检测小鼠视网膜血管系统免受糖尿病相关死亡保护的检测方法

摘要

开发了一种保护测定法来监测视网膜血管系统对糖尿病/糖尿病视网膜病变相关损伤（如氧化应激和细胞因子）死亡的恢复能力。

摘要

糖尿病视网膜病变 （DR） 是一种复杂且进行性的眼部疾病，其发病机制有两个不同的阶段。第一阶段涉及失去对糖尿病引起的视网膜损伤的保护，而第二阶段则集中在这种损伤的积累上。传统检测主要侧重于评估毛细血管变性，毛细血管变性表明损伤的严重程度，主要针对 DR 的第二阶段。然而，它们只能间接地提供关于视网膜血管系统的保护机制是否受到损害的见解。为了解决这一局限性，开发了一种新的方法来直接评估视网膜的保护机制 - 特别是它对糖尿病引起的损伤（如氧化应激和细胞因子）的恢复力。这种保护性检测虽然最初是为糖尿病视网膜病变设计的，但在生理和病理环境中都有更广泛的应用潜力。总之，了解糖尿病视网膜病变的发病机制涉及识别保护丧失和损伤积累的双重阶段，这种创新的保护测定法为研究提供了有价值的工具，并可能扩展到其他医疗条件。

引言

糖尿病视网膜病变 （DR） 是糖尿病 （DM） 的微血管并发症之一，也是发达国家工作年龄个体失明的主要原因¹。糖尿病视网膜病变的主要危险因素是高血糖的持续时间和程度^2,3,4。虽然 DM 会导致视网膜的血管和神经成分功能障碍⁵，但 DR 的诊断基于视网膜脉管系统的形态特征⁶。

高血糖诱导的氧化应激是 DR 发病机制的驱动因素^{之一 7}.氧化应激的增加会导致广泛的损伤，从而损害线粒体的功能，从而进一步增加活性氧的水平。这些事件伴随着视网膜血管渗漏、炎性细胞因子水平升高以及视网膜内神经和血管细胞类型的死亡。血管细胞的丧失，以及视网膜广泛毛细血管网络的功能，导致缺氧，这是各种反应的有力刺激⁵.这些反应包括驱动通透性和血管生成的血管内皮生长因子 （VEGF） 表达增加、DR 晚期、威胁视力的阶段的主要特征 - 糖尿病性黄斑水肿和增殖性糖尿病视网膜病变⁶。

DR 的某些特征表明，生物体（患者和实验动物）具有抵抗这种适应症的内在能力。患者在发展为危及视力的 DR^{8、9、10、11、12、13} 之前会经历数十年的 DM。虽然 DM 的啮齿动物模型不会发展为 DR¹⁴ 的高级、威胁视力的阶段，但表现出的初始/轻度 DR 形式仅在 DM^15,16 数周或数月后才会出现。此外，在患者和实验动物中，DR 都是进行性的，并且视网膜功能障碍/损伤随着 DM 持续时间的延长而增加。最后，一些糖尿病患者从未发生过 DR。在某些情况下，这是因为这些人经历糖尿病的时间不够长，无法发展 DR。在其他情况下，这是因为它们对 DR 表现出非凡的抵抗力;与 Medalist 研究的参与者一样，他们在 DM¹⁷ 50 年或更长时间后没有发生 DR。尽管有如此令人信服的支持，支持DR保护的存在及其巨大的转化相关性，但尚未积极研究保护背后的机制。

本文所述的保护测定旨在促进研究为什么 DR 在糖尿病小鼠中从 DM 发作延迟。该测定法应用于 DM 和非 DM 小鼠的关键步骤包括 （1） 对眼睛（离体 或 体内）提供次最大死亡诱导损伤，（2） 分离视网膜脉管系统，（3） 用 TUNEL 和 DAPI 染色脉管系统，（4） 拍摄所得图像并量化 TUNEL/DAPI 双阳性物种的百分比。

研究方案

所有动物研究均已获得伊利诺伊大学芝加哥分校动物护理和机构生物安全办公室的批准。将7周龄的雄性C57 / BL6 / J小鼠饲养在无病原体环境中的群笼中，以12小时光/暗循环，并提供免费食物和水。通过CO₂ 窒息对小鼠实施安乐死，并立即将眼睛去核并处理¹⁸。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。研究所需的基本工具如 图1所示。

