用于半水培根系渗出物分析的多功能玻璃罐系统

摘要

我们提出了一种基于玻璃的半水培实验系统的方案，该系统支持各种系统发育上不同的植物的生长，有或没有微生物。该系统与不同的生长培养基兼容，并允许对下游分析进行无损根系渗出物采样。

摘要

根系分泌物塑造植物-土壤界面，参与养分循环并调节与土壤生物的相互作用。根系渗出物是动态的，并受生物、环境和实验条件的影响。由于其广泛的多样性和低浓度，准确的渗出物谱很难确定，在存在其他生物的自然环境中更是如此，将植物衍生的化合物翻转并自行产生其他化合物。这里介绍的半水培玻璃罐实验系统可以控制生物、环境和实验因素。它允许各种系统发育不同的植物物种在各种不同的生长培养基中生长长达数月，无论有没有微生物。玻璃基设计提供低代谢物背景，可重复使用，因此可重复使用，因此具有高灵敏度和低环境影响。渗出物可以无损取样，如果需要，可以在实验过程中改变条件。该装置与质谱分析和其他下游分析程序兼容。总之，我们提出了一种多功能生长系统，适用于各种条件下的敏感根系渗出物分析。

引言

在人口稠密的土壤中，根际呈现出富含碳的生态位。它由植物根系通过渗出高达 20% 的同化碳形成，并含有与常驻土壤微生物组^{1、2、3、4、5、6} 不同的微生物群落。随着研究人员正在挖掘根系相关微生物的有益功能以及随之而来的可持续农业^潜力7，这种通常被称为根际效应的观察结果一直是日益增长的科学努力的焦点。然而，到目前为止，微生物和植物之间的化学对话被认为是根际效应的驱动因素，仍然知之甚少，因此，对农业中开发可靠微生物解决方案的机理理解是有限的^8,9,10。

在土壤环境中破译根系分泌物并不容易，因为土壤环境中的代谢物很容易被土壤颗粒吸收并迅速被微生物群落转化，特别是对于具有细根系的植物物种，例如模式植物 拟南芥¹¹。 这就是为什么在大多数研究中，根系渗出物是从水培系统中取样的。在这些微观世界中，植物的地上部分由定制的植物支架或更低调的材料（如网状、琼脂和玻璃珠）固定到位。使用的容器范围从多孔板上的培养皿到带或不带曝气过滤器的各种定制和商业箱^{12、13、14、15、16、17、18、19}。根据系统的不同，植物的生长条件会有很大的不同，并或多或少地反映自然条件。

在这里，我们提出了一种基于玻璃的半水培系统，该系统在实验上是可行的，并产生高度可重复的结果。它易于组装和使用，并且基于常用材料。该系统基于一个装满玻璃珠的玻璃罐，利用了玻璃器皿的可重复使用性和低结合特性（图1）。与水培装置相比，珠子为生长中的植物提供物理支撑并模拟机械阻抗，有助于形成更像土壤的根系结构19,20,21。如果接种了微生物，玻璃珠会呈现细菌附着的表面。

玻璃罐可以关闭以保持无菌，系统的设计允许足够的顶部空间和空气流通，避免湿度饱和的环境。这些罐子适合不同植物物种的长期生长，可以使用不同尺寸的罐子按比例放大和缩小。这里显示了六种植物的应用，涵盖 C3 和 C4 草、双子叶植物和豆科植物。其中包括模式种拟南芥（双子叶植物）、短足双子叶植物（C3单子叶植物）、蒺藜（豆科植物），以及番茄、双子叶植物、小麦（小麦、C3单子叶植物）和双色高粱（高粱、C4单子叶植物）等作物物种。提出的方案包括系统的实验设置、六种植物物种的种子灭菌和发芽、将幼苗移植到罐子、不同的生长培养基、微生物接种、根系分泌物取样和分泌物处理以进行分析。

