一种用于多种训练方法的游泳诱导斑马鱼锻炼器材

摘要

专为不幸鱼类设计的健身器材通过控制水流速度，通过流变性实现，有助于实施不同强度的各种运动方案。

摘要

为了全面研究运动对健康和疾病的影响，动物模型起着关键作用。斑马鱼是一种广泛使用的脊椎动物模式生物，为此类研究提供了一个独特的平台。这项研究介绍了一种利用现成材料为斑马鱼运动研究量身定制的具有成本效益的设备的开发。该设备建立在游泳隧道的原理之上，包括与潜水泵相连的管道和阀门网络。水流由传感器仔细监测， 并通过 阀门进行调节。为了评估该设备的有效性，实施了两种训练方案:中等强度连续训练 （MICT） 和高强度间歇训练 （HIIT）。鱼被集体训练，并通过耐力测试评估它们的游泳表现。与久坐对照组相比，两种训练方案在训练 30 天后都导致游泳成绩的改善，并诱导了对运动的分子反应的改变。值得注意的是，HIIT 表现出优于 MICT 的效率。斑马鱼训练系统被证明是研究运动生理学的宝贵工具，并进一步推动了斑马鱼模型在该领域的实用性。

引言

体育锻炼包括骨骼肌进行的任何导致能量消耗增加的身体运动，运动是体育活动的结构化和重复子集¹。运动是一项涉及全身的多因素且具有成本效益的活动，可产生许多健康益处，例如预防代谢综合征和肌肉减少症²。因此，运动生理学领域具有重大兴趣，因为它试图阐明身体如何适应运动的急性压力、体育训练的慢性压力以及运动对健康的整体影响¹。

由于实验设计和参与者监测方面的挑战，在人体中进行运动生理学研究可能既昂贵又耗时³。因此，由于其遗传和生理的一致性，强烈建议在实验室环境中使用动物模型。此外，在受控的实验室条件下，动物通常具有久坐不动的生活方式和调节的食物摄入量⁴。在动物模型中，啮齿动物在涉及体育锻炼的研究中使用最广泛¹。然而，斑马鱼 （Danio rerio;Hamilton， 1822）是小鼠和其他物种的运动研究的补充模型 5,6,7,8。

在斑马鱼研究中，可以使用市售或定制的游泳隧道进行体育锻炼。在市售选项中，由 Loligo System 开发的 Blazka 型隧道是使用最频繁的 ^7,9,10。该系统通过与电动机相连的螺旋桨诱导强制游泳，从而在隧道内产生连续的水流。这种游泳能力植根于流变性原理，流变性是鱼类的一种固有行为，驱使它们逆流游动并保持位置¹¹。流变性可以测量临界游泳速度 （Ucrit），表示鱼在特定时间内可以维持的最大速度。然而，值得注意的是，这种设备虽然对于评估游泳行为和耗氧量很有价值，但成本很高¹²。

研究人员已经开发出用于锻炼斑马鱼的替代设备，通常基于 Blazka 型机制 10,13,14 或更简单的机制 ^8,15,16。尽管如此，这些方法可能会受到方案技术要求的限制，包括持续时间延长、大量设备费用以及通量和精度的限制。因此，该研究的主要目标是使用现成的材料设计一种价格合理且用户友好的斑马鱼锻炼系统，为鱼类的体育锻炼提供一种新的替代设备。第二个目标是在斑马鱼中实施有氧和厌氧运动方案，进一步推进斑马鱼模型作为运动研究干预策略的使用。

研究方案

这些程序事先获得了圣保罗联邦大学动物使用伦理委员会 （CEUA/UNIFESP no. 9206260521） 的批准。本研究仅使用 6 个月大、体重 2.5-3 g 的成年雌性野生型 Danio rerio。研究所需的设备和试剂列在 材料表中。

