Ein schwimminduziertes Zebrafisch-Übungsgerät für vielseitige Trainingsansätze

Zusammenfassung

Das Übungsgerät, das für weniger glückliche Fische entwickelt wurde, erleichtert die Umsetzung verschiedener Übungsprotokolle mit unterschiedlichen Intensitäten, indem es die Wasserströmungsgeschwindigkeit manipuliert, die durch Rheotaxis erreicht werden kann.

Zusammenfassung

Um die Auswirkungen von Bewegung auf Gesundheit und Krankheit umfassend zu untersuchen, spielen Tiermodelle eine zentrale Rolle. Der Zebrafisch, ein weit verbreiteter Modellorganismus für Wirbeltiere, bietet eine einzigartige Plattform für solche Studien. Diese Studie führte zur Entwicklung eines kostengünstigen Geräts, das auf Zebrafisch-Übungsstudien zugeschnitten ist und leicht verfügbare Materialien verwendet. Das Gerät basiert auf den Prinzipien eines Schwimmtunnels und umfasst ein Netzwerk von Rohren und Ventilen, die mit einer Tauchpumpe verbunden sind. Der Wasserfluss wird durch einen Sensor akribisch überwacht und über Ventile geregelt. Um die Wirksamkeit des Geräts zu beurteilen, wurden zwei Trainingsprotokolle implementiert: kontinuierliches Training mit mittlerer Intensität (MICT) und hochintensives Intervalltraining (HIIT). Die Fische wurden kollektiv trainiert und ihre Schwimmleistung durch einen Härtetest bewertet. Beide Trainingsprotokolle führten zu einer Verbesserung der Schwimmleistung nach 30 Tagen Training und induzierten Veränderungen in der molekularen Reaktion auf Bewegung im Vergleich zu einer sitzenden Kontrollgruppe. Bemerkenswert ist, dass HIIT eine überlegene Effizienz gegenüber MICT zeigte. Das Zebrafisch-Trainingssystem erwies sich als wertvolles Werkzeug für Untersuchungen in der Bewegungsphysiologie und fördert den Nutzen des Zebrafischmodells in diesem Bereich weiter.

Einleitung

Körperliche Bewegung umfasst alle körperlichen Bewegungen, die von der Skelettmuskulatur ausgeführt werden und zu einem erhöhten Energieverbrauch führen, wobei Bewegung eine strukturierte und sich wiederholende Untergruppe körperlicher Aktivitäten ist¹. Bewegung, eine multifaktorielle und kostengünstige Aktivität, die den gesamten Körper einbezieht, bringt zahlreiche gesundheitliche Vorteile mit sich, wie z. B. die Vorbeugung des metabolischen Syndroms und der Sarkopenie². Folglich ist das Gebiet der Bewegungsphysiologie von großem Interesse, da es zu klären versucht, wie sich der Körper an den akuten Stress des Trainings, den chronischen Stress des körperlichen Trainings und die allgemeinen Auswirkungen des Trainings auf die Gesundheit anpasst¹.

Die Durchführung von trainingsphysiologischen Studien am Menschen kann aufgrund von Herausforderungen bei der Versuchsplanung und der Teilnehmerüberwachung sowohl teuer als auch zeitaufwändig sein³. Daher wurde der Einsatz von Tiermodellen in Laborumgebungen aufgrund ihrer genetischen und physiologischen Einheitlichkeit dringend empfohlen. Darüber hinaus haben die Tiere unter kontrollierten Laborbedingungen in der Regel eine sitzende Lebensweise und eine regulierte Nahrungsaufnahme⁴. Unter den Tiermodellen wurden Nagetiere am häufigsten in der Forschung eingesetzt, bei der es um körperliche Bewegung ging¹. Der Zebrafisch (Danio rerio; Hamilton, 1822) ist ein komplementäres Modell zu Maus und anderen Spezies für Bewegungsstudien 5,6,7,8.

In der Zebrafischforschung kann körperliche Bewegung mit kommerziell erhältlichen oder speziell angefertigten Schwimmtunneln durchgeführt werden. Unter den kommerziell erhältlichen Optionen ist der Blazka-Tunnel, der vom Loligo-System entwickelt wurde, der am^{häufigsten verwendete 7,9,10}. Dieses System induziert ein erzwungenes Schwimmen durch einen Propeller, der mit einem Elektromotor gekoppelt ist, wodurch ein kontinuierlicher Wasserfluss innerhalb des Tunnels erzeugt wird. Diese Schwimmfähigkeit wurzelt im Prinzip der Rheotaxis, einem angeborenen Verhalten von Fischen, das sie dazu bringt, gegen Wasserströmungen zu schwimmen und ihre Position zu halten¹¹. Die Rheotaxis ermöglicht die Messung der kritischen Schwimmgeschwindigkeit (Ucrit), die die maximale Geschwindigkeit darstellt, die ein Fisch für eine bestimmte Dauer aufrechterhalten kann. Es ist jedoch erwähnenswert, dass diese Ausrüstung zwar wertvoll für die Beurteilung des Schwimmverhaltens und des Sauerstoffverbrauchs ist, aber mit erheblichen Kosten verbunden^{ist 12}.

