Ein vielseitiges Glasgefäßsystem für die semihydroponische Profilierung von Wurzelexsudat

Zusammenfassung

Wir stellen ein Protokoll für ein glasbasiertes, semihydroponisches Versuchssystem vor, das das Wachstum einer Vielzahl von phylogenetisch unterschiedlichen Pflanzen mit oder ohne Mikroben unterstützt. Das System ist mit verschiedenen Nährmedien kompatibel und ermöglicht eine zerstörungsfreie Wurzelexsudatprobenahme für die nachgelagerte Analyse.

Zusammenfassung

Wurzelexsudate prägen die Grenzfläche zwischen Pflanze und Boden, sind am Nährstoffkreislauf beteiligt und modulieren Wechselwirkungen mit Bodenorganismen. Wurzelexsudate sind dynamisch und werden durch biologische, umweltbedingte und experimentelle Bedingungen geformt. Aufgrund ihrer großen Vielfalt und niedrigen Konzentrationen ist es schwierig, genaue Exsudatprofile zu bestimmen, insbesondere in natürlichen Umgebungen, in denen andere Organismen vorhanden sind, die pflanzliche Verbindungen abgeben und selbst zusätzliche Verbindungen produzieren. Das hier vorgestellte semihydroponische Glasgefäß-Versuchssystem ermöglicht die Kontrolle über biologische, ökologische und experimentelle Faktoren. Es ermöglicht das Wachstum verschiedener phylogenetisch unterschiedlicher Pflanzenarten für bis zu mehrere Monate mit oder ohne Mikroben, in einer Vielzahl unterschiedlicher Nährmedien. Das glasbasierte Design bietet einen Hintergrund mit niedrigem Metabolitengehalt für eine hohe Empfindlichkeit und geringe Umweltbelastung, da es wiederverwendet werden kann. Exsudate können zerstörungsfrei entnommen werden, und die Bedingungen können im Laufe eines Experiments auf Wunsch verändert werden. Der Aufbau ist kompatibel mit der Massenspektrometrie und anderen nachgelagerten Analyseverfahren. Zusammenfassend stellen wir ein vielseitiges Wachstumssystem vor, das für die empfindliche Analyse von Wurzelexsudat unter einer Vielzahl von Bedingungen geeignet ist.

Einleitung

In dicht besiedelten Böden stellt die Rhizosphäre eine kohlenstoffreiche Nische dar. Es wird von Pflanzenwurzeln durch die Ausscheidung von bis zu 20 % des assimilierten Kohlenstoffs geformt und beherbergt mikrobielle Gemeinschaften, die sich vom ansässigen Bodenmikrobiom unterscheiden 1,2,3,4,5,6. Da Forscher die nützlichen Funktionen von wurzelassoziierten Mikroben und das damit verbundene Potenzial für eine nachhaltige Landwirtschaft erschließen⁷, steht diese Beobachtung, die oft als Rhizosphäreneffekt bezeichnet wird, im Mittelpunkt wachsender wissenschaftlicher Bemühungen. Bisher ist der chemische Dialog zwischen Mikroorganismen und Pflanzen, der als Treiber des Rhizosphäreneffekts angesehen wird, jedoch nur unzureichend verstanden, so dass das mechanistische Verständnis für die Entwicklung zuverlässiger mikrobieller Lösungen in der Landwirtschaft begrenzt ist ^8,9,10.

Die Entschlüsselung von Wurzelexsudaten in Bodenumgebungen, in denen Metaboliten leicht von Bodenpartikeln aufgenommen und schnell von mikrobiellen Gemeinschaften umgewandelt werden, ist nicht einfach, insbesondere für Pflanzenarten mit feinem Wurzelsystem wie die Modellpflanze Arabidopsis thaliana¹¹. Aus diesem Grund werden in den meisten Studien Wurzelexsudate aus hydroponischen Systemen entnommen. In diesen Mikrokosmen werden die oberirdischen Pflanzenteile durch maßgeschneiderte Pflanzenhalter oder unauffälligere Materialien wie Mesh, Agar und Glasperlen an Ort und Stelle gehalten. Die verwendeten Behälter reichen von Petrischalen über Multiwell-Platten bis hin zu verschiedenen kundenspezifischen und kommerziellen Boxen mit oder ohne Belüftungsfilter 12,13,14,15,16,17,18,19. Je nach System variieren die Wachstumsbedingungen der Pflanzen stark und spiegeln mehr oder weniger die natürlichen Bedingungen wider.

Hier stellen wir ein glasbasiertes, semihydroponisches System vor, das experimentell zugänglich ist und hochgradig reproduzierbare Ergebnisse liefert. Es ist einfach zu montieren und zu verwenden und basiert auf allgemein verfügbaren Materialien. Das System basiert auf einem Glasgefäß, das mit Glasperlen gefüllt ist, und nutzt die Wiederverwendbarkeit und die geringen Bindungseigenschaften von Glaswaren (Abbildung 1). Die Perlen bieten physische Unterstützung für die wachsende Pflanze und simulieren mechanische Impedanz, was im Vergleich zu hydroponischen Aufbauten zu einer erdähnlicheren Wurzelarchitektur beiträgt 19,20,21. Wenn die Glasperlen mit Mikroben beimpft werden, bieten sie Oberflächen, an die sich Bakterien anheften können.