1. 定制斑马鱼运动器材

注意:健身器材是定制的。具体请参见 图 1、 补充表 1、 补充文件 1 和 补充文件 2。

1. 将潜水泵 （N） 放入水箱 （O） （≥30 L） 内。确保水满足以下条件:pH 值为 7.2 ± 0.5 和 400 ± 50 μS，28 ± 1 °C。
2. 流动 补充表 1 和 图 1，将管道 （I） 连接到指向三通管 （B），并将一根小管 （G） 连接到电缆管 B 的一侧。从 G 开始，建立与截止阀 （F） 的连接，然后连接到另一个 G，然后依次连接到管道弯头 （A） 和 I，从而完成负责调节系统内水压的段。这种调节是通过流向水箱 （O） 来实现的。
3. 在 B 的备用部分，将其连接到管道 （J），然后连接到 A 和 G。利用承插管件 （D） 将闸水阀 （E） 连接到 G。
4. 通过将一端的 B 连接到 G，并在另一端连接另一个 G，将鱼的入口集成到系统中。随后，将 承插管接头 （C） 连接到第二个 G，建立一个连接到亚克力管 （K） 的序列，这对于可视化游泳行为至关重要。
   1. 要将 K 连接到水流传感器 （M），请使用管道 C、G 和 D。继续使用 D 将 M 连接到 G，然后将 A、G 和 H 集成以方便水返回水库。
      注意: 在闸门和截止阀 （F2） 之间的短管段中插入蚊帐，以防止鱼类进入设备的其他部分。截止阀 （F） 具有双重用途。第一个截止阀 （F1） 控制在进入设备其余部分之前返回水库的水流，充当系统压力控制阀。截止阀 （F2） 是系统内斑马鱼的入口和出口点。
5. 在亚克力管的下游安装一个水流传感器。
   注意:流量传感器应连接到 LCD 显示器并使用 Arduino 进行编程（图 1）。补充 文件 2 中提供了 Arduino 设置的详细信息。

2. 仪器操作

1. 为了安全地将鱼引入系统，必须中断水流。为此，请关闭闸阀 （E），同时保持截止阀 （F1） 打开。随后，打开作为系统入口的截止阀 （F2），轻轻引入鱼，然后立即关闭 F2 阀。最后，打开 E 阀，将运动区域注满水。
2. 使用截止阀控制流速，在需要时将水分流回储液罐。
3. 利用闸阀 （F2） 进行精确的流量调节并管理鱼类通道。
4. 要在测试结束时去除鱼，请在遵守耗尽标准时关闭阀门 （E）。然后，打开阀门 F 并相对于亚克力管的轴线旋转 180°;这将有助于排出携带疲惫的鱼的水。
5. 执行流监控。
   注意: 有必要监控通过包含 Arduino Nano、16 x 2 LCD 屏幕、10 kΩ、0.25 W 通孔电阻器和 10 kΩ 电位计的系统的水流速度。流量传感器基于霍尔效应技术¹⁷ 持续监测水流速度。每个电流脉冲对应于传感器触发器的一圈，因此频率 （Hz） 为 6.6 x Q（以 L/min 为单位的流量）。
   1. 将流量传感器的相应电线连接到 Arduino Nano 的 5 V、GND 和 D2 引脚（补充表 1）。使用 Arduino IDE 将提供的草图（补充文件 1）加载到 Arduino 中。通过 Arduino USB 端口为系统供电。
      注意:流量测量值显示在 16 x 2 LCD 屏幕上。水流传感器的校准如图 2 所示。Arduino 与 LCD 的连接原理图如图 3 所示。

3. 耐力测试

注意: 此步骤概述了耐力测试的程序，以确定斑马鱼的最大游泳速度 （Umax）。

1. 首先，让鱼每天适应游泳隧道内的低水流速 （0.06 m/s） 60 分钟，持续两周。
   注意:经过 24 小时的预处理期后，个体斑马鱼将接受持续游泳性能测试。该测试的目的是确定每条鱼的 Umax。
2. 将斑马鱼单独放入设备中。
3. 测试条件:将鱼置于初始速度为 0.06 m/s 的水流中 10 分钟。
4. 速度增量:分阶段增加水流，每分钟以 0.02 m/s 的速度增量增加，持续 40-50 分钟。
5. Umax 测定:当鱼达到耗尽标准时，Recpod 最大游泳速度 （Umax）。
   注意:当观察到以下第一种情况时，即定义为疲惫:（1） 无法保持其逆水流的位置超过 3 次，或 （2） 无法保持其位置超过 5 秒。
6. 在遵守耗尽标准时关闭阀门 （E）。然后，打开阀门 F 并将其相对于丙烯酸管的轴线旋转 180°。这将有助于排水，携带疲惫的鱼。

4. 锻炼组和程序

注意:要建立不同的锻炼方案，必须包括一个暴露于相同实验条件下的久坐不动的群体，以比较锻炼方案的效果，尽管没有进行高强度运动。建立 Umax 也很重要，因为 Umax 值的分数对于确定运动方案的强度是必要的。

