-Well assay Blocks, 2mL, 96 well standard	Fisher	07-200-701
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	10197777001
D-Mannitol	Sigma	M9546
Fisherbrand 60mL Plastic Syringe	Fisher	14-955-461
Fisherbrand Sterile Cell Strainer 40um	Fisher	22-363-547
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, Stackable, 100 mm x 25 mm, Case of 325	Fisher	FB0875711
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	M2670
Millex Syringe-driven Filter Unit Sterile 33mm PES .22um	Fisher	SLGPR33RS
Millex Syringe-driven Filter Unit Sterile 33mm PVDF.45um	Fisher	SLHAR33SS
MillliporeSigma Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units 50mL PES	Fisher	SCGP00525
Poly(ethylene glycol) 4000	Sigma	81240
Redi-Earth Plug & Seedling Mix	Wyatt Quarles	GP92747
Regular Duty Single Edge Razor Blades steel back .009RD	Fisher	12-640
Research Products International Corp Cellulase RS	Fisher	50-213-232
Research Products International Corp Macerozyme R-10	Fisher	50-213-444
Sodium chloride	Sigma	S7653
Tray Insert - 36 Cell - 6x6 Nested	Hummert	11635000
Tween-20	Sigma	P1379
VACUUBRAND ME1 Vacuum Pump, 100-120V, 50/60 Hz, US plug	VWR	97058-164