Das Glasgefäß kann geschlossen werden, um die Sterilität zu gewährleisten, und das System ist so konzipiert, dass es ausreichend Kopfraum und Luftzirkulation ermöglicht, um eine mit Feuchtigkeit gesättigte Umgebung zu vermeiden. Die Gläser eignen sich für das längere Wachstum verschiedener Pflanzenarten und können mit unterschiedlich großen Gläsern vergrößert und verkleinert werden. Hier werden Anwendungen für sechs Pflanzenarten gezeigt, darunter C3- und C4-Gräser, Dielen und Leguminosen. Darunter befinden sich die Modellarten A. thaliana (Dikotyledon), Brachypodium distachyon (C3-Monokotyledon), Medicago truncatula (Hülsenfrucht ) sowie Nutzpflanzenarten wie Solanum lycopersicum (Tomate, Dikotyledon), Triticum aestivum (Weizen, C3-Monokotyledon) und Sorghum bicolor (Sorghum, C4-Monokotyledon). Das vorgestellte Protokoll umfasst den Versuchsaufbau des Systems, die Sterilisation und Keimung von sechs Pflanzenarten, die Transplantation von Sämlingen in Gläser, verschiedene Wachstumsmedien, die Inokulation von Mikroben, die Probenahme von Wurzelexsudat und die Verarbeitung von Exsudat für die Analytik.

Protokoll

1. Vorbereitung der Sämlinge: Oberflächensterilisation des Saatguts

HINWEIS: Die Oberflächensterilisation von Saatgut und alle folgenden Schritte müssen unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben. Die Schritte 1.1 bis 1.4 sind spezifisch für die Oberflächensterilisation von A. thaliana-Samen . Andere Pflanzenarten haben alternative Variationen in der Röhrchengröße (abhängig von der Anzahl der Samen und der Samengröße), der Zeit in Lösungen und Sterilisationslösungen (Tabelle 1).

1. Samen in ein Mikrozentrifugenröhrchen geben (maximal 20 mg Samen) und die Samen mit 70% Ethanol bedecken.
   ACHTUNG: Ethanol ist brennbar. Nicht in der Nähe von offenem Feuer verwenden.
2. Die geschlossenen Mikrozentrifugenröhrchen für 15 Minuten in einen Schüttler stellen und die Rotation so einstellen, dass die Samen sanft bewegt werden.
3. Entfernen Sie vorsichtig 70% Ethanol mit einer Pipette und ersetzen Sie es durch 100% Ethanol. Wiederholen Sie Schritt 1.2.
4. Entfernen Sie 100% Ethanol und trocknen Sie die Samen, indem Sie die Deckel der Mikrozentrifugenröhrchen in einem sterilen Luftstrom geöffnet lassen.
5. Sobald die Samen trocken sind, verteilen Sie sie gleichmäßig auf 0,5x Murashige und Skoog (MS) Medium mit 0,7% Phyto-Agar, indem Sie die Tube schnippen oder eine sterile Pinzette verwenden. Verschließen Sie die Agarplatten und verschließen Sie sie mit einem 1,25 cm langen Mikroporenband.
6. Platzieren Sie die Platten waagerecht auf einem Regal in der Wachstumskammer (16 h hell/8 h dunkel, 22 °C Tag/18 °C Nacht, 150-160 μmol ^{m-2 s-1}).

2. Vorbereitung der Setzlinge: Umfüllen der gekeimten Samen auf frische Teller

HINWEIS: Die folgenden Schritte sind spezifisch für A. thaliana und für andere Arten nicht erforderlich.

1. Übertragen Sie nach der Keimung 5 bis 6 Sämlinge auf neue 0,7%ige Phyto-Agarplatten mit 0,5x MS-Medium, indem Sie die Sämlinge linear, etwa 3 cm von der Oberseite entfernt platzieren (siehe Position der Rosette in Abbildung 2D).
2. Versiegeln Sie die Agarplatten mit einem 1,25 cm langen Mikroporenband und lassen Sie sie vertikal in der Wachstumskammer wachsen (Abbildung 2D), bis die Sämlinge 15-18 Tage nach der Keimung bereit sind, in Gläser umgefüllt zu werden (Tabelle 2).

3. Vorbereitung des hydroponischen Systems: Jar-Setup

1. Geben Sie 150 ml saubere 5-mm-Glasperlen in jedes saubere Glas und verschließen Sie es mit dem Deckel (Abbildung 1A).
   HINWEIS: In diesem Protokoll sind 5-mm-Glasperlen für die meisten Arten²² geeignet, aber die Perlengröße kann auf Wunsch angepasst werden.
2. Legen Sie genügend Aluminiumfolie über die geschlossenen Gläser, um die Verbindung zwischen Deckel und Glas zu bedecken, und autoklavieren Sie (121 °C für 20 Minuten) (Abbildung 1B).
3. Bewahren Sie die vorbereiteten Gläser abgedeckt auf, bis die Pflanzen bereit sind, umgefüllt zu werden (Tabelle 2).

