Un aparato de ejercicio de pez cebra inducido por la natación para enfoques de entrenamiento versátiles

Resumen

El aparato de ejercicio diseñado para peces menos afortunados facilita la implementación de diversos protocolos de ejercicio con diferentes intensidades mediante la manipulación de la velocidad del flujo de agua, alcanzable a través de la reotaxis.

Resumen

Para investigar de manera exhaustiva los efectos del ejercicio en la salud y la enfermedad, los modelos animales desempeñan un papel fundamental. El pez cebra, un organismo modelo de vertebrado ampliamente utilizado, ofrece una plataforma única para este tipo de estudios. Este estudio introdujo el desarrollo de un aparato rentable adaptado para los estudios de ejercicio del pez cebra utilizando materiales fácilmente disponibles. El dispositivo se basa en los principios de un túnel de natación y abarca una red de tuberías y válvulas conectadas a una bomba sumergible. El caudal de agua se controla meticulosamente mediante un sensor y se regula mediante válvulas. Para evaluar la efectividad del aparato, se implementaron dos protocolos de entrenamiento: entrenamiento continuo de intensidad moderada (MICT) y entrenamiento interválico de alta intensidad (HIIT). Los peces fueron entrenados colectivamente y su rendimiento en la natación se evaluó a través de una prueba de resistencia. Ambos protocolos de entrenamiento condujeron a mejoras en el rendimiento de la natación después de 30 días de entrenamiento e indujeron alteraciones en la respuesta molecular al ejercicio en comparación con un grupo de control sedentario. En particular, HIIT demostró una eficiencia superior a MICT. El sistema de entrenamiento del pez cebra demostró ser una herramienta valiosa para las investigaciones en fisiología del ejercicio y avanza aún más en la utilidad del modelo de pez cebra en este campo.

Introducción

El ejercicio físico abarca cualquier movimiento corporal realizado por los músculos esqueléticos que resulte en un mayor gasto de energía, siendo el ejercicio un subconjunto estructurado y repetitivo de las actividades físicas¹. El ejercicio, una actividad multifactorial y rentable que involucra a todo el cuerpo, produce numerosos beneficios para la salud, como la prevención del síndrome metabólico y la sarcopenia². En consecuencia, el campo de la fisiología del ejercicio tiene un interés significativo, ya que busca dilucidar cómo el cuerpo se adapta al estrés agudo del ejercicio, el estrés crónico del entrenamiento físico y el impacto general del ejercicio en^{la salud.}

La realización de estudios de fisiología del ejercicio en humanos puede ser costosa y requerir mucho tiempo debido a los desafíos en el diseño experimental y el seguimiento de los participantes³. Por lo tanto, el uso de modelos animales en entornos de laboratorio ha sido muy recomendable debido a su uniformidad genética y fisiológica. Además, en condiciones controladas de laboratorio, los animales suelen tener estilos de vida sedentarios y una ingesta de alimentos regulada⁴. Entre los modelos animales, los roedores han sido los más utilizados en la investigación relacionada con el ejercicio físico¹. Sin embargo, el pez cebra (Danio rerio; Hamilton, 1822) es un modelo complementario a los murinos y a otras especies para los estudios del ejercicio 5,6,7,8.

En la investigación del pez cebra, el ejercicio físico se puede llevar a cabo utilizando túneles de natación disponibles comercialmente o hechos a medida. Entre las opciones disponibles en el mercado, el túnel tipo Blazka, desarrollado por el Sistema Loligo, es el más utilizado ^7,9,10. Este sistema induce la natación forzada a través de una hélice acoplada a un motor eléctrico, generando un flujo continuo de agua dentro del túnel. Esta capacidad de natación se basa en el principio de la reotaxis, un comportamiento innato en los peces que los impulsa a nadar contra las corrientes de agua y mantener^{su posición.} La reotaxis permite la medición de la velocidad crítica de natación (Ucrit), que representa la velocidad máxima que un pez puede mantener durante un período específico. Sin embargo, vale la pena señalar que este equipo, si bien es valioso para evaluar el comportamiento de natación y el consumo de oxígeno, tiene un costo significativo¹².

