Ermöglichung von Hochdurchsatz-Transgenexpressionsstudien mit automatisiertem Liquid Handling für etiolierte Protoplasten aus Maisblättern

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Erstellung eines randomisierten Transfektionslayouts unter Verwendung eines automatisierten Liquid Handlers, eines Protoplasten-Isolationsprotokolls für etiolierte Maisblätter und eines 96-Well-Transfektionsverfahrens unter Verwendung eines Liquid Handlers.

Zusammenfassung

Auf dem Gebiet der Pflanzenbiotechnologie hat sich in den letzten Jahren bemerkenswerte Fortschritte vollzogen, die die Fähigkeit revolutioniert haben, Pflanzen für verschiedene Zwecke zu manipulieren und zu manipulieren. Da die Forschung in diesem Bereich jedoch immer vielfältiger und ausgefeilter wird, wird der Bedarf an frühen, effizienten, zuverlässigen und transienten Screening-Lösungen mit hohem Durchsatz immer deutlicher, um Strategien einzugrenzen, die zu einer stabilen Transformation führen. Eine Methode, die in den letzten Jahren wieder aufgetaucht ist, ist die Verwendung von pflanzlichen Protoplasten, für die Methoden der Isolierung und Transfektion in zahlreichen Arten, Geweben und Entwicklungsstadien zur Verfügung stehen. Diese Arbeit beschreibt ein einfaches automatisiertes Protokoll zur randomisierten Präparation von Plasmiden innerhalb einer 96-Well-Platte, eine Methode zur Isolierung von etiolierten Maisblatt-Protoplasten und ein automatisiertes Transfektionsverfahren. Die Einführung automatisierter Lösungen in der Pflanzenbiotechnologie, beispielhaft für diese neuartigen Liquid-Handling-Protokolle für die Transfektion von pflanzlichen Protoplasten, stellt einen bedeutenden Fortschritt gegenüber manuellen Methoden dar. Durch den Einsatz von Automatisierung können Forscher die Grenzen traditioneller Methoden leicht überwinden, die Effizienz steigern und den wissenschaftlichen Fortschritt beschleunigen.

Einleitung

Die Transfektion von Pflanzenprotoplasten, das Einbringen von fremdem genetischem Material in Pflanzenzellen ohne Zellwände, ist eine zentrale Technik, die im letzten halben Jahrhundert zahlreiche Arten zur Unterstützung der pflanzenbiotechnologischen Forschung umfasste. Die Anwendung dieser Methoden kann jedoch schmerzhaft und in ihrem Umfang begrenzt sein, selbst wenn Millionen von Protoplasten pro Isolation produziert werden. Traditionelle Methoden der Transfektion von pflanzlichen Protoplasten sind oft mühsam, zeitaufwändig, anfällig für Variabilität und technisch anspruchsvoll, was zu Nischensystemen mit geringer Reproduzierbarkeit^{führt 1}. Das Potenzial, das automatisierte Lösungen in den letzten Jahren eingeführt haben, beleuchtet jedoch die Möglichkeit, dieser 60 Jahre jungen Technik neues Leben einzuhauchen ^2,3. Mit dem Potenzial der Automatisierung wichtiger, aber sich wiederholender Schritte wie der Materialvorbereitung, der Inkubation von Polyethylenglykol (PEG) und der anschließenden Abgabe von Transfektionsreagenzien können Forscher die Anforderungen an die physische Handhabung und andere potenzielle Quellen für menschliches Versagen erheblich reduzieren⁴. Darüber hinaus sorgen die präzise Steuerung und Gleichmäßigkeit der automatisierten Liquid-Handling-Systeme für konsistente und reproduzierbare Transfektionsergebnisse.

