Um aparelho de exercícios de peixe-zebra induzido por natação para abordagens de treinamento versáteis

Resumo

O aparelho de exercícios projetado para peixes menos afortunados facilita a implementação de diversos protocolos de exercícios com intensidades variadas, manipulando a velocidade do fluxo de água, alcançável por meio da reotaxia.

Resumo

Para investigar de forma abrangente os efeitos do exercício na saúde e na doença, os modelos animais desempenham um papel fundamental. O peixe-zebra, um organismo modelo de vertebrado amplamente utilizado, oferece uma plataforma única para tais estudos. Este estudo introduziu o desenvolvimento de um aparelho econômico adaptado para estudos de exercícios de peixe-zebra utilizando materiais prontamente disponíveis. O dispositivo é baseado nos princípios de um túnel de natação e engloba uma rede de tubos e válvulas ligados a uma bomba submersível. O fluxo de água é meticulosamente monitorado por um sensor e regulado por válvulas . Para avaliar a eficácia do aparelho, foram implementados dois protocolos de treinamento: treinamento contínuo de intensidade moderada (MICT) e treinamento intervalado de alta intensidade (HIIT). Os peixes foram treinados coletivamente e seu desempenho na natação foi avaliado por meio de um teste de resistência. Ambos os protocolos de treinamento levaram a melhorias no desempenho da natação após 30 dias de treinamento e induziram alterações na resposta molecular ao exercício em comparação com um grupo controle sedentário. Notavelmente, o HIIT demonstrou eficiência superior em relação ao MICT. O sistema de treinamento do peixe-zebra provou ser uma ferramenta valiosa para investigações em fisiologia do exercício e avança ainda mais a utilidade do modelo do peixe-zebra neste campo.

Introdução

O exercício físico engloba qualquer movimento corporal realizado pelos músculos esqueléticos que resulte em aumento do gasto energético, sendo o exercício um subconjunto estruturado e repetitivo das atividades físicas¹. O exercício, uma atividade multifatorial e econômica que envolve todo o corpo, traz inúmeros benefícios à saúde, como a prevenção da síndrome metabólica e da sarcopenia². Consequentemente, o campo da fisiologia do exercício tem um interesse significativo, pois busca elucidar como o corpo se adapta ao estresse agudo do exercício, ao estresse crônico do treinamento físico e ao impacto geral do exercício na saúde¹.

A realização de estudos de fisiologia do exercício em humanos pode ser cara e demorada devido a desafios no projeto experimental e no monitoramento dos participantes³. Portanto, o uso de modelos animais em ambientes laboratoriais tem sido altamente recomendado devido à sua uniformidade genética e fisiológica. Além disso, em condições controladas de laboratório, os animais geralmente têm estilos de vida sedentários e ingestão regular^{de alimentos 4}. Dentre os modelos animais, os roedores têm sido os mais empregados em pesquisas envolvendo exercício físico¹. No entanto, o peixe-zebra (Danio rerio; Hamilton, 1822) é um modelo complementar aos murinos e outras espécies para estudos de exercício 5,6,7,8.

Na pesquisa com peixe-zebra, o exercício físico pode ser realizado usando túneis de natação disponíveis comercialmente ou personalizados. Dentre as opções disponíveis comercialmente, o túnel do tipo Blazka, desenvolvido pelo Sistema Loligo, é o mais utilizado ^7,9,10. Este sistema induz a natação forçada através de uma hélice acoplada a um motor elétrico, gerando um fluxo contínuo de água dentro do túnel. Essa capacidade de natação está enraizada no princípio da reotaxia, um comportamento inato nos peixes que os leva a nadar contra as correntes de água e manter sua posição¹¹. A reotaxia permite a medição da velocidade crítica de natação (Ucrit), representando a velocidade máxima que um peixe pode sustentar por um período específico. No entanto, vale ressaltar que esse equipamento, embora valioso para avaliar o comportamento de natação e o consumo de oxigênio, tem um custo significativo¹².

Os pesquisadores desenvolveram aparelhos alternativos para o exercício do peixe-zebra, muitas vezes baseados no mecanismo do tipo Blazka^10,13,14 ou mecanismos mais simples ^8,15,16. No entanto, esses métodos podem ser limitados pelas demandas técnicas do protocolo, incluindo durações prolongadas, despesas substanciais com equipamentos e limitações de rendimento e precisão. Consequentemente, o objetivo principal do estudo foi projetar um sistema de exercícios de peixe-zebra acessível e fácil de usar, usando materiais prontamente disponíveis, fornecendo um novo aparelho alternativo para exercícios físicos em peixes. Um objetivo secundário era implementar regimes de exercícios aeróbicos e anaeróbicos em peixe-zebra, avançando ainda mais na utilização do modelo de peixe-zebra como estratégia de intervenção na pesquisa de exercícios.