Los investigadores han desarrollado aparatos alternativos para ejercitar al pez cebra, a menudo basados en el mecanismo de tipo Blazka^10,13,14 o mecanismos más simples ^8,15,16. No obstante, estos métodos pueden estar limitados por las demandas técnicas del protocolo, incluidas las duraciones prolongadas, los gastos sustanciales de equipo y las limitaciones en el rendimiento y la precisión. En consecuencia, el objetivo principal del estudio fue diseñar un sistema de ejercicio de pez cebra asequible y fácil de usar utilizando materiales fácilmente disponibles, proporcionando un nuevo aparato alternativo para el ejercicio físico en peces. Un objetivo secundario fue implementar regímenes de ejercicio aeróbico y anaeróbico en pez cebra, avanzando aún más en la utilización del modelo de pez cebra como estrategia de intervención en la investigación del ejercicio.

Protocolo

Los procedimientos recibieron la aprobación previa del Comité de Ética en Uso Animal de la Universidad Federal de São Paulo (CEUA/UNIFESP nº 9206260521). En este estudio solo se emplearon hembras adultas de tipo salvaje Danio rerio, de 6 meses de edad y con un peso de 2,5-3 g. El equipo y los reactivos necesarios para el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Aparato de ejercicio de pez cebra hecho a medida

NOTA: El aparato de ejercicio fue hecho a medida. Para obtener más información, consulte la Figura 1, la Tabla complementaria 1, el Archivo complementario 1 y el Archivo complementario 2.

1. Coloque una bomba sumergible (N) dentro de un tanque de agua (O) (≥30 L). Asegúrese de que el agua cumpla con las siguientes condiciones: pH de 7,2 ± 0,5 y 400 ± 50 μS, 28 ± 1 °C.
2. Flujo Suplementario Tabla 1 y Figura 1, conecte la tubería (I) al tubo en T del punto (B) y conecte una tubería pequeña (G) al lado de B. Desde G, establecer conexiones a la Válvula de Globo (F), luego a otra G, y en secuencia a la Tubería Codo (A) e I, completando así el segmento responsable de regular la presión del agua dentro del sistema. Esta regulación se logra a través de un flujo de retorno al tanque de agua (O).
3. En la sección alternativa de B, conéctelo a una tubería (J), seguido de las conexiones a A y G. Utilice el accesorio de tubería de zócalo (D) para conectar la válvula de agua de compuerta (E) a G.
4. Integre un puerto de entrada de peces en el sistema conectando B a G en un extremo y conectando otro G en el extremo opuesto. Posteriormente, conecte el Socket Pipe Fitting (C) a esta segunda G, estableciendo una secuencia que se conecte con el Tubo Acrílico (K), que es crucial para visualizar el comportamiento de natación.
   1. Para conectar K al sensor de flujo de agua (M), utilice las tuberías C, G y D. Proceda a conectar M a G usando D, y luego integre A, G y H para facilitar el regreso del agua al depósito.
      NOTA: Inserte una mosquitera en el segmento corto del tubo entre la compuerta y la válvula de globo (F2) para evitar que los peces accedan a otras secciones del aparato. La válvula de globo (F) tiene un doble propósito. La primera válvula de globo (F1) controla el flujo de agua que regresa al depósito antes de ingresar al resto del aparato, actuando como una válvula de control de presión del sistema. La válvula de globo (F2) es un punto de entrada y salida para el pez cebra dentro del sistema.
5. Conecte un sensor de flujo de agua aguas abajo de la tubería acrílica.
   NOTA: El sensor de flujo debe estar conectado a una pantalla LCD y programado usando un Arduino (Figura 1). Los detalles de la configuración de Arduino se proporcionan en el Archivo Complementario 2.

2. Funcionamiento del aparato

1. Para introducir los peces de forma segura en el sistema, es esencial interrumpir el flujo de agua. Para lograr esto, cierre la válvula de compuerta (E) mientras mantiene abierta la válvula de globo (F1). Posteriormente, abra la válvula de globo (F2), que sirve como entrada al sistema, introduzca suavemente el pez y cierre rápidamente la válvula F2. Finalmente, abra la válvula E para llenar el área de ejercicio con agua.
2. Use la válvula de globo para controlar la velocidad del flujo, desviando el agua de regreso al depósito cuando sea necesario.
3. Utilice la válvula de compuerta (F2) para un ajuste preciso del flujo y para administrar el acceso de los peces.
4. Para retirar el pez al final de la prueba, cierre la válvula (E) observando los criterios de agotamiento. Luego, abra la válvula F y gírela 180° con respecto al eje del tubo acrílico; Esto facilitará el drenaje del agua que arrastra consigo a los peces agotados.
5. Realice el monitoreo de flujo.
   NOTA: Es necesario monitorear la velocidad del flujo de agua a través de un sistema que incorpora un Arduino Nano, una pantalla LCD de 16 x 2, una resistencia de orificio pasante de 10 kΩ de 0,25 W y un potenciómetro de 10 kΩ. El sensor de caudal supervisa continuamente la velocidad del caudal de agua basándose en la tecnología de efecto Hall¹⁷. Cada pulso de corriente corresponde a una revolución del fleje del sensor, lo que da como resultado una frecuencia (Hz) de 6,6 x Q (caudal en L/min).
   1. Conecte los cables apropiados del sensor de flujo a los pines de 5 V, GND y D2 del Arduino Nano (Tabla complementaria 1). Cargue el boceto proporcionado (Archivo complementario 1) en el Arduino utilizando el IDE de Arduino. Alimenta el sistema a través del puerto USB de Arduino.
      NOTA: Las mediciones de caudal se muestran en la pantalla LCD de 16 x 2. La calibración del sensor de flujo de agua se muestra en la Figura 2. Los esquemas de las conexiones de Arduino a la pantalla LCD se ilustran en la Figura 3.