Während die Protoplastenisolierung ein sorgfältiger Prozess ist, der Zerkleinern, Aufschluss, Inkubation, Filtration und Zentrifugation umfasst, ist der Transfektionsteil dieser Protokolle auf automatisierte Liquid Handler zugeschnitten. Das Verfahren für die meisten Protoplasten-Transfektionsprotokolle ist PEG-vermittelt, und das Mischen des isolierten Protoplasten in Gegenwart von PEG und gereinigter Plasmid-DNA für eine bestimmte Dauer in einer präzisen Konzentration (abhängig von der Spezies und dem Gewebe) ermöglicht es diesen Zellen, die Plasmid-DNA aufzunehmen⁵. Auf diese Transfektion folgt eine Reihe von Waschschritten, die in einer Inkubation über Nacht^{gipfeln 6}. Nach der Inkubationszeit, wenn alles richtig konzipiert und geliefert wurde, führt das Experiment zum Ausdruck der interessierenden Komponente und/oder zum Potenzial der Bewertung verschiedener regulatorischer Komponenten⁷. Alle Aspirations-, Dispensierungs- und Rühr-/Mischschritte, die mit diesem Verfahren verbunden sind, werden normalerweise von einer manuellen Pipette durchgeführt. Die manuelle Ausführung eines solchen Protokolls, eine einzelne Reaktion nach der anderen, ist mühsam und führt zu unnötigen Schwankungen zwischen den Proben, während gleichzeitig die Kapazität eingeschränkt wird, die zu einem bestimmten Zeitpunkt bewertet werden kann. Automatisierte Protokolle für die Manipulation von Säugetier- oder Insektenzellen und die chemische Synthese in der pharmazeutischen Industrie werden seit mehreren Jahren praktiziert ^4,8,9. Die Verwendung von Protoplasten und Protokolle, die das automatisierte Liquid Handling von Pflanzenmaterial beinhalten, sind auf dem Vormarsch 10,11,12,13.

Die Einführung automatisierter Liquid-Handling-Protokolle für die Transfektion von pflanzlichen Protoplasten ist vielversprechend für Forschungsanwendungen. Forscher können größere genetische Bibliotheken erforschen, schneller nach spezifischen Genfunktionen suchen und komplexe genetische Wechselwirkungen im Zusammenhang mit Pflanzenstress umfassender untersuchen¹⁴. Die Skalierbarkeit automatisierter Ansätze unter Verwendung von 96-Well-Pods in Kombination mit Fluoreszenz-Screening ermöglicht Experimente mit hohem Durchsatz und ermöglicht es Wissenschaftlern, schnell Daten und Erkenntnisse zu generieren, die Fortschritte in der Pflanzenbiotechnologie vorantreiben können¹¹. Mit dieser Erhöhung des Durchsatzes, die zur Generierung von Hunderten, wenn nicht Tausenden von Datenpunkten führt, muss jedoch eine zusätzliche Qualitätskontrolle durchgeführt werden, bei der alle Fehlerquellen berücksichtigt werden, die die Ergebnisse verfälschen können¹⁵. Ein Element, das in zahlreichen wissenschaftlichen Disziplinen als beitragender Faktor identifiziert wurde, ist der Edge-Effekt. Einige Strategien zur Abschwächung schlagen vor, die beste Platte zu verwenden oder den Raum zwischen den Brunnen oder die äußersten Brunnen mit Wasser zu füllen, um dieses Phänomen zu bekämpfen^16,17. Diese Strategien verlängern jedoch die Zeit, und wenn eine bestimmte Verfügbarkeit nicht verfügbar ist, besteht die einzige Möglichkeit darin, sich mit weniger zufrieden zu geben oder zu verschieben. Alternativ bedeutet die Betrachtung von Strategien, die diesen Effekt über ein Blockierungsschema berücksichtigen, keine Einbußen beim Durchsatz oder Verzögerung bei der Ausführung.

