다양한 훈련 접근법을 위한 수영 유도 제브라피시 운동 기구

요약

불우한 물고기를 위해 설계된 운동 기구는 유변 축성을 통해 달성할 수 있는 물의 흐름 속도를 조작하여 다양한 강도의 다양한 운동 프로토콜의 구현을 용이하게 합니다.

초록

운동이 건강과 질병에 미치는 영향을 종합적으로 조사하기 위해서는 동물 모델이 중추적인 역할을 합니다. 널리 활용되는 척추동물 모델 유기체인 제브라피쉬는 이러한 연구를 위한 독특한 플랫폼을 제공합니다. 이 연구는 쉽게 구할 수 있는 재료를 활용하여 제브라피시 운동 연구에 맞춤화된 비용 효율적인 장치 개발을 소개했습니다. 이 장치는 수영 터널의 원리에 기반을 두고 있으며 수중 펌프에 연결된 파이프 및 밸브 네트워크를 포함합니다. 물의 흐름은 센서에 의해 꼼꼼하게 모니터링되고 밸브를 통해 조절됩니다. 기구의 효과를 평가하기 위해 중간 강도 연속 훈련(MICT)과 고강도 인터벌 훈련(HIIT)의 두 가지 훈련 프로토콜이 구현되었습니다. 물고기는 집단적으로 훈련을 받았고, 지구력 테스트를 통해 수영 성능을 평가했습니다. 두 훈련 프로토콜 모두 30일간의 훈련 후 수영 수행 능력의 개선으로 이어졌으며 앉아서 생활하는 대조군에 비해 운동에 대한 분자 반응의 변화를 유도했습니다. 특히 HIIT는 MICT보다 우수한 효율성을 보여주었습니다. 제브라피시 훈련 시스템은 운동 생리학 연구에 유용한 도구임이 입증되었으며 이 분야에서 제브라피시 모델의 유용성을 더욱 발전시켰습니다.

서문

신체 운동은 에너지 소비를 증가시키는 골격근에 의해 수행되는 모든 신체 움직임을 포함하며, 운동은 신체 활동의 구조적이고 반복적인 하위 집합입니다¹. 운동은 몸 전체를 포함하는 다요인적이고 비용 효율적인 활동으로, 대사 증후군과 근감소증 예방과 같은 수많은 건강상의 이점을 제공한다². 결과적으로, 운동생리학 분야는 운동의 급성 스트레스, 신체 훈련의 만성 스트레스, 운동이 건강에 미치는 전반적인 영향에 신체가 어떻게 적응하는지 밝히는 데 큰 관심을 가지고 있습니다¹.

인간을 대상으로 운동 생리학 연구를 수행하는 것은 실험 설계 및 참가자 모니터링의 문제로 인해 비용과 시간이 많이 소요될 수 있습니다³. 따라서 유전적 및 생리적 균일성으로 인해 실험실 환경에서 동물 모델을 사용하는 것이 적극 권장됩니다. 더욱이, 통제된 실험실 조건 하에서, 동물들은 전형적으로 주로 앉아서 생활하고 음식 섭취를 조절한다⁴. 동물 모델 중에서, 설치류는 신체 운동과 관련된 연구에서 가장 널리 사용되어 왔다¹. 그러나 제브라피시(Danio rerio; Hamilton, 1822)는 운동 연구를 위한 쥐 및 다른 종에 대한 보완 모델이다 5,6,7,8.

제브라피시 연구에서 신체 운동은 상업적으로 이용 가능하거나 맞춤형 수영 터널을 사용하여 수행할 수 있습니다. 상업적으로 이용 가능한 옵션 중 Loligo System에서 개발 한 Blazka 형 터널이 가장 자주 사용되는 ^7,9,10입니다. 이 시스템은 전기 모터에 연결된 프로펠러를 통해 강제 수영을 유도하여 터널 내에서 연속적인 물 흐름을 생성합니다. 이 수영 능력은 유변 주성(rheotaxis)의 원리에 뿌리를 두고 있는데, 이는 물고기가 물의 흐름을 거슬러 헤엄치고 위치를 유지하도록 유도하는 타고난 행동입니다¹¹. Rheotaxis를 사용하면 물고기가 특정 시간 동안 유지할 수 있는 최대 속도를 나타내는 임계 수영 속도(Ucrit)를 측정할 수 있습니다. 그러나 이 장비는 수영 행동과 산소 소비량을 평가하는 데 유용하지만 상당한 비용이 든다는 점은 주목할 가치가 있습니다¹².