3. Prueba de resistencia

NOTA: Este paso describe el procedimiento para la prueba de resistencia para determinar la velocidad máxima de natación (Umax) del pez cebra.

1. En primer lugar, permita que los peces se adapten durante 60 minutos al día a una velocidad de flujo de agua baja (0,06 m/s) dentro del túnel de natación durante dos semanas.
   NOTA: Después de un período de preacondicionamiento de 24 horas, cada pez cebra se someterá a la prueba de rendimiento de natación sostenida. El propósito de esta prueba es establecer el Umax de cada pez.
2. Coloque el pez cebra individualmente en el aparato.
3. Condiciones de prueba: Coloque el pez contra un flujo de agua con una velocidad inicial de 0,06 m/s durante 10 min.
4. Incrementos de velocidad: Aumente el flujo de agua en etapas discretas, con incrementos de velocidad de 0,02 m/s cada minuto durante 40-50 minutos.
5. Determinación de Umax: Recpod la velocidad máxima de nado (Umax) cuando los peces cumplen con los criterios de agotamiento.
   NOTA: El agotamiento se define cuando se observa la primera de las siguientes situaciones: (1) Incapacidad para mantener su posición contra el flujo de agua durante más de tres instancias, o (2) Incapacidad para mantener su posición durante más de 5 s.
6. Cierre la válvula (E) observando los criterios de agotamiento. Luego, abra la válvula F y gírela 180° con respecto al eje del tubo acrílico. Esto facilitará el drenaje del agua, arrastrando los peces exhaustos.

4. Grupos de ejercicios y procedimiento

NOTA: Para establecer protocolos de ejercicio distintos, es imprescindible incluir un grupo sedentario expuesto a condiciones experimentales idénticas para comparar los efectos de los protocolos de ejercicio, aunque sin someterse a ejercicio de alta intensidad. También es fundamental establecer la Umax porque las fracciones del valor de la Umax son necesarias para determinar la intensidad de los protocolos de ejercicio.

1. Grupo sedentario (SED): Someter a los peces a nadar forzado contra la corriente de agua a 0,06 m/s durante 60 min.
   NOTA: El aparato genera un flujo de agua continuo, obligando a los peces a nadar contra esta corriente basándose en el principio de la reotaxis¹¹.
2. Grupo de Entrenamiento Continuo de Intensidad Moderada (MICT): Someter a los peces a nadar forzado contra el flujo de agua al 60% de Umax, según lo determinado en la prueba de capacidad máxima, durante 35 min.
   NOTA: Este protocolo fue adaptado de Húngaro et ^al.18. Durante los primeros 10 min, el pez se aclimató a la misma velocidad que el grupo sedentario (0,05 m/s).
3. Grupo de entrenamiento interválico de alta intensidad (HIIT): Someter a los peces a natación forzada alternando las velocidades de nado: 2 min al 90% de Umax seguido de 2 min al 30% de Umax, repetido durante 18 min (9 ciclos). Este protocolo fue adaptado de Marcinko et ^al.19.
   NOTA: Durante los primeros 10 min del período de ejercicio, es necesario aclimatar a los peces a la misma velocidad que el grupo sedentario (0,06 m/s).
4. Implemente todos los protocolos de ejercicio durante 5 días a la semana durante un período de cuatro semanas.
   NOTA: Los peces deben alojarse en acuarios que proporcionen condiciones adecuadas, y solo deben introducirse en el aparato de ejercicio durante los períodos de ejercicio designados. Los peces deben recibir alimentos en copos de peces tropicales tres veces al día, y el agua de los acuarios de mantenimiento debe sufrir un cambio parcial cada 2 días.
5. Repetir la prueba de resistencia al final de cada semana, con datos de latencia y velocidad en el punto de fatiga como indicadores de los parámetros de acondicionamiento físico.
6. Para inducir los efectos del sobreentrenamiento, aumente la velocidad del flujo de agua semanalmente en función de los resultados de la prueba de resistencia realizada después de cada ciclo de entrenamiento de 4 días. Las duraciones del entrenamiento deben ajustarse para tener en cuenta la distancia recorrida (velocidad × tiempo), y estas duraciones deben permanecer consistentes entre los grupos ejercitados.
7. Ajustar el tiempo de natación en respuesta al aumento del caudal de agua, estandarizando así la carga de entrenamiento en los grupos ejercitados.