Dieses etiolierte Protoplastenprotokoll für Maisblätter und seine beiden in Abbildung 1 dargestellten automatisierten Methoden versuchen, die Variabilität von Protoplastenexperimenten zu adressieren, indem mehrere Teile der kanonischen Protoplastenmethode, die Zuordnung von Plasmidmaterial zu dem für die Transfektion verwendeten Gefäß und die Transfektion selbst automatisiert werden. Diese Methoden werden für die etiolierte Protoplastenplattform für Maisblätter demonstriert, da es sich um eine gut charakterisierte, einfache und effiziente Protoplastenplattform handelt. Alle darin beschriebenen Schritte sind für Protoplasten-Transfektionsprotokolle, die ähnliche oder die gleichen Pufferlösungen verwenden, sofort zugänglich. Vor der Anwendung dieser Techniken sollte jedoch besonderes Augenmerk auf die einzigartigen Eigenschaften des Protoplasten-Ausgangsgewebes und der Protoplasten-Spezies gelegt werden. Diese Verbesserungen durch Automatisierung vereinfachen die Vorbereitung des Materials für einzelne Experimente und verbessern den Durchsatz erheblich, von einer sequentiellen Transfektion nach und nach auf 96 Transfektionen, die gleichzeitig durchgeführt werden. Diese Arbeit wird auch eine Rechtfertigung für die Verwendung randomisierter unvollständiger Blöcke zur Berücksichtigung der Positionsverzerrung der Platte aufzeigen.

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Protokoll

1. Erstellung von Transfektionsplatten

1. Erstellung des Deck-Layouts: Um eine DNA-Platten-Randomisierungsmethode zu erstellen, öffnen Sie die Liquid-Handler-Software. Klicken Sie in der Menüleiste auf die Schaltfläche Neue Methode , um eine neue Methode zu erstellen. Fügen Sie eine Instrument-Setup-Linie zwischen der Start- und der Ziellinie hinzu, indem Sie die Instrument-Setup-Taste im linken Bereich drücken.
   HINWEIS: Relevante Screenshots, die zusammen mit diesem automatisierten Protokoll folgen, finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1, der ergänzenden Abbildung 2 und der ergänzenden Abbildung 3.
2. Klicken Sie auf die Zeile Instrument Setup , suchen Sie die richtigen Laborgeräte im Menü der Labware-Kategorie und ziehen Sie sie auf das Deck-Layout, wie in der ergänzenden Abbildung 1 gezeigt.
   HINWEIS: Wenn das Laborgerät nicht zuvor definiert wurde, muss es gemäß den Herstellerspezifikationen in den Liquid Handler programmiert werden, aber solche Anweisungen liegen außerhalb des Geltungsbereichs dieses Protokolls.