1. 致死侮辱的传递

1. 用TBH（ex vivo）进行氧化应激。
   1. 按照机构批准的方案对小鼠实施安乐死并摘除它们的眼睛¹⁸ （图2A）。
   2. 将眼球直接放入含有DMEM + 1%BSA的24孔板的单个孔中，有或没有5mM叔丁基过氧化氢（TBH）（见 材料表）;在37°C孵育1小时。 用DNase（50U / 100μL）处理阳性对照样品10分钟以片段化DNA。
      注意：选择TBH（诱导氧化应激的药物）的剂量以在分离的视网膜血管内诱导易于检测的次最大水平的细胞死亡¹⁸。
   3. 将眼睛固定在10%缓冲福尔马林中过夜（至少16小时）。
2. 使用细胞因子混合物诱导炎症（体内）。
   1. 用腹膜内注射100mg / kg氯胺酮和5mg / kg甲苯噻嗪麻醉小鼠。
   2. 使用定制的 33 G 针头（参见 材料表）将 1 μL/眼的细胞因子混合物注射到玻璃体中;注射部位距离角膜缘2-3毫米（图2B）。
      注意：细胞因子混合物含有 1 μg/mL TNF-α、1 μg/mL IL-1β 和 1500 U/μL IFN-γ¹⁸ 的 1：1：1 比例（参见 材料表）。
   3. 注射后24小时，对小鼠实施安乐死（遵循机构批准的方案），摘除眼睛并用10%缓冲福尔马林固定过夜。
      注意：实验可以在固定后暂停最多 1 周，然后稍后重新开始。

2.视网膜隔离

1. 切开眼球。
   1. 使用直镊子轻轻抓住视神经（图2C）。用另一只手握住微型刀，在角膜缘后方切开2-3毫米的切口。
   2. 从微型刀切换到微型剪刀，平行于角膜缘进行切割，同时与视神经一起旋转眼球，直到眼球被切成两半。
   3. 丢弃眼睛的前半部分，包括晶状体（图2C）。
2. 切除巩膜。
   1. 使用直镊子轻轻地将巩膜从视网膜上抬起 1-3 毫米。
   2. 使用微型剪刀在巩膜部分到视神经的部分进行两个径向切口。避免切割下面的视网膜。
   3. 用一把弯曲的镊子抓住巩膜皮瓣并将其从视网膜上撕下。RPE 层将随着巩膜脱落。
3. 清洗视网膜。
   1. 使用微型刮刀将分离的视网膜转移到装满双蒸水的 24 孔培养皿内的孔中。
   2. 在室温下以中中速轻轻摇晃盘子。每 30 分钟至 1 小时换水一次，至少 4-5 次，然后过夜。

3.视网膜脉管系统隔离

1. 消化：用 800 μL YL 胰蛋白酶溶液（0.1 M Tris 缓冲液 （pH 7.8） 中的 3% 胰蛋白酶）代替双蒸水。在37°C下孵育，轻轻至无摇晃4小时15分钟¹⁹ （图2D）。
   注意： 避免快速摇晃，因为这会损坏脉管系统。
2. 转移：用YL胰蛋白酶溶液浸入玻璃转移移液管的宽端，将视网膜转移到含有无绒双蒸水的35毫米培养皿中。
3. 去除外核层（光感受器）（图2E）。
   1. 将视网膜半球体朝下翻转。使用直的单毛刷将视网膜轻轻按压到盘子底部。
   2. 使用环刷轻轻刷掉视网膜的感光器。笔触沿视神经向视网膜外围的方向应用。感光器可以大片分离，因为它们没有通过血管固定在视网膜的其余部分。
   3. 使用 200 μL 移液器收集并弃去神经组织片。
4. 取出玻璃体。
   1. 翻转视网膜半球体，使其朝上。使用一对弯曲的镊子（A）在解剖显微镜下尽可能多地抓住玻璃体。
      注意：玻璃体看起来像附着在视神经或视网膜上的透明组织。
   2. 使用另一个弯曲的镊子 （B） 抓住玻璃体连接视神经的末端。通过将镊子 A 从镊子 B 上拉开来取出玻璃体。
   3. 丢弃玻璃体。检查玻璃体的残留物并重复此步骤以去除所有玻璃体，因为残留物会阻碍后续步骤。
5. 去除剩余的神经和神经胶质组织（图2F）。
   1. 翻转视网膜半球体，使其再次朝下。再一次，用直刷将视网膜轻轻按压到盘子的底部（不要使用发尖）。
   2. 使用环刷轻轻刷过从视神经头向外周的脉管系统，以去除剩余的神经组织²⁰。
   3. 用直刷缓慢旋转视网膜，然后使用环刷去除视网膜血管系统上的所有小块神经组织，直到血管网络得到充分清洁（图2G，H）。