Forscher haben alternative Geräte für das Training von Zebrafischen entwickelt, die oft auf dem Blazka-Mechanismus^10,13,14 oder einfacheren Mechanismen ^8,15,16 basieren. Nichtsdestotrotz können diese Methoden durch die technischen Anforderungen des Protokolls eingeschränkt sein, einschließlich längerer Dauer, erheblicher Ausrüstungskosten und Einschränkungen bei Durchsatz und Präzision. Folglich bestand das Hauptziel der Studie darin, ein erschwingliches und benutzerfreundliches Zebrafisch-Übungssystem unter Verwendung leicht verfügbarer Materialien zu entwickeln, das ein neues alternatives Gerät für die körperliche Bewegung bei Fischen bietet. Ein sekundäres Ziel war es, sowohl aerobe als auch anaerobe Trainingsprogramme im Zebrafisch zu implementieren und so die Nutzung des Zebrafischmodells als Interventionsstrategie in der Bewegungsforschung weiter voranzutreiben.

Protokoll

Die Verfahren wurden zuvor von der Ethikkommission für die Verwendung von Tieren der Bundesuniversität von São Paulo (CEUA/UNIFESP Nr. 9206260521) genehmigt. In dieser Studie wurde nur ein adultes Weibchen des Wildtyps Danio rerio im Alter von 6 Monaten und einem Gewicht von 2,5-3 g eingesetzt. Die für die Studie benötigten Geräte und Reagenzien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Maßgeschneidertes Zebrafisch-Übungsgerät

HINWEIS: Das Trainingsgerät wurde speziell angefertigt. Weitere Informationen finden Sie in Abbildung 1, Ergänzende Tabelle 1, Ergänzende Akte 1 und Ergänzende Akte 2.

1. Stellen Sie eine Tauchpumpe (N) in einen Wassertank (O) (≥30 L). Stellen Sie sicher, dass das Wasser die folgenden Bedingungen erfüllt: pH-Wert von 7,2 ± 0,5 und 400 ± 50 μS, 28 ± 1 °C.
2. Verbinden Sie in der fließenden ergänzenden Tabelle 1 und Abbildung 1 das Rohr (I) mit dem Punkt-T-Rohr (B), und befestigen Sie ein kleines Rohr (G) an der Seite von B. Stellen Sie von G aus Verbindungen zum Absperrventil (F), dann zu einem anderen G und in der Folge zu Rohrbogen (A) und I her, wodurch das Segment vervollständigt wird, das für die Regulierung des Wasserdrucks innerhalb des Systems verantwortlich ist. Diese Regelung wird durch einen Rücklauf in den Wassertank (O) erreicht.
3. Verbinden Sie es im alternativen Abschnitt von B mit einem Rohr (J), gefolgt von den Verbindungen zu A und G. Verwenden Sie die Muffenrohrverschraubung (D), um das Absperrventil (E) mit G zu verbinden.
4. Integrieren Sie eine Fischeintrittsöffnung in das System, indem Sie B an einem Ende mit G verbinden und am gegenüberliegenden Ende ein weiteres G anbringen. Verbinden Sie anschließend das Muffenrohrfitting (C) mit diesem zweiten G und etablieren Sie eine Sequenz, die mit dem Acrylrohr (K) verbunden ist, das für die Visualisierung des Schwimmverhaltens entscheidend ist.
   1. Um K mit dem Wasserdurchflusssensor (M) zu verbinden, verwenden Sie die Rohre C, G und D. Fahren Sie fort, M mit D mit G zu verbinden, und integrieren Sie dann A, G und H, um den Rückfluss des Wassers in den Behälter zu erleichtern.
      HINWEIS: Setzen Sie ein Moskitonetz in das kurze Rohrsegment zwischen dem Absperr- und dem Absperrventil (F2) ein, um zu verhindern, dass Fische auf andere Teile des Geräts gelangen. Das Absperrventil (F) erfüllt einen doppelten Zweck. Das erste Absperrventil (F1) steuert den Wasserfluss, der in das Reservoir zurückkehrt, bevor es in den Rest des Geräts eintritt, und fungiert als Systemdruckregelventil. Das Absperrventil (F2) ist ein Ein- und Ausstiegspunkt für den Zebrafisch innerhalb des Systems.
5. Bringen Sie einen Wasserdurchflusssensor hinter dem Acrylrohr an.
   HINWEIS: Der Durchflusssensor sollte an ein LCD-Display angeschlossen und mit einem Arduino programmiert werden (Abbildung 1). Details zum Arduino-Setup finden Sie in der Zusatzdatei 2.