3. Aus Datei-Setup übertragen: Drücken Sie die Taste "Aus Datei übertragen " in den Schrittpaletten und platzieren Sie die Zeile "Aus Datei übertragen " unterhalb der Instrument-Setup-Zeile. Stellen Sie sicher, dass die Auswahl und der Austausch der Spitze wie in der ergänzenden Abbildung 3 gezeigt sind.
4. Überprüfen Sie, ob Datei über eine Kopfzeile verfügt , und stellen Sie sicher, dass die Spalteninformationen korrekt sind.
5. Drücken Sie auf den Quellbereich, um ihn zu aktivieren, und klicken Sie im Decklayout auf die Quellplatte , definieren Sie die Zielplatte und geben Sie die Menge der zu pipettierenden DNA ein.
6. Drücken Sie die Taste Anpassen , um die Pipettiertechnik im Detail zu definieren, z. B. die Spitze an der Wand zu berühren.
7. Geben Sie die Menge der zu übertragenden Plasmid-DNA an. Dieses Protokoll verwendet 20 μl 1 μg/μl Plasmid-DNA pro Transfektion (Well).
   HINWEIS: Die Menge an Plasmid-DNA, die vor der Protoplastentransfektion auf die Transfektionsplatte übertragen wird, hängt von der verwendeten Protoplastenplattform ab.
8. Erstellen Sie eine Übertragung aus Datei .csv Dokument.
   1. Dieses Dokument besteht aus zwei Spalten. Bereiten Sie die erste Säule vor, d. h. die Spalte Von, die die Position der Stammplasmid-DNA im Röhrchengestell angibt, d. h. für Probe 1; das wäre nun gut A01. Da diese Übertragung dreimal (drei Wiederholungen) erfolgt, sollten drei Zeilen in der Spalte Von A01 angeben.
   2. Bereiten Sie die zweite Spalte, d. h. die To-Spalte, vor, die verwendet wird, um das Ziel-Well des Plasmidkonstrukts der 96-Well-Platte anzugeben. Beispiel 1 (A01) könnte B02, D04 und H07 sein. Speichern Sie diese als .csv Datei, um mit der Liquid-Handler-Software kompatibel zu sein.
9. Überprüfen Sie vor dem Ausführen des Protokolls, ob die Deckpositionen geladen sind, die Laborgeräte korrekt definiert sind, das Randomisierungsdokument die Well-Positionen für die gesamte Proben-DNA im Röhrchengestell enthält und dass sich genügend Plasmidprobe in den Röhrchen befindet, um das Protokoll auszuführen.
10. Erweitern Sie das Menü Dateieigenschaften des Schritts Aus Datei übertragen, wählen Sie die .csv erstellte Datei aus und führen Sie das Protokoll aus.
11. Decken Sie die Transfektionsplatten mit einem Aluminiumfoliensiegel ab, wenn das Protokoll erfolgreich abgeschlossen wurde. Lagern Sie die Transfektionsplatten bis zur Verwendung bei -20 °C. Der isolierte etiolierte Protoplast der Maisblätter wird in Schritt 3.3 zu dieser Transfektionsplatte gegeben.