4. 将分离的视网膜脉管系统安装在显微镜载玻片上

1. 放置显微镜载玻片。
   1. 将干净的安装盒（见 材料表）放在解剖显微镜下。用双蒸水填充盒式磁带。
   2. 在解剖显微镜下使用黑色背景来帮助产生对比度，以查看照明的透明脉管系统。
   3. 使用镊子将干净的、贴有标签的显微镜载玻片放入安装盒的底部。
2. 转移视网膜脉管系统。
   1. 用YL胰蛋白酶溶液浸入玻璃移液管的宽端。
   2. 转移清洁的视网膜脉管系统，并轻轻地将脉管系统移入安装盒内和显微镜载玻片上方的双蒸水中。
3. 安装视网膜脉管系统。
   注意：当脉管系统漂浮在显微镜载玻片上方时，分离的脉管系统将获得其正常的碗状。
   1. 使用环形刷将视网膜半球朝上翻转，轻轻地将脉管系统向下推到载玻片上，然后用头发将打开的脉管系统固定到载玻片的中心。脉管系统在接触载玻片时应粘附在载玻片上。
   2. 通过将碗状视网膜血管从视神经刷到外周来平安装脉管系统。
   3. 向各个方向重复刷牙，直到脉管系统完全粘在载玻片上。
4. 风干视网膜脉管系统。
   1. 一旦整个视网膜脉管系统附着在载玻片上，通过轻轻抬起一个边缘或缓慢排出盒一角的水以尽量减少电流，然后将其拉出，将载玻片从水中取出（图2I）。
      注意：一旦风干，脉管系统将变得容易可见（图2J）。
   2. 用记号笔在载玻片背面标记视网膜脉管系统的周长。
   3. 继续对样品进行染色，不要停顿。

5. TUNEL染色死亡检测

注：有关此过程的详细信息，请参阅 Zheng 等人 ²¹。缺血 +/- ox 应激诱导的细胞凋亡小体在孤立的视网膜血管中的代表性图像如 图 3 所示。

1. 用PBS对分离的脉管系统进行补水处理。在PBS中冲洗3次，然后用PBS中的1%Triton X-100在冰上孵育2分钟，以透化分离的脉管系统。
2. 用 PBS 冲洗载玻片两次以去除残留的 Triton X-100。擦干样品周围的区域。
3. 在样品中加入50μL TUNEL反应混合物（参见 材料表）。将载玻片在37°C的加湿气氛中在黑暗中孵育60分钟。
4. 用PBS冲洗载玻片3次以除去TUNEL反应混合物。擦干样品周围的区域。
5. 加入一滴DAPI封固剂，用DAPI染色细胞核，并用盖玻片封贴样品。在4°C的避光下储存。
   注意：在捕获图像之前，该协议最多可以暂停 1 周。
6. 用共聚焦荧光显微镜拍摄产生的脉管系统（参见 材料表）。在视神经周围的远周边捕获六到八个随机选择的野（图4）。
   注：细胞因子诱导的细胞凋亡小体在分离的视网膜血管中的代表性图像如 图5所示。
7. 分析结果。
   1. 对于经过 TBH 处理的 离体样品，请执行以下步骤。
      1. 使用图像 J 计算每个字段中凋亡小体（TUNEL/DAPI 双阳性物种）的数量（参见 材料表）。计算单个样品所有场中凋亡小体的平均值。
      2. 计算随机选择的一对非DM和DM样品之间凋亡小体数量的倍数变化。
      3. 使用双尾学生 t 检验¹⁸ 确定是否存在统计学显着差异。
         注意：在同一场合对对照样品和实验样品（非DM和DM）进行染色，因为即使以相同的方式进行，TUNEL染色的程度也会有所不同。由于有经验的用户每天最多可以清洁和安装 10 个视网膜，因此在开始此协议之前，计划处理相同数量的对照和实验视网膜。
   2. 对于 体内细胞因子混合物处理的样品，请执行以下步骤。
      1. 手动计数整个视网膜脉管系统中的凋亡小体（TUNEL/DAPI 双阳性物种）的数量。
      2. 计算随机选择的一对非DM和DM样品之间凋亡小体数量的倍数变化。
      3. 使用双尾学生 t 检验确定是否存在统计学上的显著差异。

