遊泳用ゼブラフィッシュ運動装置による多様なトレーニングアプローチ

要約

恵まれない魚のために設計された運動装置は、レオタキシスによって達成可能な水流速度を操作することにより、さまざまな強度の多様な運動プロトコルの実装を容易にします。

要約

運動が健康や病気に及ぼす影響を包括的に調査するためには、動物モデルが重要な役割を果たします。ゼブラフィッシュは、脊椎動物のモデル生物として広く利用されており、このような研究のためのユニークなプラットフォームを提供しています。この研究では、入手しやすい材料を利用したゼブラフィッシュの運動研究に適した費用対効果の高い装置の開発を紹介しました。この装置は、水泳トンネルの原理に基づいており、水中ポンプにリンクされたパイプとバルブのネットワークを包含しています。水の流れはセンサーによって細心の注意を払って監視され、バルブ を介して 調整されます。装置の有効性を評価するために、中強度の連続トレーニング(MICT)と高強度インターバルトレーニング(HIIT)の2つのトレーニングプロトコルが実装されました。魚は集団で訓練され、その遊泳能力は持久力テストを通じて評価されました。どちらのトレーニングプロトコルも、30日間のトレーニング後に水泳パフォーマンスの改善につながり、座りがちな対照群と比較して運動に対する分子反応の変化を誘発しました。特に、HIITはMICTよりも優れた効率を示しました。ゼブラフィッシュのトレーニングシステムは、運動生理学の研究に貴重なツールであることが証明され、この分野におけるゼブラフィッシュモデルの有用性をさらに前進させます。

概要

身体運動には、骨格筋によって行われる身体の動きが含まれ、エネルギー消費が増加するため、運動は身体活動の構造化された反復的なサブセットです¹。運動は、全身を巻き込む多因子的で費用対効果の高い活動であり、メタボリックシンドロームやサルコペニア^の予防など、多くの健康上の利点をもたらします2。したがって、運動生理学の分野は、運動の急性ストレス、身体トレーニングの慢性ストレス、および運動が健康に及ぼす全体的な影響に対して身体がどのように適応するかを解明しようとするため、大きな関心を集めています¹。

ヒトで運動生理学研究を行うことは、実験デザインと^{参加者モニタリングの課題}により、費用と時間がかかる可能性があります3。したがって、実験室環境での動物モデルの使用は、その遺伝的および生理学的均一性のために強く推奨されてきました。さらに、制御された実験室条件下では、動物は通常、座りがちな生活を送り、食物摂取量が規制されています⁴。動物モデルの中で、げっ歯類は身体運動を含む研究で最も広く採用されています¹。しかし、ゼブラフィッシュ(Danio rerio;Hamilton, 1822)は、^{運動研究のための}マウスや他の種を補完するモデルである5,6,7,8。

ゼブラフィッシュの研究では、市販の遊泳トンネルや特注の遊泳トンネルを使用して運動を行うことができます。市販のオプションの中で、Loligo Systemによって開発されたBlazkaタイプのトンネルは、最も頻繁に利用されています^7,9,10。このシステムは、電気モーターに結合されたプロペラを介して強制遊泳を誘発し、トンネル内で連続的な水流を生成します。この遊泳能力は、魚が水流に逆らって泳ぎ、位置を維持するように駆り立てる生来の行動であるレオタキシスの原理に根ざしています¹¹。レオタキシス(Rheotaxis)は、魚が特定の期間に維持できる最大速度を表す臨界遊泳速度(Ucrit)の測定を可能にします。ただし、この機器は、水泳行動と酸素消費量を評価するために価値がありますが、かなりのコスト^{がかかることに注意してください12}。