2. Isolierung der Protoplasten von etiolierten Maisblättern

1. Um mit der Isolierung von etiolierten Maisblatt-Protoplasten zu beginnen, wird ein Protoplasten-kompatibler genetischer Hintergrund wie NP222 erhalten, der hier verwendet wurde¹⁸. Bereiten Sie vor Beginn des Versuchs nur 3 Puffer vor, nämlich MMg-, W5- und WI-Puffer, die in Tabelle 1 aufgeführt sind, und halten Sie sie bei 4 °C. Bereiten Sie am Tag des Experiments die Aufschlusslösung und das PEG vor, um die besten Ergebnisse zu erzielen.
2. Sterilisieren Sie 25 Samen an der Oberfläche, indem Sie sie zuerst in eine 25%ige Bleichlösung tauchen und auf einem Drehplattformschüttler etwa 15 bis 20 Minuten lang bei Raumtemperatur schütteln.
3. Spülen Sie die Samen nach dem Rühren gründlich mit sterilem Wasser (DI) ab. Wiederholen Sie den Spülschritt 5x. Trinke die Samen über Nacht in sterilem Wasser bei Raumtemperatur.
4. Säen Sie den Samen am nächsten Tag auf feuchte, autoklavierte Erde. Fügen Sie trockene Tonpellets hinzu, um überschüssige Feuchtigkeit aus dem Boden abzuleiten und eine Pilzkontamination zu verhindern.
5. Ziehen Sie die Maissetzlinge in einer 16 h hellen Wachstumskammer bei 28 °C (relative Luftfeuchtigkeit (RH) von 30%) für ca. 3 Tage an, bis das Coleoptile 1-2 cm über dem Boden ist, und bringen Sie sie dann für weitere 5 - 7 Tage in eine dunkle Kammer mit der gleichen Temperatur und RH.
6. Ernten Sie das erste echte Blattgewebe, indem Sie es direkt über dem ersten Kragen abschneiden.
7. Das Blattgewebe kurzzeitig in 25 % handelsüblicher Bleiche und 250 μl 20 % Tween 20 Lösung für 1 min oberflächensterilisieren. Spülen Sie das Blattmaterial 5x gründlich mit DI-Wasser ab.
8. Tupfen Sie das Maisblattgewebe mit fusselfreien Tüchern (vorsichtig) trocken und entfernen Sie mit einer scharfen Klinge ~1,5 cm sowohl von der Spitze als auch von der Basis jeder Blattspreite.
9. Das restliche Blattgewebe in schmale (0,5 mm - 1 mm) Querstreifen schneiden und in eine 100 x 25 mm große Petrischale geben.
10. 25 ml der Aufschlusslösung werden durch einen 0,22-μm-Spritzenvorsatzfilter direkt in die Petrischale mit dem geschnittenen Gewebe filtriert.
11. Vakuuminfiltrieren Sie das Blattgewebe mit Aufschlusslösung, indem Sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in einem Vakuumexsikkator bei einem Druck von ca. -75 mbar Vakuum anwenden.
    HINWEIS: Der Hausvakuumdruck für zahlreiche akademische und private Labore sollte für diesen Schritt ausreichend sein.
12. Auf einen drehbaren Plattformschüttler stellen und bei 25 °C im Dunkeln bei 60 U/min 2,5 bis 3 h schütteln. Wenn noch 10 Minuten bis zum Ende der Aufschlussphase übrig sind, erhöhen Sie die Drehzahl auf 90 U/min.
13. Gießen Sie die Aufschlusslösung und unverdautes Pflanzenmaterial durch einen Trichter auf einem 40-μm-Siebfilter in ein 50-ml-Röhrchen.
14. Zentrifugieren Sie die Lösung im Inneren des 50-ml-Röhrchens bei 150 x g für 4 Minuten, um den Protoplasten zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 10 - 15 mL MMg Pufferlösung.
15. Wiederholen Sie die Zentrifugation und entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie in 5 - 10 mL frischem MMg-Puffer.
16. Messen Sie mit einem Hämozytometer vorsichtig die Dichte des isolierten Protoplasten. Resuspendieren Sie auf eine ungefähre Dichte von 5 x 10⁵ Protoplasten pro ml.
17. Lassen Sie das Isolat vor der Transfektion ~30 min auf Eis ruhen. Bereiten Sie während dieser Zeit die PEG-Lösung vor. Lösen Sie PEG mit einem 37 °C warmen Wasserbad vollständig in einer Lösung auf und lassen Sie es dort bis zur Transfektion.

3. Automatisierte Protoplastentransfektion

HINWEIS: Die Schritte 3.6 bis 3.15 werden vollständig vom automatisierten Liquid Handler verwaltet, mit Ausnahme der beiden Benutzerpausen bei den Schritten 3.10 und 3.13, die eine manuelle Zentrifugation erfordern. Relevante Screenshots, die zusammen mit diesem automatisierten Protokoll folgen, finden Sie in der Ergänzung, Ergänzende Abbildung 1, Ergänzende Abbildung 3, Ergänzende Abbildung 4 und Ergänzende Abbildung 5.