讨论

在这项研究中，建立了一种测定法来检测由 DM/DR 相关损伤（如缺血/氧化应激和细胞因子）诱导的视网膜血管系统对死亡的抵抗/脆弱性。本手稿提供了该测定的详细描述，该测定是对几种已发表的方案 19,20,21 的修改。

该协议包括几个关键阶段。首先，必须仔细解剖视网膜，确保血管网络的保存并防止大量撕裂。这可以通过在角膜缘后方 2-3 毫米处切开一个切口来实现，因为视网膜紧紧地粘附在锯齿上，并且将其分离具有挑战性。其次，在整个过程中将胰蛋白酶浸入 YL 胰蛋白酶溶液中，将所有与血管接触的器械（例如，单毛刷、转移移液管和镊子）涂上胰蛋白酶。这可以防止脉管系统粘附在本协议中使用的器械上。第三，由于微血管系统在正常光线下几乎看不见，因此在碎片吸入和转移到显微镜载玻片时需要提高警惕，以防止意外丢失。

视网膜各层的适当程度的酶消化至关重要;消化不足会阻止神经元组织与血管网络分离，而过度消化会溶解血管丛。据报道，从 1 小时¹⁹ 到过夜 ²³ 的各种消化时间。根据观察，与2小时，3小时和4小时的持续时间相比，4小时和15分钟的消化时间产生最有利的结果。将消化时间延长到这一点之后不太可能增强该过程，反而可能会损害脉管系统的完整性。

如果消化的视网膜粘附在单发刷上，请多次将头发浸入 YL 胰蛋白酶溶液中。这样可以减少刷子的粘性区域。如果发刷仍然粘附在血管组织上，则检查其是否有残留的玻璃体碎片，并用镊子将其取出。

完全切除玻璃体的最佳时机是在消除光感受器之后，但在切除剩余的神经和神经胶质组织之前。视网膜保持刚性，直到光感受器被移除。在这个阶段提取玻璃体可能会撕裂视网膜/脉管系统。残留的神经和神经胶质组织的脆弱层在保持血管结构的弯曲形式方面起着关键作用。当玻璃体与视神经分离时，它们可防止视网膜在其中心撕裂。

如果孤立的脉管系统根本没有粘附在显微镜载玻片上，则表明预计会发生粘连的载玻片部分很脏。尝试在载玻片表面移动容器以找到粘性点，切换到不同的载玻片或仔细清洁载玻片并重试。如果容器在展开成碗状之前粘在载玻片上，请从载玻片上提起脉管系统，使其再次自由漂浮在水中。使用反复浸入YL胰蛋白酶溶液中的镊子执行此步骤。

已经报道了几种用于分离脉管系统的替代技术，这些技术不适合本文所述的保护测定。例如，渗透裂解已被用于从未固定的视网膜样本中分离脉管系统，从而促进了组织的生化研究^24,25。然而，该过程可能无法保留脉管系统的解剖结构以及本文采用的方法。类似地，虽然分离大段微血管系统的组织打印方法可以分析脉管系统的电渗结构²⁶，但整个血管床通常不会恢复。

开发该测定法是因为现有的毛细血管变性监测方法无法解决保护问题。毛细血管变性发生在长期糖尿病后，提示是否发生了 DR。除了诊断 DR 外，该结果还有助于评估药物/疗法是否能预防 DR。然而，现有的毛细血管变性检测并不能说明该药剂的潜在作用机制。这种药物可以防止驱动DR的病理事件，例如氧化应激或细胞因子增加。或者，该试剂可以通过增强对氧化应激和细胞因子的恢复力和/或促进损伤的修复来加强保护。这种新的保护测定可用于确定给定疗法的有益效果是否涉及加强防止 DM 相关死亡的内源性系统。