4. Vorbereitung des hydroponischen Systems: Zugabe von Sämlingen

1. Wenn die Sämlinge bereit sind, in Gläser umgefüllt zu werden (Tabelle 2), entfernen Sie die Aluminiumfolie und die Deckel der Gläser in der sterilen Bank.
2. Wenn die Gläser mit Bakterien beimpft werden sollen, führen Sie die folgenden Schritte durch, bevor Sie mit Schritt 4.3 fortfahren. Andernfalls überspringen Sie Schritt 4.2.
   1. Unter Verwendung einer sterilen Impfschleife werden einzelne Kolonien aus reinen Bakterienkulturen auf Agarplatten entnommen und in 750 μl sterilem 10 mM MgCl₂ suspendiert. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die Lösung trüb ist.
   2. Optional: Waschen Sie die Suspension 3x mit 750 μl sterilem 10 mM MgCl₂ durch 5 min Zentrifugation bei 1.000 × g und Raumtemperatur, gefolgt von der Entfernung des Überstands und der Resuspension des Pellets in 750 μl 10 mM MgCl₂.
   3. Optional: Wenn mehrere verschiedene Bakterienarten geimpft werden, mischen Sie die in den Schritten 4.2.1 bis 4.2.2 hergestellten Suspensionen einzelner Stämme in gleichen Verhältnissen, bevor Sie fortfahren.
   4. Stellen Sie die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm (OD₆₀₀) auf 0,2-0,4 in 0,5x MS-Medium (pH 5,7 bis 5,9, eingestellt mit KOH) oder einem anderen Wachstumsmedium Ihrer Wahl ein (siehe Schritt 4.3). Messen Sie den OD₆₀₀ erneut, um zu überprüfen, ob die Lösung richtig verdünnt wurde.
      VORSICHT: KOH ist korrosiv; Tragen Sie Handschuhe und Laborkittel.
   5. Die Suspension wird im gleichen Medium weiter auf OD₆₀₀ 0,002-0,004 verdünnt (Verdünnung 1:100).
      HINWEIS: Die endgültige Zelldichte hängt vom verwendeten Bakterienstamm ab, aber unserer Erfahrung nach entspricht dieses Inokulum etwa 3-6 × 10⁵ Zellen ^ml-1.
   6. Fügen Sie 35 ml der endgültigen Verdünnung pro Glas hinzu. Geben Sie 35 ml steriles Nährmedium in Kontrollgläser ein. Rühren Sie die Perlen um, um sie vor dem Pflanzentransfer gleichmäßig mit 0,5x MS-Medien zu bedecken, damit die Wurzeln nicht austrocknen. Fahren Sie mit Schritt 4.4 fort.
3. Geben Sie 35 ml 0,5x MS-Medium in jedes Glas (pH 5,7 bis 5,9, mit KOH einstellen). Rühren Sie die Perlen um, um sie vor dem Pflanzentransfer gleichmäßig mit 0,5x MS-Medien zu bedecken, damit die Wurzeln nicht austrocknen.
   HINWEIS: Das Nährmedium kann z. B. durch die Entfernung von Nährstoffen, die Zugabe von Osmolyten zur Induktion von Salzstress oder die Verwendung unterschiedlicher pH-Werte oder Wachstumsmedien modifiziert werden. VORSICHT: KOH ist korrosiv; Tragen Sie Handschuhe und Laborkittel.
4. Setze 3-5 A. thaliana-Pflanzen in ein Glas, indem du das Wurzelsystem zwischen die Glasperlen legst.
   HINWEIS: Die Anzahl der Pflanzen pro Glas ist bei anderen Arten unterschiedlich (Tabelle 2).
5. Bewegen Sie die Perlen mit einer sterilen Pinzette oder einem Löffel, um die Wurzeln zu bedecken und die Blätter aus dem Medium zu heben (Abbildung 1C).
   HINWEIS: Bewegen Sie die Pflanzen und Perlen vorsichtig, um zu vermeiden, dass die Wurzeln brechen und die Pflanzen gestresst werden.
6. Legen Sie 2 Streifen 1,25 cm Mikroporenband über die Oberseite der Gläser und legen Sie den Deckel vorsichtig darauf (Abbildung 1D-F).
   HINWEIS: Drücken Sie den Deckel nicht nach unten, um den Luftaustausch nicht zu behindern.
7. Decken Sie den Spalt zwischen Deckel und Glas mit 2,5 cm Mikroporenband ab, um die Sterilität zu erhalten und gleichzeitig den Luftaustausch zu ermöglichen, und stellen Sie die Gläser in eine Wachstumskammer (Abbildung 1G,H).
8. Stellen Sie 4-8 Gläser pro Versuchsbedingung auf, abhängig von der biologischen Fragestellung und der zu erwartenden Variabilität.
9. Stellen Sie sicher, dass Sie biologische Negativkontrollen (z. B. Gläser ohne Pflanzen) einbeziehen, um den Metabolitenhintergrund des Versuchssystems zu berücksichtigen. Richten Sie für Negativkontrollen die gleiche Anzahl von Replikaten ein wie für experimentelle Behandlungen (z. B. Vierfache).
10. Bei längeren Wachstumsperioden das Wachstumsmedium wöchentlich austauschen: Entfernen Sie den Rest des Wachstumsmediums mit einer volumetrischen 25-ml-Pipette und fügen Sie 35 ml frisches Medium hinzu.