연구자들은 제브라피시를 운동시키기 위한 대체 기구를 개발했는데, 이는 종종 블라즈카(Blazka) 유형의 메커니즘(10,13,14) 또는 더 간단한 메커니즘(^8,15,16)에 기초한다. 그럼에도 불구하고 이러한 방법은 연장된 기간, 상당한 장비 비용, 처리량 및 정밀도의 제한을 포함하여 프로토콜의 기술적 요구 사항에 의해 제한될 수 있습니다. 결과적으로, 이 연구의 주요 목적은 쉽게 구할 수 있는 재료를 사용하여 저렴하고 사용자 친화적인 제브라피시 운동 시스템을 설계하여 물고기의 신체 운동을 위한 새로운 대체 장치를 제공하는 것이었습니다. 두 번째 목표는 제브라피시에서 유산소 및 무산소 운동 요법을 모두 구현하여 운동 연구의 중재 전략으로 제브라피시 모델의 활용을 더욱 발전시키는 것이었습니다.

프로토콜

이 절차는 상파울루 연방 대학의 동물 사용 윤리 위원회(CEUA/UNIFESP 번호 9206260521)로부터 사전 승인을 받았습니다. 이 연구에는 생후 6개월, 체중 2.5-3g의 성체 암컷 야생형 Danio rerio만 사용되었습니다. 연구에 필요한 장비 및 시약은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 맞춤형 제브라피시 운동기구

알림: 운동 기구는 맞춤 제작되었습니다. 자세한 내용은 그림 1, 보충 표 1, 보충 파일 1 및 보충 파일 2를 참조하십시오.

1. 물탱크(O)(≥30L) 안에 수중 펌프(N)를 넣습니다. 물이 pH 7.2 ± 0.5 및 400 ± 50 μS, 28 ± 1 °C의 조건을 충족하는지 확인하십시오.
2. 보충표 1 및 그림 1을 참조하여 파이프(I)를 티파이프(B)를 가리키도록 연결하고, B측에 작은 파이프(G)를 부착한다. G에서 글로브 밸브 (F), 다른 G, 파이프 엘보 (A) 및 I에 차례로 연결하여 시스템 내 수압 조절을 담당하는 세그먼트를 완성합니다. 이 조절은 물 탱크(O)로의 복귀 흐름을 통해 달성됩니다.
3. B의 대체 섹션에서 파이프(J)에 연결한 다음 A와 G에 연결합니다. 소켓 파이프 피팅(D)을 사용하여 게이트 워터 밸브(E)를 G에 연결합니다.
4. 한쪽 끝에서 B를 G에 연결하고 반대쪽 끝에 다른 G를 연결하여 물고기 진입 포트를 시스템에 통합합니다. 그런 다음 소켓 파이프 피팅(C)을 이 두 번째 G에 연결하여 수영 동작을 시각화하는 데 중요한 아크릴 파이프(K)에 연결되는 시퀀스를 설정합니다.
   1. K를 수류 센서(M)에 연결하려면 파이프 C, G, D를 활용하고 D를 사용하여 M을 G로 연결한 다음 A, G, H를 적분하여 물이 저수지로 쉽게 돌아갈 수 있도록 합니다.
      알림: 게이트와 글로브 밸브(F2) 사이의 짧은 파이프 부분에 모기 방충망을 삽입하여 물고기가 장치의 다른 부분에 접근하는 것을 방지합니다. 글로브 밸브(F)는 두 가지 용도로 사용됩니다. 첫 번째 글로브 밸브 (F1)는 시스템의 압력 제어 밸브 역할을하는 장치의 나머지 부분으로 들어가기 전에 저장소로 돌아가는 물의 흐름을 제어합니다. 글로브 밸브(F2)는 시스템 내 제브라피시의 진입 및 출구 지점입니다.
5. 아크릴 파이프의 하류에 물 흐름 센서를 부착합니다.
   알림: 유량 센서는 LCD 디스플레이에 연결하고 Arduino를 사용하여 프로그래밍해야 합니다(그림 1). Arduino 설정에 대한 자세한 내용은 보충 파일 2에 나와 있습니다.