研究者たちは、ゼブラフィッシュを運動させるための代替装置を開発しており、その多くはブラスカ型のメカニズム10,13,14またはより単純なメカニズム^8,15,16に基づいている。それにもかかわらず、これらの方法は、長期間の延長、多額の機器費用、スループットと精度の制限など、プロトコルの技術的要求によって制約される場合があります。したがって、この研究の主な目的は、容易に入手できる材料を使用して、手頃な価格でユーザーフレンドリーなゼブラフィッシュ運動システムを設計し、魚の運動のための新しい代替装置を提供することでした。副次的な目標は、ゼブラフィッシュに有酸素運動と無酸素運動の両方を実施し、運動研究への介入戦略としてのゼブラフィッシュモデルの利用をさらに進めることでした。

プロトコル

この手続きは、サンパウロ連邦大学の動物使用倫理委員会(CEUA/UNIFESP no. 9206260521)から事前承認を得ています。この研究では、生後6か月、体重2.5〜3gの成体女性の野生型 Danio rerioのみが使用されました。本試験に必要な機器および試薬は、 資料表に記載されています。

1.カスタムメイドゼブラフィッシュ運動器具

注:運動器具は特注でした。詳細については、 図1、 補足表1、 補足ファイル1、 および補足ファイル2を参照してください。

1. 水中ポンプ(N)を水タンク(O)(≥30 L)の中に置きます。水が次の条件を満たしていることを確認してください:pH 7.2 ± 0.5および400 ± 50 μS、28 ± 1°C。
2. 流 動補助表1 及び 図1は、ポイントT字パイプ(B)にパイプ(I)を接続し、Bの側面に細いパイプ(G)を取り付ける。Gからグローブバルブ(F)、次に別のG、パイプエルボー(A)とIの順に接続を確立し、システム内の水圧の調整を担当するセグメントを完成させます。この調整は、水タンク(O)への戻り流によって達成されます。
3. Bの代替セクションで、パイプ(J)にリンクし、続いてAとGに接続します。
4. 魚のエントリーポートをシステムに統合するには、一方の端でBをGに接続し、もう一方の端で別のGを取り付けます。続いて、ソケットパイプフィッティング(C)をこの2番目のGに接続し、遊泳行動を視覚化するために重要なアクリルパイプ(K)に接続するシーケンスを確立します。
   1. Kを水流センサー(M)に接続するには、パイプC、G、およびDを使用しますDを使用してMをGに接続し、次にA、G、およびHを統合して、貯水池への水の戻りを容易にします。
      注意: ゲートとグローブバルブ(F2)の間の短いパイプセグメントに蚊帳を挿入して、魚が装置の他のセクションにアクセスするのを防ぎます。グローブバルブ(F)には2つの目的があります。第1のグローブバルブ(F1)は、装置の残りの部分に入る前にリザーバーに戻る水の流れを制御し、システム圧力制御バルブとして機能します。グローブバルブ(F2)は、システム内のゼブラフィッシュの入口と出口です。
5. アクリルパイプの下流に水流センサーを取り付けます。
   注:フローセンサーはLCDディスプレイに接続し、Arduinoを使用してプログラムする必要があります(図1)。Arduinoのセットアップの詳細については、 補足ファイル2を参照してください。

2. 装置の操作

1. 魚を安全にシステムに導入するには、水の流れを遮断することが不可欠です。これを実現するには、グローブバルブ(F1)を開いたままゲートバルブ(E)を閉じます。その後、システムの入り口となるグローブバルブ(F2)を開き、魚を静かに導入し、すぐにF2バルブを閉じます。最後に、Eバルブを開いて、エクササイズエリアを水で満たします。
2. グローブバルブを使用して流速を制御し、必要に応じて水を貯水池に戻します。
3. ゲートバルブ(F2)を使用して、正確な流量調整と魚のアクセス管理を行います。
4. テストの最後に魚を取り除くには、疲労基準を観察したらバルブ(E)を閉じます。次に、バルブFを開き、アクリルチューブの軸に対して180°回転させます。これにより、疲れ果てた魚を運ぶ水の排水が容易になります。
5. フロー監視を実行します。
   注:Arduino Nano、16 x 2 LCDスクリーン、10 kΩ、0.25 Wのスルーホール抵抗器、および10kΩポテンショメータを組み込んだシステムを介して水の流速を監視する必要があります。フローセンサーは、ホール効果技術¹⁷に基づいて水の流速を連続的に監視します。電流の各パルスはセンサーフロッパーの1回転に対応し、周波数(Hz)は6.6 x Q(L/minの流量)になります。
   1. フローセンサーの適切なワイヤをArduinoNanoの5V、GND、およびD2ピンに接続します(補足表1)。提供されたスケッチ(補足ファイル1)をArduinoIDEを使用してArduinoにロードします。ArduinoUSBポートを介してシステムに電力を供給します。
      注意: 流量測定値は、16 x 2 LCD画面に表示されます。水流センサーのキャリブレーションを 図2に示します。LCDへのArduino接続の概略図を 図3に示します。