5. Sammlung von Wurzelexsudaten

1. Wenn die Pflanzen das gewünschte Alter erreicht haben, entfernen Sie das 2,5 cm lange Mikroporenband und den Deckel in der sterilen Bank.
   HINWEIS: Für A. thaliana unter unseren Wachstumsbedingungen stellen 21 Tage nach der Keimung ein reifes vegetatives Stadium vor Beginn der Blüte dar. Das vegetative Entwicklungsstadium ist spezifisch für die Pflanzenart, und der Zeitpunkt der Wachstumsperiode ändert sich je nach Pflanzenart; Dieses Timing kann je nach Fragestellung modifiziert werden.
2. Für die Sterilitätsprüfung werden 20 μl Wachstumsmedium aliquotiert und auf LB-Agarplatten pipettiert.
   1. Bei inokulierten Gläsern werden 100 μl Wachstumsmedium aliquotiert, um es für die Anzahl der koloniebildenden Einheiten (KBE) zu verwenden (z. B. in einer Verdünnungsreihe²³).
      HINWEIS: Unserer Erfahrung nach liegen die Bakteriendichten zwischen 10^{5-10 8} lebenden Zellen ^ml-1 des Wachstumsmediums.
3. Entfernen Sie so viel Wachstumsmedium wie möglich mit einer volumetrischen 25-ml-Pipette, um Schäden an den Wurzeln zu vermeiden.
4. Fügen Sie 50 ml Sammelmedium hinzu (z. B. 20 mM Ammoniumacetat; pH-Wert 5,7-5,9 mit HCl eingestellt), indem Sie an den Wänden des Glases entlangpipettieren, um eine Benetzung der Blätter zu vermeiden. Verschließen Sie die Gläser mit Deckeln und inkubieren Sie sie unter sterilen Bedingungen für den gewünschten Zeitpunkt der Exsudatsammlung. Für zeitkritische Experimente ist 2 h ein gutes Erfassungsfenster.
   VORSICHT: HCl ist korrosiv; Tragen Sie Handschuhe und Laborkittel. Für längere Wurzelausscheidungszeiten umwickeln Sie die Deckel wieder mit Klebeband und stellen die Gläser in die Wachstumskammer.
5. Nach 2 h die gewünschte Menge an Sammelmedien in Röhrchen entnehmen (z. B. 50 ml für Assays oder Analysen mit konzentrierten Exsudaten oder 2 ml für die direkte Anwendung). Lagern Sie die gesammelten Wurzelexsudate bis zur weiteren Verarbeitung oder Analyse bei -80 °C.
   1. Bei der Arbeit mit beimpften Gläsern zentrifugieren Sie die gesammelten Exsudate für 10 min bei 5.000 × g und 4 °C und verwenden Sie nur Überstände für die Analyse. Alternativ können Sie die Exsudate mit einem 0,22-μm- oder 0,45-μm-Filter filtern.
6. Wenn das Experiment Teil einer Zeitreihe ist, entfernen Sie alle verbleibenden Sammelmedien aus den Gläsern und fügen Sie 35 ml 0,5x MS-Medium hinzu. Setzen Sie den Deckel und das 2,5 cm lange Klebeband wieder auf, bevor Sie die Gläser wieder in die Wachstumskammer stellen.
7. Messen Sie das Wurzel- und Frischgewicht aller Pflanzen in einem Glas, um später die Wurzelexsudate nach Pflanzengewicht zu normalisieren.
   HINWEIS: Auf Wunsch können zusätzlich Pflanzengewebe entnommen werden.

6. Verarbeitung von Wurzelexsudaten für die Massenspektrometrie

1. Je nach Analysemethode werden die Wurzelexsudate gefriergetrocknet, um das Sammelmedium zu konzentrieren und zu entfernen (-80 °C bei 0,37 mbar, bis keine Flüssigkeit mehr vorhanden ist). Bis zur Analyse bei -80 °C lagern.
   ANMERKUNG: Die hier präsentierten Daten wurden mit einer TOF-MS-Analyse mit Durchflussinjektion auf einem Massen-Quadrupol-Time-of-Flight-Instrument generiert.
2. Vor der Injektion in das Analysegerät gefriergetrocknete Exsudate rekonstituieren oder unverarbeitete Wurzelexsudate entsprechend dem Wurzelfrischgewicht mit Sammelmedium verdünnen.
   HINWEIS: Das Sammelmedium wurde so gewählt, dass es mit dem Massenspektrometer kompatibel ist. Je nach Analysemethode können jedoch vor der Injektion Entsalzungsschritte erforderlich sein.

Ergebnisse

Das hier vorgestellte experimentelle System ermöglicht die Kontrolle von experimentellen und Umweltfaktoren, die das Wurzelexsudationsprofil verändern. Wir verglichen das Wachstum von A. thaliana unter verschiedenen Lichtbedingungen, Pflanzenalter und Pflanzendichten in zwei verschiedenen Laboren (Abbildung 3). Die Pflanzen sahen in allen Labors gesund aus (Abbildung 3A,B). Kurztagbedingungen (10 h Licht vs. 16 h Licht, Abbildung 3) führten zu einer höheren Wurzelmasse im Vergleich zu langen Tagesbedingungen (Abbildung 3C,D). In ähnlicher Weise war die Gesamtwurzelmasse aller Pflanzen, die unter Langtagbedingungen angebaut wurden, kleiner als unter Kurztagbedingungen (Abbildung 3C). Insgesamt war die Variabilität des Wachstums innerhalb und zwischen den Gläsern in den Laboren gering.

Das Glasgefäßsystem ist mit einer Vielzahl von Pflanzenarten und Entwicklungsstadien kompatibel. Der Endpunkt für die Analyse von Wurzelexsudat liegt in der Regel bei 21 Tagen, da sich unter unseren experimentellen Bedingungen viele Pflanzenarten in einem reifen vegetativen Stadium befinden, bevor sie in die Fortpflanzungsphase übergehen (Abbildung 4A-E). Pflanzen können leicht aus dem Versuchssystem entfernt werden, ohne dass das Wurzelsystem sichtbar beschädigt wird. Somit ist die Bestimmung von Gewebegewichten oder die Verwendung von Geweben für die nachgelagerte Analyse unkompliziert. Die höchsten Sprossgewichte wurden bei Weizen gefunden, gefolgt von Sorghum und Tomaten. Die höchsten Wurzelgewichte wurden für Sorghum gefunden, gefolgt von Weizen und M. truncatula. Das Wurzel-Spross-Verhältnis unterscheidet sich je nach Art. Insgesamt schwankten die Gewebegewichte zwischen 100 mg und 800 mg.