2. 장치 작동

1. 물고기를 시스템에 안전하게 도입하려면 물의 흐름을 차단하는 것이 필수적입니다. 이를 위해 글로브 밸브(F1)를 열어 둔 상태에서 게이트 밸브(E)를 닫으십시오. 그런 다음 시스템의 입구 역할을 하는 글로브 밸브(F2)를 열고 물고기를 부드럽게 소개한 다음 F2 밸브를 즉시 닫습니다. 마지막으로 E 밸브를 열어 운동 공간을 물로 채웁니다.
2. 글로브 밸브를 사용하여 흐름 속도를 제어하고 필요할 때 물을 저장소로 다시 전환합니다.
3. 게이트 밸브(F2)를 사용하여 정확한 유량 조정과 물고기 접근을 관리합니다.
4. 테스트가 끝날 때 물고기를 제거하려면 배기 기준을 준수한 후 밸브(E)를 닫으십시오. 그런 다음 밸브 F를 열고 아크릴 튜브의 축을 기준으로 180° 회전합니다. 이것은 지친 물고기를 운반하는 물의 배수를 용이하게 할 것입니다.
5. 유량 모니터링을 수행합니다.
   알림: Arduino Nano, 16 x 2 LCD 화면, 10kΩ, 0.25W 스루홀 저항기 및 10kΩ 전위차계가 통합된 시스템을 통해 물의 흐름 속도를 모니터링해야 합니다. 유량 센서는 홀 효과 기술¹⁷을 기반으로 물의 흐름 속도를 지속적으로 모니터링합니다. 각 전류 펄스는 센서 플로퍼의 1회전에 해당하며, 그 결과 주파수(Hz)는 6.6 x Q(L/min 단위의 유속)가 됩니다.
   1. 유량 센서의 해당 전선을 Arduino Nano의 5V, GND 및 D2 핀에 연결합니다(보충 표 1). Arduino IDE를 사용하여 제공된 스케치(보충 파일 1)를 Arduino에 로드합니다. Arduino USB 포트를 통해 시스템에 전원을 공급합니다.
      알림: 유량 측정은 16 x 2 LCD 화면에 표시됩니다. 물 흐름 센서의 보정은 그림 2에 나와 있습니다. LCD에 대한 Arduino 연결의 회로도는 그림 3에 나와 있습니다.

3. 내구성 테스트

알림: 이 단계는 제브라피쉬의 최대 수영 속도(Umax)를 결정하기 위한 내구성 테스트 절차를 간략하게 설명합니다.

1. 먼저 물고기가 2주 동안 수영 터널 내부의 낮은 수속(0.06m/s)에 하루 60분 동안 적응하도록 합니다.
   참고: 24시간의 사전 컨디셔닝 기간이 끝나면 개별 제브라피쉬는 지속적인 수영 성능 테스트를 받게 됩니다. 이 테스트의 목적은 각 물고기의 Umax를 설정하는 것입니다.
2. 제브라피시를 장치에 개별적으로 놓습니다.
3. 테스트 조건: 10분 동안 초기 속도 0.06m/s의 물 흐름에 대해 물고기를 배치합니다.
4. 속도 증가: 40-50분 동안 분당 0.02m/s의 속도 증가로 개별 단계로 물 흐름을 증가시킵니다.
5. Umax 결정: 물고기가 탈진 기준을 충족할 때 최대 수영 속도(Umax)를 조정합니다.
   알림: 탈진은 다음 상황 중 첫 번째 상황이 관찰될 때 정의됩니다: (1) 세 번 이상 물의 흐름에 대해 위치를 유지할 수 없거나 (2) 5초 이상 위치를 유지할 수 없음.
6. 배기 기준을 준수한 후 밸브(E)를 닫습니다. 그런 다음 밸브 F를 열고 아크릴 튜브의 축을 기준으로 180° 회전합니다. 이것은 물의 배수를 용이하게하여 지친 물고기를 운반합니다.

4. 운동 그룹 및 절차

참고: 뚜렷한 운동 프로토콜을 설정하려면 고강도 운동을 하지 않더라도 운동 프로토콜의 효과를 비교하기 위해 동일한 실험 조건에 노출된 앉아있는 그룹을 포함하는 것이 필수적입니다. Umax 값의 분율이 운동 프로토콜의 강도를 결정하는 데 필요하기 때문에 Umax를 설정하는 것도 중요합니다.

1. 앉아있는 (SED) 그룹: 물고기를 60분 동안 0.06m/s의 물 흐름에 맞서 강제로 수영하도록 합니다.
   알림: 이 장치는 연속적인 물 흐름을 생성하여 rheotaxis¹¹의 원리에 따라 물고기가 이 흐름에 맞서 수영하도록 합니다.
2. 중간 강도 연속 훈련(MICT) 그룹: 최대 용량 테스트에서 결정된 대로 Umax의 60%에서 35분 동안 물고기를 물 흐름에 맞서 강제로 수영하도록 합니다.
   참고: 이 프로토콜은 Húngaro et ^al.18에서 채택되었습니다. 처음 10분 동안 물고기는 앉아있는 그룹과 동일한 속도(0.05m/s)에 적응했습니다.
3. 고강도 인터벌 트레이닝(HIIT) 그룹: 물고기에게 Umax의 90%에서 2분, Umax의 30%에서 2분을 번갈아 가며 강제로 수영하도록 합니다. 이 프로토콜은 Marcinko et ^al.19에서 채택되었습니다.
   알림: 운동 시간의 처음 10분 동안은 물고기가 앉아있는 그룹과 동일한 속도(0.06m/s)로 적응해야 합니다.
4. 4주 동안 일주일에 5일 동안 모든 운동 프로토콜을 시행합니다.
   알림: 물고기는 적절한 조건을 제공하는 수족관에 수용해야 하며 지정된 운동 시간 동안에만 운동 기구에 넣어야 합니다. 물고기에게는 하루에 세 번 열대어 박편 먹이를 제공해야 하며, 유지 관리 수족관의 물은 2일에 한 번씩 부분적으로 교체해야 합니다.
5. 매주 말에 내구성 테스트를 반복하고, 피로 지점의 지연 시간 및 속도 데이터를 신체 컨디셔닝 매개변수의 지표로 사용합니다.
6. 과도한 훈련 효과를 유도하려면 각 4일 훈련 주기 후에 수행된 지구력 테스트 결과에 따라 매주 물 흐름 속도를 높이십시오. 훈련 시간은 이동 거리(속도 × 시간)를 고려하여 조정해야 하며, 이러한 지속 시간은 운동한 그룹 간에 일관되게 유지되어야 합니다.
7. 증가된 물의 흐름에 대응하여 수영 시간을 조정하여 운동한 그룹 전체의 훈련 부하를 표준화합니다.