1. Bereiten Sie das Deckslayout des Liquid Handlers für die Transfektion gemäß der in den folgenden Schritten beschriebenen Protoplasten-Transfektionsmethode vor. Montieren Sie die folgenden Materialien: Zielplatte (in diesem Fall wäre dies eine schwarze 96-Well-Mikroplatte mit klarem Boden für die Fluoreszenzmessung), eine Schachtel mit 25 - 250 μl Automatisierungsspitzen mit breiter Bohrung für die PEG-Aspirationsstufe, fünf Schachteln mit 25 - 250 μl Pipetten-Automatisierungsspitzen für die verbleibenden Schritte der Flüssigkeitshandhabung, drei Kunststofftröge als Reagenzreservoire, eine leere 96-Well-Platte für die Abfallsammlung, restliche Transfektionspuffer-Waschlösungen, W5 und WI.
2. Unmittelbar vor Beginn des Transfektionsverfahrens sterilisieren Sie die PEG-Lösung durch eine sterile 0,22-μm-Einweg-Vakuumfiltereinheit in ein frisches 50-ml-Röhrchen.
3. Geben Sie aus dem in MMg-Puffer resuspendierten Protoplasten 100 μl (ca. 50.000 Protoplasten) in jede Vertiefung der vorbereiteten, aufgetauten Transfektionsplatte. Gießen Sie dazu die Protoplasten-haltige Pufferlösung in einen sterilen 10 mL Trog und verwenden Sie eine Mehrkanalpipette. Bewegen Sie den Trog weiterhin sanft, um zu verhindern, dass sich der Protoplast während dieses manuellen Transferschritts aus der Lösung absetzt.
4. Die PEG-Lösung wird in den entsprechenden Trog gegossen und die Transfektionsplatte, die nun Protoplasten und Plasmid-DNA enthält, die mit Schritt 1 hergestellt wurde, an der angegebenen Stelle entsprechend der Deckanordnung abgesetzt.
5. Um eine Protoplasten-Transfektionsmethode zu erstellen, öffnen Sie die Liquid-Handler-Software und führen Sie die unten beschriebenen Schritte aus.
   1. Verschieben von Laborgeräten zwischen Decks: Ersetzen Sie die leere Spitzenbox auf dem Spitzenladedeck durch eine neue, indem Sie den Befehl Laborgeräte verschieben verwenden. Wählen Sie in der Konfigurationsansicht die Decks "Von" und "Bis" aus.
   2. Bei Volumina über 200 μl: Setzen Sie die Spitzen zwischen den Transfers nicht ein. Ladetipps für den ersten Transferschritt und Entladung nach dem letzten Transferschritt, was erfordert, dass die Be- und Entladeoptionen für jeden Transferschritt korrekt angegeben werden, wie in der ergänzenden Abbildung 3 gezeigt.
6. Erstellung des Deck-Layouts: Öffnen Sie wie bei der Methode zur Erstellung von Transfektionsplatten die Liquid-Handler-Software, um eine automatisierte DNA-Transfektionsmethode zu erstellen. Klicken Sie in der Menüleiste auf die Schaltfläche Neue Methode , um eine neue Methode zu erstellen. Fügen Sie eine Instrument-Setup-Linie zwischen der Start- und Ziellinie hinzu, indem Sie die Instrument-Setup-Taste auf der linken Seite drücken. Erstellen Sie ein Deck-Layout entsprechend dem in der ergänzenden Abbildung 1 gezeigten Deck-Layout.
7. Zell-/DNA-Mischung: Fügen Sie einen Schritt hinzu, um Protoplasten und DNA vor der PEG-Zugabe zu mischen, indem Sie die Geräteaktionstaste verwenden und das Gerät einrichten (automatisches Schütteln des Laborgerätepositionierers oder ALP), die Schüttelgeschwindigkeit (1500 U/min) und die Zeit bis zum Schütteln (10 s).
8. PEG-Zugabe und -Mischung: Um die Transfektion zu initiieren, fügen Sie einen Transferschritt hinzu, um 110 μl PEG aus dem PEG-Reservoir mit einer 96-Pod-Pipette hinzuzufügen. Stellen Sie sicher, dass die richtigen Quell- und Zielpositionen gemäß dem angegebenen Deck-Layout programmiert sind. Programmieren Sie den Transferschritt so, dass PEG 1 mm vom Boden des Reservoirs aspiriert wird, und lagern Sie das PEG 3 mm vom Boden der 96-Well-Platte ab, die das Protoplast/DNA-Gemisch enthält. Fügen Sie nach der PEG-Zugabe einen weiteren Schüttelschritt hinzu, indem Sie die zuvor programmierten Schritte kopieren und einfügen.