研究方案

1.幼苗的准备：种子的表面灭菌

注意：除非另有说明，否则种子的表面灭菌和所有后续步骤必须在无菌条件下进行。步骤 1.1 至 1.4 专门用于 拟南芥 种子的表面灭菌。其他植物物种在管大小（取决于种子数量和种子大小）、溶液时间和灭菌溶液方面具有替代变化（表1）。

1. 将种子加入微量离心管（最大20mg种子）中，并用70%乙醇覆盖种子。
   注意：乙醇是易燃的。请勿在明火附近使用。
2. 将封闭的微量离心管移至振荡器中15分钟，并设置旋转，使种子轻轻搅拌。
3. 用移液管小心地除去70%乙醇，并用100%乙醇代替。重复步骤 1.2。
4. 除去100%乙醇，将微量离心管盖在无菌气流中打开，使种子干燥。
5. 种子干燥后，通过轻弹试管或使用无菌镊子将它们均匀地铺在含有 0.7% 植物琼脂的 0.5x Murashige 和 Skoog （MS） 培养基上。关闭琼脂平板并用1.25cm微孔胶带密封。
6. 将平板水平放置在生长室的架子上（16小时光照/ 8小时黑暗，22°C白天/18°C夜间，150-160μmolm-2 ^s-1）。

2.幼苗的准备：将发芽的种子转移到新鲜的盘子中

注意：以下步骤是针对 拟南芥 的，其他物种不需要。

1. 发芽后，将5至6株幼苗转移到新的0.7%植物琼脂平板上，用0.5x MS培养基将幼苗线性放置，距顶部约3厘米（参见 图2D中莲座结的位置）。
2. 用1.25cm微孔胶带密封琼脂平板，并在生长室中垂直生长（图2D），直到幼苗准备好在发芽后15-18天转移到罐中（表2）。

3.水培系统的准备：罐子设置

1. 向每个干净的罐子中加入150mL干净的5mm玻璃珠，并用盖子盖上（图1A）。
   注意：在本协议中，5 mm玻璃珠适用于大多数物种²²，但可以根据需要调整珠子尺寸。
2. 在封闭的罐子上放置足够的铝箔，以覆盖盖子到罐子的连接处并高压灭菌（121°C20分钟）（图1B）。
3. 将准备好的罐子盖上盖子，直到植物准备好转移（表2）。

4.水培系统的准备：添加幼苗

1. 当幼苗准备好转移到罐子中时（表2），在无菌工作台上取下铝箔和罐子的盖子。
2. 如果要在罐子中接种细菌，请在继续执行步骤 4.3 之前执行以下步骤;否则，请跳过步骤 4.2。
   1. 使用无菌接种环，从琼脂平板上的纯细菌培养物中挑选单个菌落，并将它们悬浮在750μL无菌10mM MgCl₂中。重复直到溶液浑浊。
   2. 可选：用 750 μL 无菌 10 mM MgCl₂ 洗涤悬浮液 3 次，在 1,000 × g 和室温下离心 5 分钟，然后除去上清液并将沉淀重悬于 750 μL 10 mM MgCl₂ 中。
   3. 可选：如果接种几种不同的细菌种类，则在继续之前以相等的比例混合步骤4.2.1-4.2.2中制备的单一菌株的悬浮液。
   4. 在0.5x MS培养基（pH 5.7至5.9，用KOH调节）或其他选择的生长培养基中将波长为600nm（OD₆₀₀）的光密度调节至0.2-0.4（参见步骤4.3）。再次测量OD₆₀₀ 以检查溶液是否正确稀释。
      注意：KOH具有腐蚀性;戴上手套和实验室外套。
   5. 在同一培养基中将悬浮液进一步稀释至OD₆₀₀ 0.002-0.004（1：100稀释）。
      注意：最终细胞密度将取决于所使用的细菌菌株，但根据我们的经验，该接种物大约相当于 3-6 × 10⁵ 个细胞 ^mL-1。
   6. 每罐加入 35 mL 最终稀释液。加入 35 mL 无菌生长培养基以对照罐。在植物转移之前，搅拌珠子以均匀地涂上0.5x MS培养基，使根部不会干燥。继续执行步骤 4.4。
3. 向每个罐中加入 35 mL 0.5x MS 培养基（pH 5.7 至 5.9，用 KOH 调节）。在植物转移之前，搅拌珠子以均匀地涂上0.5x MS培养基，使根部不会干燥。
   注意：生长培养基可以进行修改，例如，通过去除营养物质，添加渗透压以诱导盐胁迫，或使用不同的pH值或生长培养基。注意：KOH具有腐蚀性;戴上手套和实验室外套。
4. 将 3-5 株拟南芥 植物放入罐子中，将根系放在玻璃珠之间。
   注意：其他物种每个罐子的植物数量不同（表2）。
5. 用无菌镊子或勺子移动珠子以覆盖根部并将叶子从培养基中取出（图1C）。
   注意： 小心移动植物和珠子，以免折断根部并给植物带来压力。
6. 在罐子顶部添加 2 条 1.25 厘米的微孔胶带，然后轻轻地将盖子放在顶部（图 1D-F）。
   注意： 请勿向下推盖子，以免阻碍空气交换。
7. 用2.5cm微孔胶带覆盖盖子和罐子之间的间隙，以保持无菌，同时允许空气交换，并将罐子放入生长室中（图1G，H）。
8. 每个实验条件设置 4-8 个罐子，具体取决于生物学问题和预期的变异性。
9. 确保包括生物阴性对照（例如，没有植物的罐子）以解释实验系统的代谢物背景。为阴性对照设置与实验处理（例如，四份）相同的重复数。
10. 对于延长的生长期，每周更换生长培养基：用 25 mL 容量移液管取出剩余的生长培养基，并加入 35 mL 新鲜培养基。