5. 신체 측정

1. 신체 측정(체중 및 크기)을 수행하기 위해 침지로 0.0075% 트리카인(w/v)으로 물고기를 마취합니다²⁰.
2. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 물고기의 몸 치수를 결정하기 위해 사진을 찍고 무게를 잰다.
3. 신체 상태 지수(체중 [g]/표준 길이 [mm]2; BMI) 및 신체 상태 점수(BCS)²⁰.
4. 알 형성으로 인한 크기 및 무게 변화를 제거하려면 물고기를 표준 번식²⁰ 한 다음 측정 및 무게를 측정합니다.

결과

운동 기구는 유속을 조절하는 데 놀라운 효율성을 보여주었습니다. 수영 속도를 점진적으로 향상시키기 위해 0.06m/s의 일정한 유속으로 유지된 SED 그룹을 제외한 모든 그룹에 대해 물의 흐름을 매주 점진적으로 증가시켰습니다. 특히, 이 장치는 0.001m/s의 미세한 유속 조정을 달성하여 놀라운 수준의 정밀도를 허용했습니다. 그러나 오류율은 0.06m/s와 같은 저속에서 30%였습?...

토론

이 연구에서는 제브라피시 수영 성능을 종합적으로 검사하기 위해 Loligo Systems²¹ 의 수영 터널 호흡계와 수로 시스템²² 에서 영감을 받아 혁신적이고 비용 효율적인 운동 시스템을 개발했습니다. Umax는 물고기가 탈진에 도달 할 때까지 짧은 간격 (20-30 분)에 걸쳐 속도 증가와 함께 불연속적인 단계로 물의 흐름을 체계적으로 증가시켜 결?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
CPVC Female 90-Degree Elbow for Plumbing	Tigre	22150260	3/4-inch
24AWG Wire	Sky Cablo Store		Connection between components in the Perforated Circuit Board (1m)
Acrylic pipe	The Clear Plastic Shop	41138408	3/4-inch
Aquarium Submersible Fish Tank	Aqua Tank		300w
CPVC Pipe	Tigre	10121787	3/4-inch
Female Threaded Gate Water Valve	Tigre	27950310	3/4-inch
Female Threaded Globe Water Valve	Tigre	27940510	3/4-inch
hrough-hole resistor	BXV		10 kΩ, 0.25W t
Lab Support Stand With Clamp with 30 inch rod	Masiye Labs	RSC0001	Support the horizontal pipes
LCD screen	Eichip		16 x 2, model JHD162A
Male x Male Dupont Jumpers	Chyan		Connection between arduino and flow sensor (30 cm)
Perforated Circuit Board single sided	KY WIN ROBOT		5 x 10 cm
Potentiometer	LUSYA	DL-ALPSA01	10kΩ
Roll of Water Blocking Tape	One World	5603131000	To avoid leaks
Silicone hose	Tigre	14211250	2 cm inner
Solder Station	QHTITEC	EU/US PLUG	Arduine system welding
Solder Wire Spool	BEEYIHF	I001-A001-Set	Arduine system welding
Threaded Male Socket and Unthreaded Female Socket CPVC Pipe Fitting	TIgre	35447849	3/4-inch
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich	E10521	Anesthetic
UNO-R3 board UNO R3 CH340G+MEGA328P Chip 16Mhz	FSXSEMI		For Arduino UNO R3 Development board
Unthreaded CPVC Tee Pipe Fitting, Female	Tigre	22200267	3/4-inch
Unthreaded Female CPVC Socket Pipe Fitting	Tigre	22170260	3/4-inch
Water Flow Sensor  model YF-B5	Siqma Robotics	SQ8659	1-25 L/min
Water Pump	Sunsun		Model HJ-2041, 3000L/h, 65W
Water reservoir	Custom		30 L