3.耐久試験

注:このステップでは、ゼブラフィッシュの最大遊泳速度(Umax)を決定するための耐久テストの手順を概説します。

1. まず、魚が1日60分間、遊泳トンネル内の低水流速度(0.06 m / s)に2週間適応するのを待ちます。
   注:24時間のプレコンディショニング期間の後、個々のゼブラフィッシュは持続的な遊泳パフォーマンステストを受けます。このテストの目的は、各魚のUmaxを確立することです。
2. ゼブラフィッシュを装置に個別に置きます。
3. 試験条件:初速0.06m/sの水流に10分間、魚を逆らわせます。
4. 速度の増分:水の流れを離散的に増加させ、0.02 m / sの速度増分が毎分40〜50分間発生します。
5. Umaxの決定:魚が枯渇基準を満たしたときに、最大遊泳速度(Umax)をレコポッドします。
   注:消耗は、次の状況の最初の状況が観察された場合に定義されます:(1)水流に対して3回以上位置を維持できない、または(2)5秒を超えてその位置を維持できない。
6. 消耗基準を観察したら、バルブ(E)を閉じます。次に、バルブFを開き、アクリルチューブの軸に対して180°回転させます。これにより、疲れ果てた魚を運ぶ水の排水が容易になります。

4. エクササイズグループと手順

注:明確な運動プロトコルを確立するには、高強度の運動を受けなくても、運動プロトコルの効果を比較するために、同一の実験条件にさらされた座りがちなグループを含めることが不可欠です。また、運動プロトコルの強度を決定するためにUmax値の分数が必要であるため、Umaxを確立することも不可欠です。

1. 座りがち(SED)グループ:魚を0.06 m / sの水流に逆らって60分間強制的に泳がせます。
   注:装置は連続的な水流を生成し、レオタキシス¹¹の原理に基づいて魚にこの流れに逆らって泳ぐように強制します。
2. 中強度連続トレーニング (MICT) グループ: 最大容量テストで決定された Umax の 60% の水流に逆らって、魚を 35 分間強制的に泳がせます。
   注:このプロトコルは、Húngaro et ^al.18から採用されました。最初の10分間、魚は座りがちなグループと同じ速度(0.05 m / s)に順応しました。
3. 高強度インターバルトレーニング(HIIT)グループ:魚を交互に遊泳速度で強制水泳させます:Umaxの90%で2分、続いてUmaxの30%で2分、18分間(9サイクル)繰り返します。このプロトコルは、Marcinko et ^al.19 から採用されました。
   注:運動期間の最初の10分間は、魚を座りがちなグループと同じ速度(0.06 m / s)に順応させる必要があります。
4. すべての運動プロトコルを週5日、4週間にわたって実施します。
   注:魚は適切な条件を提供する水槽に収容されるべきであり、指定された運動期間中にのみ運動装置に導入されるべきです。魚には熱帯魚のフレーク状の餌を1日3回提供し、維持水槽の水は2日ごとに部分的に交換する必要があります。
5. 毎週末に持久力テストを繰り返し、疲労点でのレイテンシと速度のデータをフィジカルコンディショニングパラメータの指標として使用します。
6. オーバートレーニング効果を誘発するには、トレーニングの各4日間のサイクル後に実施される耐久テストの結果に基づいて、毎週水流速度を上げます。トレーニング時間は、移動距離(速度×時間)を考慮して調整する必要があり、これらの時間はエクササイズしたグループ間で一貫している必要があります。
7. 水流の増加に応じて遊泳時間を調整し、運動グループ全体でトレーニング負荷を標準化します。