Ein zentraler Aspekt von experimentellen Systemen, die die Sammlung von Wurzelexsudat ermöglichen, ist die kontrollierte Inokulation mit Mikroben, um Pflanzen-Mikroben-Interaktionen in einer definierten Umgebung zu untersuchen. Das vorgestellte Versuchssystem kann auch bei wiederholter Manipulation steril gehalten werden (siehe "Kontroll"-Bedingung in Abbildung 5), und Bakterien können hinzugefügt und über längere Zeiträume aufrechterhalten werden. Wenn 33 Tage alte A. thaliana-Pflanzen mit einer Mischung kommensaler Bakterien bei OD₆₀₀ 0,004 inokuliert wurden, blieben die Bakterien 12 Tage lang bestehen, was der vollen Dauer des Experiments entsprach (Abbildung 5). Koloniebildende Einheiten vermehrten sich sogar um das 100-fache im Wachstumsmedium und besiedelten auch die Wurzeln (Abbildung 5C). Die Phänotypen der inokulierten Pflanzen waren nicht von denen der sterilen Pflanzen zu unterscheiden (Abbildung 5A,B).

Das vorgestellte experimentelle System ermöglicht die Sammlung von Exsudat unter vielen experimentellen Bedingungen. Hier präsentieren wir Exsudationsprofile von A. thaliana Col-0, die entweder in Ammoniumacetat oder in Wasser derselben Pflanzen nacheinander gesammelt wurden (Abbildung 6A). Die Exsudate wurden bis zur Analyse bei -80 °C gelagert, nach Wurzelgewicht normalisiert und mittels Massenspektrometrie analysiert. Proben von Gläsern, die Pflanzen enthielten, wurden gegen experimentelle Kontrollen (Gläser ohne Pflanzen) gefiltert. Von 2.163 Metaboliten zeigten 436 ein Signal über dem Hintergrund (20,16 %) und wurden für die Analyse zurückbehalten. Davon zeigten 416 oder 95% der Verbindungen eine deutliche Häufigkeit zwischen den Versuchsbedingungen. 26 Metaboliten konnten jedoch keiner Verbindung zugeordnet werden und sind daher nicht definiert. Die meisten Metaboliten (406 oder 98 %) waren in den im Wasser gesammelten Exsudaten häufiger vorhanden. Die aufeinanderfolgende Ansammlung von Exsudaten zuerst in Ammoniumacetat und später in Wasser kann das Exsudationsprofil beeinflussen, da sich die Stoffwechselsignale mit der Zeit verdünnen können. Das fast ausschließlich höhere Exsudationssignal in Wasser, das zu einem zweiten Zeitpunkt gesammelt wurde, stützt diese Hypothese jedoch nicht: Die Ansammlung von Exsudat in reinem Wasser erzeugt wahrscheinlich einen osmotischen Schock für Pflanzen, der die erhöhten Metabolitenhäufigkeiten im Vergleich zu einem Sammellösungsmittel verursacht, das äquimolar zur Wachstumslösung ist (20 mM Ammoniumacetat ist äquimolar zu 0,5x MS-Medium). Die Untersuchung der chemischen Klassen der identifizierten Verbindungen beider Wachstumsbedingungen zeigte, dass die Mehrheit der Verbindungen organische Säuren und Derivate (28,6 %) sind, gefolgt von organischen Sauerstoffverbindungen (18 %), organoheterozyklischen Verbindungen (14,2 %) und Lipiden (13,2 %). Nur ein kleiner Teil der Metaboliten gehört zu Phenylpropanoiden und Polyketiden (8,7 %) und Benzoloiden (6 %). Organische Stickstoffverbindungen, Nukleoside, schwefelorganische Verbindungen, Alkaloide, Lignane und verwandte Verbindungen machen zwischen 2 % und 0,5 % der klassifizierten Verbindungen aus (Abbildung 6B). Die hier dargestellte Verteilung der Metaboliten entspricht bereits veröffentlichten Daten unter Verwendung anderer Arten von Wurzelexsudaten-Sammelsystemen²⁴.