Protocolo

Os procedimentos receberam aprovação prévia do Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal de São Paulo (CEUA/UNIFESP nº 9206260521). Apenas fêmeas adultas de Danio rerio selvagem, com 6 meses de idade e peso de 2,5 a 3 g, foram empregadas neste estudo. O equipamento e os reagentes necessários para o estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Aparelho de exercício de peixe-zebra feito sob medida

NOTA: O aparelho de exercícios foi feito sob medida. Para obter detalhes, consulte a Figura 1, a Tabela Suplementar 1, o Arquivo Suplementar 1 e o Arquivo Suplementar 2.

1. Coloque uma bomba submersível (N) dentro de um tanque de água (O) (≥30 L). Certifique-se de que a água atende às seguintes condições: pH de 7,2 ± 0,5 e 400 ± 50 μS, 28 ± 1 °C.
2. Fluxo Suplementar Tabela 1 e Figura 1, conecte o Tubo (I) ao ponto do Tubo em T (B) e conecte um pequeno tubo (G) ao lado de B. A partir de G, estabelecer conexões com a Válvula Globo (F), depois com outra G, e em sequência com o Cotovelo do Tubo (A) e I, completando assim o segmento responsável pela regulação da pressão da água dentro do sistema. Esta regulação é conseguida através de um fluxo de retorno para o tanque de água (O).
3. Na seção alternativa de B, conecte-o a um tubo (J), seguido de conexões a A e G. Utilize o encaixe do tubo de soquete (D) para conectar a válvula de água do portão (E) a G.
4. Integre uma porta de entrada de peixes no sistema conectando B a G em uma extremidade e anexando outro G na extremidade oposta. Em seguida, conecte o encaixe do soquete (C) a este segundo G, estabelecendo uma sequência que se conecta ao tubo de acrílico (K), que é crucial para visualizar o comportamento da natação.
   1. Para ligar K ao Sensor de Fluxo de Água (M), utilize os tubos C, G e D. Prossiga para conectar M a G usando D e, em seguida, integre A, G e H para facilitar o retorno da água ao reservatório.
      NOTA: Insira uma tela mosquiteira no segmento do tubo curto entre a comporta e a válvula globo (F2) para evitar que os peixes acessem outras seções do aparelho. A válvula globo (F) tem um duplo propósito. A primeira válvula globo (F1) controla o fluxo de água que retorna ao reservatório antes de entrar no restante do aparelho, atuando como uma válvula de controle de pressão do sistema. A válvula globo (F2) é um ponto de entrada e saída para o peixe-zebra dentro do sistema.
5. Conecte um sensor de fluxo de água a jusante do tubo de acrílico.
   NOTA: O sensor de fluxo deve ser conectado a um display LCD e programado usando um Arduino (Figura 1). Os detalhes da configuração do Arduino são fornecidos no Arquivo Suplementar 2.

2. Operação do aparelho

1. Para introduzir os peixes com segurança no sistema, é essencial interromper o fluxo de água. Para conseguir isso, feche a válvula gaveta (E) enquanto mantém a válvula globo (F1) aberta. Em seguida, abra a válvula globo (F2), que serve como entrada para o sistema, introduza suavemente os peixes e feche imediatamente a válvula F2. Por fim, abra a válvula E para encher a área de exercícios com água.
2. Use a válvula globo para controlar a velocidade do fluxo, desviando a água de volta para o reservatório quando necessário.
3. Utilize a válvula gaveta (F2) para ajuste preciso do fluxo e para gerenciar o acesso dos peixes.
4. Para retirar o peixe no final do ensaio, fechar a válvula (E) após observar os critérios de esgotamento. Em seguida, abra a válvula F e gire-a 180° em relação ao eixo do tubo de acrílico; Isso facilitará a drenagem da água que carrega os peixes exaustos junto com ela.
5. Execute o monitoramento de fluxo.
   NOTA: É necessário monitorar a velocidade do fluxo de água através de um sistema que incorpore um Arduino Nano, uma tela LCD de 16 x 2, um resistor de 10 kΩ, 0.25 W e um potenciômetro de 10 kΩ. O sensor de fluxo monitora continuamente a velocidade do fluxo de água com base na tecnologia Hall Effect¹⁷. Cada pulso de corrente corresponde a uma revolução do flopper do sensor, resultando em uma frequência (Hz) de 6,6 x Q (vazão em L/min).
   1. Conecte os fios apropriados do sensor de fluxo aos pinos de 5 V, GND e D2 do Arduino Nano (Tabela Suplementar 1). Carregue o esboço fornecido (Supplemental File 1) no Arduino usando o Arduino IDE. Ligue o sistema através da porta USB do Arduino.
      NOTA: As medições de vazão são exibidas na tela LCD de 16 x 2. A calibração do sensor de fluxo de água é mostrada na Figura 2. Os esquemas das conexões do Arduino com o LCD são ilustrados na Figura 3.