5. 身体測定

1. 体測定(重量とサイズ)²⁰を行うための浸漬により、0.0075%トリカイン(w / v)で魚を麻酔します。
2. ImageJソフトウェアを使用して魚を撮影し、体重を量り、体の寸法を決定します。
3. データをBody Condition Indices(体重[g]/標準長さ[mm]2;BMI)とボディコンディションスコアリング(BCS)²⁰。
4. 卵の形成によって引き起こされるサイズと重量の変動を排除するために、魚を標準的な繁殖²⁰にかけ、続いて測定と計量を行います。

結果

運動器具は、流速の調整において顕著な効率を示しました。遊泳速度を徐々に向上させるため、SEDグループを除くすべてのグループで水量を毎週段階的に増加させ、SEDグループでは0.06m/sの一定の流速を維持しました。特に、この装置は驚くべきレベルの精度を可能にし、0.001m/sの微細な流速調整を達成しました。しかし、0.06 m/sなどの低速では誤差率は30%でした。0.3 ...

ディスカッション

この研究では、ゼブラフィッシュの遊泳性能を包括的に検討するために、Loligo Systems²¹ の遊泳トンネル呼吸計と水路システム²² に触発されて、革新的で費用対効果の高い運動システムが開発されました。Umaxは、魚が枯渇するまで短い間隔(20〜30分)で速度の増加を伴い、離散的な段階で水の流れを体系的に増加させることによって決...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
CPVC Female 90-Degree Elbow for Plumbing	Tigre	22150260	3/4-inch
24AWG Wire	Sky Cablo Store		Connection between components in the Perforated Circuit Board (1m)
Acrylic pipe	The Clear Plastic Shop	41138408	3/4-inch
Aquarium Submersible Fish Tank	Aqua Tank		300w
CPVC Pipe	Tigre	10121787	3/4-inch
Female Threaded Gate Water Valve	Tigre	27950310	3/4-inch
Female Threaded Globe Water Valve	Tigre	27940510	3/4-inch
hrough-hole resistor	BXV		10 kΩ, 0.25W t
Lab Support Stand With Clamp with 30 inch rod	Masiye Labs	RSC0001	Support the horizontal pipes
LCD screen	Eichip		16 x 2, model JHD162A
Male x Male Dupont Jumpers	Chyan		Connection between arduino and flow sensor (30 cm)
Perforated Circuit Board single sided	KY WIN ROBOT		5 x 10 cm
Potentiometer	LUSYA	DL-ALPSA01	10kΩ
Roll of Water Blocking Tape	One World	5603131000	To avoid leaks
Silicone hose	Tigre	14211250	2 cm inner
Solder Station	QHTITEC	EU/US PLUG	Arduine system welding
Solder Wire Spool	BEEYIHF	I001-A001-Set	Arduine system welding
Threaded Male Socket and Unthreaded Female Socket CPVC Pipe Fitting	TIgre	35447849	3/4-inch
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich	E10521	Anesthetic
UNO-R3 board UNO R3 CH340G+MEGA328P Chip 16Mhz	FSXSEMI		For Arduino UNO R3 Development board
Unthreaded CPVC Tee Pipe Fitting, Female	Tigre	22200267	3/4-inch
Unthreaded Female CPVC Socket Pipe Fitting	Tigre	22170260	3/4-inch
Water Flow Sensor  model YF-B5	Siqma Robotics	SQ8659	1-25 L/min
Water Pump	Sunsun		Model HJ-2041, 3000L/h, 65W
Water reservoir	Custom		30 L