这种保护测定的一个缺点是它不能区分视网膜血管内的两种细胞类型：内皮细胞 （EC） 和周细胞 （PC）。虽然它们在PASH染色切片中的细胞核外观是细胞类型特异性的（图6），但并非每个细胞核都显示出诊断特征。大约 30% 的细胞核不能明确定义为 EC 或 PC，至少部分原因是从 PASH 染色样品中获得的二维图像不能完全解析血管丛的三维结构。这一障碍可以通过额外的分析来克服，例如使用细胞类型特异性标记物进行免疫荧光染色。这种区分两种细胞类型的图像可以与TUNEL共同染色，以确定每种血管细胞类型的耐药性/脆弱性。

这种以血管为重点的测定不提供有关神经视网膜的任何信息。可以开发其他检测方法来提供此类信息。例如，可以生成整个视网膜的单个细胞悬浮液，而不是分离视网膜脉管系统，然后分析（通过荧光激活的细胞分选）抵抗力/脆弱性。包括细胞类型特异性标记物（神经和血管）以及细胞死亡指标将提供更完整的视网膜细胞类型，这些细胞类型具有保护免受DM / DR介导的死亡的能力。

总之，本文中描述的保护测定提供了一种强有力的方法来研究导致小鼠 DM 发作和 DR 表现之间延迟的机制。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% neutral buffered formalin	Fischer Scientific	SF100-4	Fixation
24-well plates	Falcon	353047
33 G needle	Hamilton	customized
Ammonium hydroxide	Sigma	221228-1L-PCA
C57/BL6/J mice	The Jackson Laboratory	Jax #000664
Cytokine cocktail			consisted of a 1:1:1 ratio of 1 µg/mL TNF-α, 1 µg/mL IL-1 β and and 1500 U/µLIFN- γ
Dissecting microscope			Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate.
Dumont #3 forceps	Fine Science Tools (FST)	11231-30	Straight tips
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools (FST)	11253-25	Micro-blunted tips
Easy-Grip Tissue Culture Dishes	Falcon	353001	35 x 10 mm
Glass transfer pipet	Fischer Scientific	1367820A	snap off the thin end of a Pasteur pipet and fit the “broken” end with a rubber bulb.
Harris modified hematoxylin	Sigma	HHS32
Image J	NIH, Bethesda		https://imagej.nih.gov/ij/
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein	Milipore	11684795910	TUNEL reaction mixture
Micro cover glasses	VWR	48366-227	22 mm x 22 mm
Microknife	Sharpoint	72-1551
Micro-spatula	Fine Science Tools	10091-12
Mounting cassette			Any transparent cassette that is slightly bigger than the microscope slide
Periodic acid	Sigma	3951
Periodic acid solution			35 mM periodic acid with 12 mM sodium acetate  in H2O
Permount mounting medium	Fischer Scientific	SP15- 100
Prism 9	GraphPad
Prolog Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P36935
Recombinant human IFN- γ	Peprotec	300-02
Recombinant human IL-1 β	Peprotec	200-01B
Recombinant human TNF-α	Peprotec	300-01A
Schiff reagent base	Sigma	3952016
Shaker Incubator (belly button shaker)	IBI Scientific	BBUAAUV1S
Sodium acetate	Sigma	71196
Steritop sterile vacuum bottle	Millipore	SCGPS05RE	Create filtered water
Superfrost Plus treated microscope slides	Fischer Scientific	12-550-15	use slides from unopened box
Tert-butyl hydroperoxide (TBH)	Sigma	75-91-2
TRIZMA base	Fischer Scientific	11-101-5522	make 100 mM Tris, adjust pH to 7.8 using HCl)
Trypsin 1:250	Amresco	0458-50G
Two “brushes”			made from single black hair  taped to the end of plastic transfer pipet.  One brush with a free end. The other brush with a loop
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools (FST)	15000-00
Xylene	Sigma	65351-M
YL trypsin solution			3% trypsin in 0.1 M Tris (pH 7.8)
Zeiss LSM 710 fluorescence microscope	Zeiss Microscopy