5. 根系渗出物的收集

1. 当植物达到所需的年龄时，在无菌工作台上取下2.5厘米的微孔胶带和盖子。
   注意：对于在我们的生长条件下的 拟南芥 ，发芽后 21 天代表开花前的成熟营养阶段。营养发育阶段因植物种类而异，生长期随植物种类而变化;这个时间可以根据研究问题进行修改。
2. 对于无菌测试，将 20 μL 生长培养基等分试样并移液到 LB 琼脂平板上。
   1. 对于接种罐，分装 100 μL 生长培养基以用于菌落形成单位 （CFU） 计数（例如，在稀释系列²³ 中）。
      注意：根据我们的经验，细菌密度在生长培养基的 10 5-10 ⁸ 活细胞 ^mL-1 以内。
3. 用 25 mL 容量移液管尽可能多地去除生长培养基，避免损坏根部。
4. 加入 50 mL 收集培养基（例如，20 mM 醋酸铵;pH 5.7-5.9，用 HCl 调节），沿罐壁移液以避免弄湿叶子。用盖子关闭罐子，并在无菌条件下孵育，以获得所需的渗出液收集时间。对于时间敏感的实验，2小时是一个很好的收集窗口。
   注意： HCl 具有腐蚀性;戴上手套和实验室外套。为了延长根系渗出物收集时间，再次用胶带包裹盖子，然后将罐子移至生长室。
5. 2 小时后，将所需量的收集培养基移入试管中（例如，50 mL 用于使用浓缩渗出物进行测定或分析，或 2 mL 用于直接使用）。将收集的根系渗出物储存在-80°C直至进一步处理或分析。
   1. 当使用接种罐时，将收集的渗出物在5,000× g 和4°C下离心10分钟，并且仅使用上清液进行分析。或者，用 0.22 μm 或 0.45 μm 过滤器对渗出物进行过滤灭菌。
6. 如果实验是时间序列的一部分，则从罐中取出所有剩余的收集培养基，并加入 35 mL 0.5x MS 培养基。在将罐子放回生长室之前，更换盖子和 2.5 厘米胶带。
7. 在一个罐子中测量所有植物的根部和芽鲜重，以便稍后按植物重量使根系分泌物正常化。
   注意：如果需要，可以另外对植物组织进行采样。