5. Medidas corporales

1. Anestesiar a los peces con tricaína al 0,0075% (p/v) por inmersión para la realización de mediciones corporales (peso y talla)²⁰.
2. Fotografíe y pese a los peces para determinar las dimensiones corporales utilizando el software ImageJ.
3. Expresar los datos en términos de Índices de Condición Corporal (peso [g]/longitud estándar [mm]2; IMC) y puntuación de la condición corporal (BCS)²⁰.
4. Para eliminar las variaciones de tamaño y peso causadas por la formación de huevos, someta a los peces a la cría estándar²⁰, seguida de mediciones y pesaje.

Resultados

El aparato de ejercicio demostró una notable eficiencia en la regulación de la velocidad del flujo. Para mejorar gradualmente la velocidad de nado, el flujo de agua se incrementó gradualmente semanalmente para todos los grupos, excepto para el grupo SED, que se mantuvo a una velocidad de flujo constante de 0,06 m/s. En particular, el aparato permitía un notable nivel de precisión, logrando ajustes de velocidad de flujo tan finos como 0,001 m/s. Sin embargo, la tasa de error fue del ...

Discusión

En este estudio, se desarrolló un sistema de ejercicio innovador y rentable inspirado en el respirómetro de túnel de natación de Loligo Systems²¹ y el sistema de canal²² para el examen exhaustivo del rendimiento de natación del pez cebra. La Umax se determinó aumentando sistemáticamente el caudal de agua en etapas discretas, con incrementos de velocidad que ocurrieron en intervalos cortos (20-30 min) hasta que el pez alcanzó el agot...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
CPVC Female 90-Degree Elbow for Plumbing	Tigre	22150260	3/4-inch
24AWG Wire	Sky Cablo Store		Connection between components in the Perforated Circuit Board (1m)
Acrylic pipe	The Clear Plastic Shop	41138408	3/4-inch
Aquarium Submersible Fish Tank	Aqua Tank		300w
CPVC Pipe	Tigre	10121787	3/4-inch
Female Threaded Gate Water Valve	Tigre	27950310	3/4-inch
Female Threaded Globe Water Valve	Tigre	27940510	3/4-inch
hrough-hole resistor	BXV		10 kΩ, 0.25W t
Lab Support Stand With Clamp with 30 inch rod	Masiye Labs	RSC0001	Support the horizontal pipes
LCD screen	Eichip		16 x 2, model JHD162A
Male x Male Dupont Jumpers	Chyan		Connection between arduino and flow sensor (30 cm)
Perforated Circuit Board single sided	KY WIN ROBOT		5 x 10 cm
Potentiometer	LUSYA	DL-ALPSA01	10kΩ
Roll of Water Blocking Tape	One World	5603131000	To avoid leaks
Silicone hose	Tigre	14211250	2 cm inner
Solder Station	QHTITEC	EU/US PLUG	Arduine system welding
Solder Wire Spool	BEEYIHF	I001-A001-Set	Arduine system welding
Threaded Male Socket and Unthreaded Female Socket CPVC Pipe Fitting	TIgre	35447849	3/4-inch
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich	E10521	Anesthetic
UNO-R3 board UNO R3 CH340G+MEGA328P Chip 16Mhz	FSXSEMI		For Arduino UNO R3 Development board
Unthreaded CPVC Tee Pipe Fitting, Female	Tigre	22200267	3/4-inch
Unthreaded Female CPVC Socket Pipe Fitting	Tigre	22170260	3/4-inch
Water Flow Sensor  model YF-B5	Siqma Robotics	SQ8659	1-25 L/min
Water Pump	Sunsun		Model HJ-2041, 3000L/h, 65W
Water reservoir	Custom		30 L