Abbildung 1: Aufbau des Glasgefäßes. (A) Gefäß mit Glasperlen. (B) Gefäß mit Glasperlen, bereit zum Autoklavieren. (C) Sämlinge in Gläsern (Draufsicht). (D) Sämlinge in einem Glas (Draufsicht) mit 1,25 cm Mikroporenband. (E) Sämlinge in Gläsern (Seitenansicht) mit 1,25 cm Mikroporenband. (F) Sämlinge in Gläsern (Seitenansicht) mit 1,25 cm Mikroporenband und Deckel. (G) Komplette Glaseinrichtung mit Sämlingen in Gläsern (Seitenansicht) mit 1,25 cm Mikroporenband, Deckel und 2,5 cm Mikroporenband. (H) Schließen Sie die Glaseinrichtung ab (Draufsicht). (I) Pflanzen, die 21 Tage alt und bereit für die Ernte sind (Draufsicht). Glasgröße 147 mm Höhe x 100 mm Durchmesser. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Oberflächensterilisierte Sämlinge auf 0,5x Murashige- und Skoog-Medium-Agarplatten in einer Wachstumskammer. (A) Arabidopsis thaliana (6 Tage alt), (B) Brachypodium distachyon (6 Tage alt), (C) Medicago truncatula (6 Tage alt), (D) A. thaliana (18 Tage alt). Agarplatte Größe 120 mm x 120 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Arabidopsis thaliana Col-0-Pflanzen, die in Gläsern unter kurz- und langtägigen Lichtbedingungen angebaut werden. (A) Glas mit drei 33 Tage alten Pflanzen, die unter Kurztagbedingungen angebaut wurden (10 h hell/14 h dunkel, 220 μmol ^{m-2 s-1} Lichtintensität, 21 °C Tag/18 °C Nacht) und (B) Glas mit fünf 21 Tage alten Pflanzen, die unter Langzeitbedingungen (16 h hell/8 h dunkel, 150-160 μmol ^{m-2 s-1} Lichtintensität, 22 °C Tag/18 °C Nacht). Wurzelgewicht von (C) allen Pflanzen eines Glases und (D) von einzelnen Pflanzen. ** stellen Signifikanzwerte des t-Tests dar (p < 0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Fünf phylogenetisch unterschiedliche Spezies an Tag 21 im sterilen Glasgefäßsystem. (A) Modell-Monokotyledon Brachypodium distachyon, (B) Modell-Hülsenfrucht Medicago truncatula, (C) Dikotyle Solanum lycopersicum (Tomate), (D) Dikotyle Sorghum bicolor, (E) Monokotyle Triticum aestivum (Weizen). (F) Frischgewicht der Wurzeln und Triebe der in Gläsern gezogenen Arten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Arabidopsis thaliana Col-0 (33 Tage alt) gezüchtet unter Kurztagbedingungen. (A) In einer sterilen Einrichtung oder (B) 12 Tage lang mit einem Konsortium kommensaler Bakterien inokuliert. (C) Koloniebildende Einheiten für sterile (Kontrolle) und inokulierte Gläser des Wachstumssubstrats (links) und der Wurzel (rechts). N = 4 Gläser für die sterile Kontrollbedingung und n = 8 Gläser für die geimpfte Bedingung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Unterschiedliche Wurzelexsudatprofile für die 21 Tage alte A. thaliana Col-0. Die Exsudate wurden 2 h lang in sterilem 20 mM Ammoniumacetat (pH 5,7) gesammelt, gefolgt von einer 2-stündigen Sammlung in steril gefiltertem deionisiertem Wasser. Die Metaboliten wurden mittels Massenspektrometrie mittels Direktinjektion nachgewiesen. (A) Hauptkomponentenanalyse von 436 Metaboliten, die über dem Hintergrundniveau nachgewiesen wurden (Vergleich von Gläsern mit Pflanzen mit Gläsern ohne Pflanzen). PC: Hauptkomponente mit Angabe der Varianz. Blau: mit Wasser gesammelte Exsudate, gelb: mit Ammoniumacetat gesammelte Exsudate. (B) Tortendiagramm von 416 Metaboliten, die sich signifikant zwischen den Versuchsbedingungen unterscheiden (Tukey-Test), gefärbt nach der Superklasse (https://cfb.fiehnlab.ucdavis.edu/). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Spezies		Vorbereitung des Saatguts	Zeit in 70% Ethanol (min)	Konzentration von Natriumhypochlorit (NaClO) (v/v % Bleichmittel)		Zeit im Bleichmittel (min)
Arabidopsis thaliana			15	Nichts; 100% Ethanol		15
Brachypodium distachyon*		Entspelz	0.5	6		5
Medicago truncatula*a			30	6		30
Solanum lycopersicum*			0.5	6		5
Sorghum bicolor*		Entspelz	0.5	6		30
Triticum aestivum*		Entspelz	0.5	12		20

Tabelle 1: Methoden zur Sterilisation von Oberflächensaatgut für mehrere Arten. *4-5x mit gefiltertem deionisiertem Wasser zwischen Ethanol und Bleichmittel und am Ende gewaschen; ^EineInkubation für 3-6 Stunden nach dem Bleichen, die alle 30 Minuten durch gefiltertes deionisiertes Wasser ersetzt wird.

Spezies	Tag zu Gläsern	Anzahl der Pflanzen
Brachypodium distachyon	4 bis 5	3
Sorghum zweifarbig	4 bis 5	3
Triticum aestivum	4 bis 5	2
Medicago truncatula	5 bis 6	3
Solanum lycopersicum	7 bis 8	3
Arabidopsis thaliana	17	3 bis 5

Tabelle 2: Alter der Sämlinge in Tagen für den Transfer in Gläser und Anzahl der Pflanzen pro Glas für verschiedene Pflanzenarten.

Diskussion

Das hier vorgestellte experimentelle System basiert auf Glasgefäßen und Glasperlen und bietet somit ein einfaches, wartungsarmes und vielseitiges semihydroponisches System, um die Wurzelexsudation in verschiedenen Kontexten zu untersuchen. Es wurde in Studien verwendet, in denen die Exsudationsprofile verschiedener Pflanzenarten²⁵, die Reaktionen der Exsudation auf unterschiedliche Wachstumsbedingungen²⁵ sowie der Einfluss der physikalisch-chemischen Eigenschaften des Bodens auf die Exsudation²² untersucht wurden. Das System eignet sich für alle Pflanzenarten, die hier für längere Wachstumsperioden von Wochen bis Monaten getestet werden. Die Aufrechterhaltung steriler Bedingungen ist unkompliziert, ebenso wie die Inokulation mit Bakterien, die über die analysierte 2-wöchige Wachstumsphase bestehen bleiben. So ermöglicht das experimentelle System nicht nur eine kontrollierte Sammlung von Wurzelexsudaten unter sterilen Bedingungen, sondern kann auch zur Untersuchung von Pflanzen-Mikroben-Interaktionen verwendet werden. Darüber hinaus können die Pflanzenwachstumsmedien variiert werden, um die Stoffwechselreaktionen auf verschiedene Nährstoffgehalte zu untersuchen, und die Wachstumsperioden können durch Anpassung der Lichtverhältnisse oder Verwendung von Gläsern unterschiedlicher Größe angepasst werden.