6. 处理根系渗出物进行质谱分析

1. 根据分析方法，冷冻干燥根系渗出物以浓缩并除去收集介质（-80°C，0.37mbar，直到不存在液体）。储存在-80°C，直到准备分析。
   注：此处提供的数据是在精确质量的四极杆飞行时间仪器上通过流式进样TOF-MS分析生成的。
2. 在注入分析仪器之前，根据根新鲜重量，用收集培养基重新配制冻干渗出物或稀释未处理的根系渗出物。
   注意：选择的收集介质与质谱仪兼容。然而，根据分析方法的不同，在进样前可能需要脱盐步骤。

讨论

这里介绍的实验系统基于玻璃罐和玻璃珠，因此提供了一个简单、低维护和多功能的半水培系统来研究各种情况下的根部渗出。它已被用于研究不同植物物种的渗出剖面²⁵，渗出对不同生长条件^的响应25，以及土壤理化性质对渗出的影响²²。该系统适用于在这里测试的所有植物物种，生长期从数周到数月不等。无菌条件的维持很简单，细菌接种也很简单，细菌在分析的 2 周生长期内持续存在。因此，该实验系统不仅允许在无菌条件下受控收集根系分泌物，而且还可用于研究植物与微生物的相互作用。此外，植物生长培养基可以变化以研究对不同营养水平的代谢反应，并且可以通过适应光照条件或使用不同尺寸的罐子来调整生长期。

在水培或半水培条件下研究根系渗出物仍然是该领域的标准，这主要是因为低浓度代谢物的分辨率提高¹¹。许多水培方法依赖于培养皿、多孔板或其他小容器，这些容器允许无菌和高通量，但将实验限制在高湿度环境中生长的小植物或幼苗17,18,26,27。在所展示的玻璃罐设置中，相对较大的罐子提供了足够的顶部空间，从而延长了生长期。微孔带条可确保空气交换，同时保持无菌。因此，即使是大麦和玉米等高大的单子叶植物也可以在玻璃罐中生长数周。拟南芥和三叶草等小型植物在发芽后可以研究 4-5 周，包括营养和生殖阶段。

大型工厂也可以使用替代的水培装置，但这些装置通常需要定制的盒子和入口，这些盒子和入口由网、泡沫板和用于植物支撑的植入篮^制成 15,28,29,30。此外，这些设备通常不是无菌的，或者它们需要具有挑战性的设置和维护程序才能使它们免受微生物和/或化学污染。在所提出的实验系统中设置和维持无菌性很简单。此外，玻璃用于罐子和珠子可以减少从塑料中浸出的污染物的存在，并节省资源，因为它可以很容易地清洗和重复使用。

以前已经应用玻璃珠来模拟土壤颗粒。它们在根系渗出采样装置（如渗出阱³¹）或其他半水培系统¹⁹中诱导根系的自然发育。玻璃罐装置利用了这一发展，并将珠子作为微生物的定植表面引入。在土壤中，植物根部周围的微生物组在半固体环境中进化，具有致密的颗粒和充满空气或水的空间。尽管玻璃罐的设置不包括生长培养基的主动曝气，因此较低的液相可能不包含最佳的氧气水平，但较大的珠体积与较小的生长介质体积的结合会产生潮湿但通气的上层相，微生物可以在含氧条件下生长。其他人提议摇晃生长容器^26,28或使用与空气泵^19,29耦合的管道来维持水培生长系统中的空气供应。然而，这些系统要么被设置为非无菌，要么需要专门的材料和持续的监测来保持无菌。此外，在摇晃的情况下，要注意避免枝条淹没在生长溶液中并损坏根系。然而，如果需要，可以用额外的曝气材料来调整所提出的实验装置。

在所有研究新陈代谢的植物-微生物相互作用研究中要考虑的一个关键方面是微生物降解植物来源的化合物并自行产生代谢物。如果没有专门的无菌实验装置，就不可能区分植物和微生物衍生的代谢物。为了抑制微生物活性并富集植物来源的化合物，Oburger等人提出对根系渗出物取样溶液进行化学灭菌以抑制细菌降解³²。可以在所提出的实验系统中研究化学抑制剂的作用，比较用或不用抑制剂处理的无菌植物与非无菌植物的渗出曲线。