3. Teste de resistência

NOTA: Esta etapa descreve o procedimento para o teste de resistência para determinar a velocidade máxima de natação (Umax) do peixe-zebra.

1. Primeiro, permita que os peixes se adaptem por 60 minutos por dia a uma baixa velocidade de fluxo de água (0,06 m/s) dentro do túnel de natação por duas semanas.
   NOTA: Após um período de pré-condicionamento de 24 horas, o peixe-zebra individual será submetido ao teste de desempenho de natação sustentada. O objectivo deste ensaio é estabelecer o Umax de cada peixe.
2. Coloque o peixe-zebra individualmente no aparelho.
3. Condições de teste: Posicione o peixe contra um fluxo de água com uma velocidade inicial de 0,06 m/s por 10 min.
4. Incrementos de velocidade: Aumente o fluxo de água em estágios discretos, com incrementos de velocidade de 0,02 m/s ocorrendo a cada minuto por 40-50 min.
5. Determinação Umax: Registar a velocidade máxima de natação (Umax) quando os peixes satisfizerem os critérios de exaustão.
   NOTA: A exaustão é definida quando a primeira das seguintes situações é observada: (1) Incapacidade de manter sua posição contra o fluxo de água por mais de três instâncias, ou (2) Incapacidade de sustentar sua posição por mais de 5 s.
6. Feche a válvula (E) observando os critérios de exaustão. Em seguida, abra a válvula F e gire-a 180° em relação ao eixo do tubo de acrílico. Isso facilitará o escoamento da água, carregando os peixes exaustos.

4. Grupos de exercícios e procedimento

NOTA: Para estabelecer protocolos de exercícios distintos, é essencial incluir um grupo sedentário exposto a condições experimentais idênticas para comparar os efeitos dos protocolos de exercícios, embora sem realizar exercícios de alta intensidade. Também é essencial estabelecer o Umax porque as frações do valor do Umax são necessárias para determinar a intensidade dos protocolos de exercício.

1. Grupo sedentário (SED): Submeter os peixes a nadar forçadamente contra o fluxo de água a 0,06 m/s por 60 min.
   NOTA: O aparelho gera um fluxo contínuo de água, obrigando os peixes a nadar contra essa corrente com base no princípio da reotaxia¹¹.
2. Grupo Treinamento Contínuo de Intensidade Moderada (MICT): Submeter os peixes a nado forçado contra o fluxo de água a 60% do Umax, conforme determinado no teste de capacidade máxima, por 35 min.
   NOTA: Este protocolo foi adaptado de Húngaro et ^al.18. Durante os primeiros 10 min, os peixes foram aclimatados à mesma velocidade do grupo sedentário (0,05 m/s).
3. Grupo de Treinamento Intervalado de Alta Intensidade (HIIT): Sujeitar os peixes a natação forçada alternando as velocidades de natação: 2 min a 90% do Umax seguido de 2 min a 30% do Umax, repetido por 18 min (9 ciclos). Esse protocolo foi adaptado de Marcinko et ^al.19.
   NOTA: Durante os primeiros 10 min do período de exercício, é necessário aclimatar os peixes à mesma velocidade do grupo sedentário (0,06 m/s).
4. Implemente todos os protocolos de exercícios por 5 dias por semana durante um período de quatro semanas.
   NOTA: Os peixes devem ser alojados em aquários que ofereçam condições adequadas e só devem ser introduzidos no aparelho de exercício durante os períodos de exercício designados. Os peixes devem receber alimentos em flocos de peixes tropicais três vezes ao dia, e a água nos aquários de manutenção deve sofrer uma troca parcial a cada 2 dias.
5. Repita o teste de resistência no final de cada semana, com dados de latência e velocidade no ponto de fadiga como indicadores de parâmetros de condicionamento físico.
6. Para induzir efeitos de overtraining, aumente a velocidade do fluxo de água semanalmente com base nos resultados do teste de resistência realizado após cada ciclo de treinamento de 4 dias. As durações de treinamento devem ser ajustadas para levar em conta a distância percorrida (velocidade × tempo), e essas durações devem permanecer consistentes entre os grupos exercitados.
7. Ajuste o tempo de natação em resposta ao aumento do fluxo de água, padronizando assim a carga de treinamento entre os grupos exercitados.