Die Untersuchung von Wurzelexsudaten unter hydroponischen oder semihydroponischen Bedingungen ist in diesem Bereich nach wie vor Standard, vor allem aufgrund der verbesserten Auflösung von Metaboliten mit niedriger Konzentration¹¹. Viele hydroponische Ansätze beruhen auf Petrischalen, Multi-Well-Platten oder anderen kleinen Behältern, die Sterilität und einen hohen Durchsatz ermöglichen, aber das Experimentieren auf kleine Pflanzen oder Sämlinge beschränken, die in Umgebungen mit hoher Luftfeuchtigkeit angebaut werden 17,18,26,27. In dem vorgestellten Glasgefäß-Setup wird durch die vergleichsweise großen Gläser ausreichend Kopfraum zur Verfügung gestellt, was verlängerte Wachstumsphasen ermöglicht. Mikroporen-Klebestreifen sichern den Luftaustausch und erhalten gleichzeitig die Sterilität. So können auch hohe Monokotyledonen wie Gerste und Mais über mehrere Wochen im Glasgefäß gezüchtet werden. Kleine Pflanzen wie A. thaliana und Klee können 4-5 Wochen nach der Keimung untersucht werden, einschließlich der vegetativen und reproduktiven Phasen.

Alternative hydroponische Setups sind auch für größere Pflanzen erhältlich, aber diese erfordern oft maßgeschneiderte Boxen und Einlässe aus Mesh, Schaumstoffplatten und Veredelungskörbe zur Pflanzenunterstützung 15,28,29,30. Darüber hinaus sind diese Geräte in der Regel nicht steril eingerichtet oder erfordern anspruchsvolle Einrichtungs- und Wartungsverfahren, um sie frei von mikrobiellen und/oder chemischen Verunreinigungen zu halten. Der Aufbau und die Aufrechterhaltung der Sterilität in dem vorgestellten Versuchssystem sind unkompliziert. Darüber hinaus reduziert die Verwendung von Glas für Gläser und Perlen das Vorhandensein von Verunreinigungen, die aus Kunststoffen austreten, und spart Ressourcen, da es leicht gewaschen und wiederverwendet werden kann.

Glasperlen wurden bereits früher verwendet, um Bodenpartikel zu imitieren. Sie induzieren die natürliche Wurzelentwicklung in Wurzelexsudationsprobenahmevorrichtungen wie Exsudationsfallen³¹ oder anderen semihydroponischen Systemen¹⁹. Der Glas-Tiegel-Aufbau macht sich diese Entwicklung zunutze und führt die Kügelchen als Besiedlungsfläche für Mikroben ein. Im Boden entwickelt sich das Mikrobiom um die Pflanzenwurzeln herum in einer halbfesten Umgebung mit kompakten Partikeln und Räumen, die mit Luft oder Wasser gefüllt sind. Auch wenn der Aufbau des Glasgefäßes keine aktive Belüftung des Wachstumsmediums beinhaltet, aufgrund derer die untere flüssige Phase wahrscheinlich keinen optimalen Sauerstoffgehalt enthält, erzeugt die Kombination eines größeren Kügelchenvolumens mit einem kleineren Wachstumsmediumvolumen eine feuchte, aber belüftete obere Phase, in der Mikroben unter oxischen Bedingungen wachsen können. Andere haben vorgeschlagen, die Wachstumsbehälter^26,28 zu schütteln oder Schläuche zu verwenden, die mit Luftpumpen ^19,29 gekoppelt sind, um die Luftzufuhr in hydroponischen Wachstumssystemen aufrechtzuerhalten. Diese Systeme sind jedoch entweder so eingerichtet, dass sie nicht steril sind, oder erfordern spezielles Material und ständige Überwachung, um die Sterilität aufrechtzuerhalten. Darüber hinaus ist beim Schütteln sehr darauf zu achten, dass die Triebe nicht in Wachstumslösungen eintauchen und das Wurzelsystem beschädigt werden. Nichtsdestotrotz könnte der vorgestellte Versuchsaufbau auf Wunsch mit zusätzlichem Material zur Belüftung angepasst werden.

Ein entscheidender Aspekt, der bei allen Studien zur Wechselwirkung zwischen Pflanzen und Mikroben, die den Stoffwechsel untersuchen, zu berücksichtigen ist, ist, dass Mikroben pflanzliche Verbindungen abbauen und selbst Metaboliten produzieren. Ohne einen speziellen sterilen Versuchsaufbau ist es nicht möglich, zwischen pflanzlichen und mikrobenabgeleiteten Metaboliten zu unterscheiden. Um die mikrobielle Aktivität zu hemmen und pflanzliche Verbindungen anzureichern, schlugen Oburger et al. vor, die Wurzelexsudat-Probenahmelösung chemisch zu sterilisieren, um den bakteriellen Abbau zu hemmen³². Die Wirkung chemischer Inhibitoren konnte in dem vorgestellten experimentellen System untersucht werden, indem Exsudationsprofile von sterilen und unsterilen Pflanzen, die mit oder ohne den Inhibitor behandelt wurden, verglichen wurden.