9. PEG-Inkubation: Fügen Sie einen Pausenschritt hinzu, indem Sie die Pause-Taste drücken, den Shaker auswählen und die vorgegebene Inkubationszeit eingeben, die mit der PEG-Zugabe beginnt.
   HINWEIS: Der Timer für die Pause wird fortgesetzt, es sei denn, es gibt Unterbrechungen oder Unterbrechungen des Lichtvorhangs, die zu einer Fehlermeldung führen würden. Stellen Sie sicher, dass diese Nachrichten gelöscht werden, wenn eine Manipulation des Decks erforderlich ist, bevor Sie weggehen.
10. W5-Pufferzugabe/-mischung: Fügen Sie drei Transferlinien von 200 μl hinzu, um insgesamt 600 μl W5-Puffer auf die Transfektionsplatte zu übertragen, um die PEG-Inkubationsreaktion zu löschen. Nach der Zugabe des W5-Puffers erfolgt durch Schütteln und eine Benutzerpause, um das Zentrifugieren der Transfektionsplatte zu ermöglichen.
11. Benutzerpause 1: Zentrifugieren Sie die Protoplasten-Transfektionsplatte bei 100 x g für 4 min. Bringen Sie die Transfektionsplatte, jetzt mit pelletiertem Protoplasten, wieder in die entsprechende Decksposition. Fügen Sie eine Benutzerpause hinzu, indem Sie auf die Schaltfläche Pause klicken, außer dass jetzt die Option "Das gesamte System anhalten und die Nachricht anzeigen " ausgewählt ist.
    HINWEIS: Das Popup-Fenster mit der Pausenmeldung muss gelöscht werden, bevor der Liquid Handler mit dem Rest des Protokolls fortfahren kann.
12. Entfernen des Überstands: Fügen Sie zwei Linien Transfer hinzu, um 400 μL Überstand zu entfernen, und geben Sie es auf die Abfallplatte. Um eine Zellaspiration bei der Entnahme des Überstands zu vermeiden, stellen Sie den Abstand von unten auf 6 mm ein.
13. WI-Addition/Mischen Fügen Sie 3 Linien Transfer hinzu, um 580 μl WI-Puffer auf die Transfektionsplatte zu übertragen. Fügen Sie nach dem Hinzufügen von WI einen weiteren Schüttelschritt hinzu, indem Sie die zuvor programmierten Schritte kopieren und einfügen. Fahren Sie mit der nächsten Benutzerpause fort.
14. Benutzerpause 2: Zentrifugieren Sie die Protoplasten-Transfektionsplatte bei 100 x g für 4 min. Bringen Sie die Transfektionsplatte, jetzt mit pelletiertem Protoplasten, wieder in die entsprechende Decksposition.
15. Entfernen des Überstands: Fügen Sie vier Zeilen Transfer hinzu, um 680 μL Überstand zu entfernen, und geben Sie es auf die Abfallplatte. Um eine Zellaspiration bei der Entnahme des Überstands zu vermeiden, stellen Sie den Abstand von unten auf 6 mm ein.
16. Übertragung von Protoplasten auf Mikrotiterplatten: Der abschließende Transfer dieses Protokolls besteht aus zwei 150-μl-Transferschritten. Vor jedem einzelnen Schritt sind Protoplasten mit 50 μL/s 2 mm vom Boden der Transfektionsplatte entfernt wiederholt zu aspirieren und bei 3 mm zu dispensieren. Übertragen Sie dann mit denselben Pipettenspitzen auf die Ziel-Mikroplatte.
    HINWEIS: Das Ansaugen und Dispensieren des Puffervolumens über dem Pellet vor dem Transfer auf die Mikroplatte stört alle verbleibenden Protoplasten, die am Boden der Transfektionsplatte pelletiert sind, um sicherzustellen, dass kein Probenverlust auftritt. Da die Randomisierung während der Erstellung der Transfektionsplatte durchgeführt wurde, ist das automatisierte Protokoll damit abgeschlossen.
17. Inkubieren Sie die Mikroplatte bei Raumtemperatur im Dunkeln für 24 bis 48 Stunden, bevor Sie die erste Fluoreszenzmessung durchführen.