5. Medidas corporais

1. Anestesiar os peixes com tricaína 0,0075% (p/v) por imersão para a realização de medidas corporais (peso e tamanho)²⁰.
2. Fotografe e pese os peixes para determinar as dimensões do corpo usando o software ImageJ.
3. Expresse os dados em termos de Índices de Condição Corporal (peso [g]/comprimento padrão [mm]2; IMC) e Escore de Condição Corporal (ECC)²⁰.
4. Para eliminar as variações de tamanho e peso causadas pela formação de ovos, submeter os peixes à criação padrão²⁰, seguida de medições e pesagem.

Resultados

O aparelho de exercício demonstrou notável eficiência na regulação da velocidade do fluxo. Para aumentar gradualmente a velocidade de natação, o fluxo de água foi aumentado semanalmente para todos os grupos, exceto para o grupo SED, que foi mantido a uma velocidade de fluxo constante de 0,06 m/s. Notavelmente, o aparelho permitiu um nível notável de precisão, alcançando ajustes de velocidade de fluxo tão finos quanto 0,001 m/s. No entanto, a taxa de erro foi de 30% em baixas...

Discussão

Neste estudo, foi desenvolvido um sistema de exercícios inovador e econômico inspirado no respirômetro de túnel de natação da Loligo Systems²¹ e no sistema de calha²² para o exame abrangente do desempenho de natação do peixe-zebra. O Umax foi determinado pelo aumento sistemático do fluxo de água em estágios discretos, com incrementos de velocidade ocorrendo em intervalos curtos (20-30 min) até que os peixes atingissem a exaustã...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
CPVC Female 90-Degree Elbow for Plumbing	Tigre	22150260	3/4-inch
24AWG Wire	Sky Cablo Store		Connection between components in the Perforated Circuit Board (1m)
Acrylic pipe	The Clear Plastic Shop	41138408	3/4-inch
Aquarium Submersible Fish Tank	Aqua Tank		300w
CPVC Pipe	Tigre	10121787	3/4-inch
Female Threaded Gate Water Valve	Tigre	27950310	3/4-inch
Female Threaded Globe Water Valve	Tigre	27940510	3/4-inch
hrough-hole resistor	BXV		10 kΩ, 0.25W t
Lab Support Stand With Clamp with 30 inch rod	Masiye Labs	RSC0001	Support the horizontal pipes
LCD screen	Eichip		16 x 2, model JHD162A
Male x Male Dupont Jumpers	Chyan		Connection between arduino and flow sensor (30 cm)
Perforated Circuit Board single sided	KY WIN ROBOT		5 x 10 cm
Potentiometer	LUSYA	DL-ALPSA01	10kΩ
Roll of Water Blocking Tape	One World	5603131000	To avoid leaks
Silicone hose	Tigre	14211250	2 cm inner
Solder Station	QHTITEC	EU/US PLUG	Arduine system welding
Solder Wire Spool	BEEYIHF	I001-A001-Set	Arduine system welding
Threaded Male Socket and Unthreaded Female Socket CPVC Pipe Fitting	TIgre	35447849	3/4-inch
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich	E10521	Anesthetic
UNO-R3 board UNO R3 CH340G+MEGA328P Chip 16Mhz	FSXSEMI		For Arduino UNO R3 Development board
Unthreaded CPVC Tee Pipe Fitting, Female	Tigre	22200267	3/4-inch
Unthreaded Female CPVC Socket Pipe Fitting	Tigre	22170260	3/4-inch
Water Flow Sensor  model YF-B5	Siqma Robotics	SQ8659	1-25 L/min
Water Pump	Sunsun		Model HJ-2041, 3000L/h, 65W
Water reservoir	Custom		30 L