Eine wesentliche Einschränkung des vorgestellten Glasgefäß-Setups besteht darin, dass die Wachstumsbedingungen im Vergleich zu Erde sehr künstlich bleiben. Exsudate von im Boden angebauten Pflanzen werden häufig entweder aus Perkolationssystemen¹³ gesammelt, in denen Lösungsmitteldurchläufe an der Basis von Wachstumsbehältern gesammelt werden, oder aus Boden-Hydroponik-Hybridsystemen, bei denen die Pflanzen zunächst in Erde angebaut und dann in hydroponische Bedingungen überführt werden^16,33. Im Gegensatz zum Glasgefäß-Setup sind diese Verfahren in der Regel destruktiv und lassen keine mehrfachen Entnahmen im Laufe der Zeit in wechselnden Wachstumsumgebungen zu. Während in versickernden Systemen der Bodenhintergrund zusammen mit den Exsudaten beprobt wird, wird in Boden-Hydroponik-Hybridsystemen das Problem des hohen Bodenstoffwechselhintergrunds durch die Übertragung auf hydroponische Bedingungen für die Exsudatsammlung umgangen. Obwohl Erholungszeiten implementiert wurden, um den Austritt von Metaboliten über verwundete Wurzeln^{zu reduzieren 11}, ist der Pflanzentransfer sehr störend und die Wunden bleiben wahrscheinlich bestehen, und der Stoffwechsel der Pflanzen kann sich als Reaktion auf die Übertragung auf hydroponische Bedingungen verändern. Darüber hinaus wird in vielen Fällen ein osmotischer Schock induziert, wenn Pflanzen anstelle einer geeigneten Wachstumslösung in Wasser überführt^{werden 16,33}. In dem vorgestellten Protokoll wird die Wachstumslösung durch eine äquimolare Lösung ersetzt, um das osmotische Gleichgewicht aufrechtzuerhalten, so dass die Exsudation innerhalb eines kurzen, definierten Zeitfensters eingefangen werden kann. Die Lösung zur Veränderung des Wachstums ist in vielen veröffentlichten Studien gängige Praxis und kann in hydroponischen Setups leicht erreicht werden, ohne dass die Wurzeln verletzt werden 12,16,26,34. Aufgrund seiner Vielseitigkeit kann das vorgestellte Versuchssystem leicht an die Nachahmung natürlicherer Bedingungen angepasst werden, z. B. durch die Verwendung von sterilem oder unsterilem Bodenextrakt als Wachstumslösung mit oder ohne Vorhandensein von festen Bodenpartikeln. Die allmähliche Umstellung auf natürliche Bedingungen ermöglicht es, die Auswirkungen der verschiedenen physikalisch-chemischen Bodeneigenschaften und des mikrobiellen Vorhandenseins auf den Stoffwechsel und die Physiologie der Pflanzen zu untersuchen. Bevor die wissenschaftliche Gemeinschaft ein gutes Verständnis der Exsudation in verschiedenen Umgebungen hat, ist es wünschenswert, bodenbasierte und hydroponische Systeme parallel einzusetzen, da beide Setups ihre Vor- und Nachteile haben¹³.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich der vorgestellte semihydroponische, glasbasierte Versuchsaufbau durch seine Einfachheit in Kombination mit einer hohen Vielseitigkeit der Anwendungen auszeichnet. Es stellt eine zugängliche, kostengünstige Möglichkeit dar, Exsudation unter sterilen Bedingungen oder in Kombination mit Mikroben und Pflanzen-Mikroben-Interaktionen zu sammeln und zu untersuchen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar powder for bacteriology	VWR	20767.298
Aluminum foil	FORA GmbH
Ammonium acetate	Sigma-Aldrich	32301-1KG	ACS reagent, Eur >- 98%
Autoclave VX-150	Systec	1150
Balance	Sartorius	QUINTIX64-1S
Centrifuge	Hermle Labortechnik GmbH	305.00 V05
Cuvettes	Greiner Bio-One	613101
Difco LB Broth, Lennox	BD	240210
Ethanol	Reuss-Chemie AG	RC-A15-A-005L
Filtered deionized water	Merck Millipore	Milli-Q IQ7000
Glass beads	Carl Roth	HH56.1	5 mm
Hydrochloric acid	Merk	1.00317.1000
Inoculation loop	Karl Hammacher GmbH	HWO_070-21
Jars	Weck	105741	850 mL
Lyophilizer	Christ	Alpha 2-4 LSCplus
Magnesium chloride hexahydrate	Carl Roth	2189.1
Matrix Orbital thermoshaker	IKA	10006248
Microcentrifuge tube	Sarstedt AG & Co. KG	72.695.500	SafeSeal reaction tube, 2 mL, PP
Micropore tape	3M	1530-0	1.25 cm x 9.1 m
Micropore tape	3M	1530-1	2.5 cm x 9.1 m
Murashige & Skoog Medium (MS)	Duchefa Biochemie	M0221.0050
Growth chamber	Percival	SE41-TLCU4	16 hour light/8 dark. 22 °C day/18 night
Phyto agar	Duchefa Biochemie	P1003.1000
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	8.14353.0100
SmartSpec Plus Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2525
Sodium hypochlorite solution, 12% Cl	Carl Roth	9062.4
Square petri dish	Greiner Bio-One	688102	120x120x17 mm, with vents
Stericup Quick release	Millipore	S2GPU05RE	0.22 µm PES, 500 mL
Sterile bench	FASTER S.r.l.	FlowFast H 18