1. 久坐 （SED） 组:让鱼以 0.06 m/s 的速度逆水流被迫游泳 60 分钟。
   注意:该装置产生连续的水流，迫使鱼根据流变性¹¹ 的原理逆流游动。
2. 中等强度连续训练 （MICT） 组:让鱼以最大容量测试中确定的 60% Umax 逆水流强制游泳 35 分钟。
   注意:该协议改编自 Húngaro 等人¹⁸。在前 10 分钟内，鱼适应了与久坐组相同的速度 （0.05 m/s）。
3. 高强度间歇训练 （HIIT） 组:让鱼交替游泳速度:以 90% 的 Umax 进行 2 分钟，然后以 30% 的 Umax 进行 2 分钟，重复 18 分钟（9 个循环）。该协议改编自 Marcinko 等人 ¹⁹。
   注意:在运动期的前 10 分钟内，有必要使鱼适应与久坐组相同的速度（0.06 m/s）。
4. 在 4 周内每周 5 天实施所有锻炼方案。
   注意:鱼应饲养在提供适当条件的水族箱中，并且只能在指定的运动期间将它们引入健身器材。应为鱼提供每天 3 次热带鱼片状食物，维护水族箱中的水应每 2 天进行一次部分更换。
5. 在每周结束时重复耐力测试，将疲劳点的潜伏期和速度数据作为身体状况参数的指标。
6. 为了诱导过度训练效果，根据每 4 天训练周期后进行的耐力测试结果，每周增加水流速度。必须调整训练持续时间以考虑行进的距离（速度×时间），并且这些持续时间应在锻炼组之间保持一致。
7. 根据增加的水流调整游泳时间，从而标准化锻炼组的训练负荷。

5. 身体测量

1. 用 0.0075% 三卡因 （w/v） 浸泡麻醉鱼，以进行身体测量（体重和大小）²⁰。
2. 使用 ImageJ 软件对鱼进行拍照和称重以确定身体尺寸。
3. 用体况指数（体重 [g]/标准长度 [mm]2;BMI） 和身体状况评分 （BCS）²⁰。
4. 为了消除由卵形成引起的大小和重量变化，对鱼进行标准繁殖²⁰，然后进行测量和称重。

结果

该运动器材在调节流速方面表现出显着的效率。为了逐渐提高游泳速度，除 SED 组外，所有组每周水流量逐渐增加，SED 组保持 0.06 m/s 的恒定流速。值得注意的是，该设备实现了极高的精度，实现了高达 0.001 m/s 的流速调节。然而，在低速度（例如 0.06 m/s）下，误差率为 30%。在高速下，例如 0.3 m/s 和 0.5 m/s，误差率为 3%-4%（图 2）。训练期间达到的最?...

讨论

在这项研究中，受 Loligo Systems²¹ 的游泳隧道呼吸计和水槽系统²² 的启发，开发了一种创新、经济高效的锻炼系统，用于全面检查斑马鱼的游泳表现。Umax 是通过在离散阶段系统地增加水流量来确定的，速度增加发生在短间隔（20-30 分钟）内，直到鱼筋疲力尽，其特征是连续三次疲劳或无法克服游泳隧道中的水流。这些测定有助于设计两?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
CPVC Female 90-Degree Elbow for Plumbing	Tigre	22150260	3/4-inch
24AWG Wire	Sky Cablo Store		Connection between components in the Perforated Circuit Board (1m)
Acrylic pipe	The Clear Plastic Shop	41138408	3/4-inch
Aquarium Submersible Fish Tank	Aqua Tank		300w
CPVC Pipe	Tigre	10121787	3/4-inch
Female Threaded Gate Water Valve	Tigre	27950310	3/4-inch
Female Threaded Globe Water Valve	Tigre	27940510	3/4-inch
hrough-hole resistor	BXV		10 kΩ, 0.25W t
Lab Support Stand With Clamp with 30 inch rod	Masiye Labs	RSC0001	Support the horizontal pipes
LCD screen	Eichip		16 x 2, model JHD162A
Male x Male Dupont Jumpers	Chyan		Connection between arduino and flow sensor (30 cm)
Perforated Circuit Board single sided	KY WIN ROBOT		5 x 10 cm
Potentiometer	LUSYA	DL-ALPSA01	10kΩ
Roll of Water Blocking Tape	One World	5603131000	To avoid leaks
Silicone hose	Tigre	14211250	2 cm inner
Solder Station	QHTITEC	EU/US PLUG	Arduine system welding
Solder Wire Spool	BEEYIHF	I001-A001-Set	Arduine system welding
Threaded Male Socket and Unthreaded Female Socket CPVC Pipe Fitting	TIgre	35447849	3/4-inch
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich	E10521	Anesthetic
UNO-R3 board UNO R3 CH340G+MEGA328P Chip 16Mhz	FSXSEMI		For Arduino UNO R3 Development board
Unthreaded CPVC Tee Pipe Fitting, Female	Tigre	22200267	3/4-inch
Unthreaded Female CPVC Socket Pipe Fitting	Tigre	22170260	3/4-inch
Water Flow Sensor  model YF-B5	Siqma Robotics	SQ8659	1-25 L/min
Water Pump	Sunsun		Model HJ-2041, 3000L/h, 65W
Water reservoir	Custom		30 L