所展示的玻璃罐设置的一个主要限制是，与土壤相比，生长条件仍然非常人工。土壤种植植物的渗出物通常从渗滤系统¹³收集，其中溶剂流过收集在生长容器的底部，或土壤-水培混合系统，其中植物最初在土壤中生长，然后转移到水培条件^16,33。与玻璃罐设置相比，这些程序通常是破坏性的，不允许在不断变化的生长环境中随着时间的推移进行多次收集。此外，在渗滤系统中，土壤背景与渗出物一起取样，而在土壤-水培混合系统中，通过转移到水培条件进行渗出物收集，可以规避土壤代谢背景高的问题。尽管已经实施了恢复时间以减少通过受伤根系的代谢物泄漏¹¹，但植物转移非常具有破坏性，伤口可能会持续存在，并且植物代谢可能会因转移到水培条件而改变。此外，在许多情况下，渗透冲击是通过将植物转移到水中而不是合适的生长溶液中而引起的^16,33。在所提出的方案中，生长溶液与等摩尔溶液交换以保持渗透平衡，仍然允许在短时间内捕获渗出物。在许多已发表的研究中，生长溶液的改变是常见的做法，并且可以在水培装置中轻松实现，而不会造成根部损伤12,16,26,34。由于其多功能性，所提出的实验系统可以很容易地适应模拟更多的自然条件，例如，通过使用无菌或非无菌土壤提取物作为生长溶液，无论是否存在固体土壤颗粒。向自然条件的逐渐变化允许研究不同理化土壤性质和微生物存在对植物新陈代谢和生理学的影响。在科学界对各种环境中的渗出有很好的了解之前，最好同时使用土壤和水培系统，因为这两种设置都有其优点和局限性¹³.

总之，所提出的半水培、玻璃基实验装置因其简单性和应用的高度通用性而脱颖而出。它提供了一种可行、低成本的方法来收集和研究无菌条件下的渗出物，或结合微生物和植物-微生物相互作用。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar powder for bacteriology	VWR	20767.298
Aluminum foil	FORA GmbH
Ammonium acetate	Sigma-Aldrich	32301-1KG	ACS reagent, Eur >- 98%
Autoclave VX-150	Systec	1150
Balance	Sartorius	QUINTIX64-1S
Centrifuge	Hermle Labortechnik GmbH	305.00 V05
Cuvettes	Greiner Bio-One	613101
Difco LB Broth, Lennox	BD	240210
Ethanol	Reuss-Chemie AG	RC-A15-A-005L
Filtered deionized water	Merck Millipore	Milli-Q IQ7000
Glass beads	Carl Roth	HH56.1	5 mm
Hydrochloric acid	Merk	1.00317.1000
Inoculation loop	Karl Hammacher GmbH	HWO_070-21
Jars	Weck	105741	850 mL
Lyophilizer	Christ	Alpha 2-4 LSCplus
Magnesium chloride hexahydrate	Carl Roth	2189.1
Matrix Orbital thermoshaker	IKA	10006248
Microcentrifuge tube	Sarstedt AG & Co. KG	72.695.500	SafeSeal reaction tube, 2 mL, PP
Micropore tape	3M	1530-0	1.25 cm x 9.1 m
Micropore tape	3M	1530-1	2.5 cm x 9.1 m
Murashige & Skoog Medium (MS)	Duchefa Biochemie	M0221.0050
Growth chamber	Percival	SE41-TLCU4	16 hour light/8 dark. 22 °C day/18 night
Phyto agar	Duchefa Biochemie	P1003.1000
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	8.14353.0100
SmartSpec Plus Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2525
Sodium hypochlorite solution, 12% Cl	Carl Roth	9062.4
Square petri dish	Greiner Bio-One	688102	120x120x17 mm, with vents
Stericup Quick release	Millipore	S2GPU05RE	0.22 µm PES, 500 mL
Sterile bench	FASTER S.r.l.	FlowFast H 18