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Ergebnisse

Um Beobachtungsdaten zu erhalten, die belegen, dass Kanteneffekte die Antwortmessungen beeinflussen können; Eine Pilotstudie wurde durchgeführt, um diesen Verdacht zu bestätigen. Für diese Studie wurden die oben genannten Methoden auf drei replizierte 96-Well-Platten mit nur einer einzigen Behandlungsstufe angewendet; Alle Protoplasten wurden mit pSYN11250¹⁹ transfiziert, einem Plasmid, das konstitutiv ZsGreen exprimiert, mit dem Ziel, zu zeigen, dass es syste...

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Diskussion

Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Automatisierung der Transfektionsplattenerstellung und der etiolierten Protoplastenisolierung von Maisblättern mit einer automatisierten Transfektion. Für den erfolgreichen Abschluss des Teils der Transfektionsplattenerstellung des Protokolls ist ein automatisierter Liquid-Handling-Roboter erforderlich, der mit einem 8-Kanal-Pod ausgestattet ist. Für das Transfektionsprotokoll wird ein 96-Well-Pod für eine vollständige und gleichmäßig...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
(2)β-mercaptoethanol	Sigma	M6250
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrate	Sigma	69892
50mL centrifuge tubes with flat cap sterile	Fisher	22-010-064
96 Well Optical Btm Plt PolymerBase Black w/Lid Cell Culture Sterile PS .4mL Well	Fisher	12-566-70
Axygen Biomek FX/NX Robotic Tips, non-sterile, Wide Bore	Fisher	14-222-096
Axygen Robotic Tips 30uL filter, sterile, racked	Fisher	14-222-103
Bel-Art SP Scienceware Lab Companion Round Style Vacuum Desiccators	Fisher	08-648-10
Bemis 2 IN. X 250 Ft. Roll Laboratory Parafilm	Fisher	13-374-16
Biomek FXP	Beckman Coulter	902508
Calcium chloride dihydrate	Sigma	C5080
Chemglass Life Sciences Disposable Hemocytometer	Fisher	50-131-1352
Clorox Germicidal Bleach, Concentrated	Fisher	NC1871274
Corning Microplate Aluminum Sealing Tape	Fisher	07-200-684
Corning 96-Well assay Blocks, 2mL, 96 well standard	Fisher	07-200-701
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	10197777001
D-Mannitol	Sigma	M9546
Fisherbrand 60mL Plastic Syringe	Fisher	14-955-461
Fisherbrand Sterile Cell Strainer 40um	Fisher	22-363-547
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, Stackable, 100 mm x 25 mm, Case of 325	Fisher	FB0875711
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	M2670
Millex Syringe-driven Filter Unit Sterile 33mm PES .22um	Fisher	SLGPR33RS
Millex Syringe-driven Filter Unit Sterile 33mm PVDF.45um	Fisher	SLHAR33SS
MillliporeSigma Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units 50mL PES	Fisher	SCGP00525
Poly(ethylene glycol) 4000	Sigma	81240
Redi-Earth Plug & Seedling Mix	Wyatt Quarles	GP92747
Regular Duty Single Edge Razor Blades steel back .009RD	Fisher	12-640
Research Products International Corp Cellulase RS	Fisher	50-213-232
Research Products International Corp Macerozyme R-10	Fisher	50-213-444
Sodium chloride	Sigma	S7653
Tray Insert - 36 Cell - 6x6 Nested	Hummert	11635000
Tween-20	Sigma	P1379
VACUUBRAND ME1 Vacuum Pump, 100-120V, 50/60 Hz, US plug	VWR	97058-164