2. Bedienung des Geräts

1. Um den Fisch sicher in das System einzuführen, ist es unerlässlich, den Wasserfluss zu unterbrechen. Um dies zu erreichen, schließen Sie den Absperrschieber (E) bei geöffnetem Absperrventil (F1). Öffnen Sie anschließend das Absperrventil (F2), das als Eingang zum System dient, führen Sie den Fisch vorsichtig ein und schließen Sie umgehend das F2-Ventil. Öffnen Sie abschließend das E-Ventil, um den Trainingsbereich mit Wasser zu füllen.
2. Verwenden Sie das Absperrventil, um die Durchflussgeschwindigkeit zu steuern und bei Bedarf Wasser in den Behälter umzuleiten.
3. Verwenden Sie den Absperrschieber (F2) für eine präzise Durchflusseinstellung und zur Steuerung des Fischzugangs.
4. Um den Fisch am Ende des Tests zu entfernen, schließen Sie das Ventil (E) unter Einhaltung der Erschöpfungskriterien. Öffnen Sie dann das Ventil F und drehen Sie es um 180° relativ zur Achse des Acrylrohrs; Dies erleichtert das Abfließen des Wassers, das den erschöpften Fisch mit sich reißt.
5. Führen Sie die Durchflussüberwachung durch.
   HINWEIS: Es ist notwendig, die Wasserdurchflussgeschwindigkeit durch ein System zu überwachen, das einen Arduino Nano, einen 16 x 2 LCD-Bildschirm, einen 10 kΩ, 0,25 W Durchsteckwiderstand und ein 10 kΩ Potentiometer enthält. Der Durchflusssensor überwacht kontinuierlich die Strömungsgeschwindigkeit des Wassers auf Basis der Hall-Effekt-Technologie¹⁷. Jeder Stromimpuls entspricht einer Umdrehung des Sensorfloppers, woraus sich eine Frequenz (Hz) von 6,6 x Q (Durchfluss in L/min) ergibt.
   1. Verbinden Sie die entsprechenden Drähte des Durchflusssensors mit den 5-V-, GND- und D2-Pins des Arduino Nano (Ergänzende Tabelle 1). Laden Sie den bereitgestellten Sketch (Supplemental File 1) mit der Arduino IDE in den Arduino. Versorgen Sie das System über den Arduino-USB-Anschluss mit Strom.
      HINWEIS: Die Durchflussmessungen werden auf dem 16 x 2 LCD-Bildschirm angezeigt. Die Kalibrierung des Wasserdurchflusssensors ist in Abbildung 2 dargestellt. Die Schaltpläne der Arduino-Verbindungen zum LCD sind in Abbildung 3 dargestellt.

3. Härtetest

HINWEIS: In diesem Schritt wird das Verfahren für den Dauertest zur Bestimmung der maximalen Schwimmgeschwindigkeit (Umax) von Zebrafischen beschrieben.

1. Lassen Sie die Fische zunächst 60 Minuten pro Tag lang 60 Minuten pro Tag an eine niedrige Wasserströmungsgeschwindigkeit (0,06 m/s) im Schwimmtunnel gewöhnen.
   HINWEIS: Nach einer 24-stündigen Vorkonditionierungsphase werden die einzelnen Zebrafische dem nachhaltigen Schwimmleistungstest unterzogen. Der Zweck dieses Tests besteht darin, den Umax jedes Fisches zu bestimmen.
2. Setzen Sie den Zebrafisch einzeln in das Gerät ein.
3. Testbedingungen: Positionieren Sie den Fisch 10 Minuten lang gegen eine Wasserströmung mit einer Anfangsgeschwindigkeit von 0,06 m/s.
4. Geschwindigkeitsschritte: Erhöhen Sie den Wasserfluss in diskreten Stufen, wobei Geschwindigkeitsschritte von 0,02 m/s pro Minute für 40-50 Minuten auftreten.
5. Umax-Bestimmung: Ermitteln Sie die maximale Schwimmgeschwindigkeit (Umax), wenn die Fische die Erschöpfungskriterien erfüllen.
   HINWEIS: Erschöpfung liegt vor, wenn die erste der folgenden Situationen beobachtet wird: (1) Unfähigkeit, seine Position gegen die Wasserströmung für mehr als drei Fälle zu halten, oder (2) Unfähigkeit, seine Position länger als 5 s zu halten.
6. Schließen Sie das Ventil (E), wenn die Erschöpfungskriterien eingehalten werden. Öffnen Sie dann das Ventil F und drehen Sie es um 180° relativ zur Achse des Acrylrohrs. Dies erleichtert das Abfließen des Wassers und trägt den erschöpften Fisch.

4. Übungsgruppen und Ablauf

HINWEIS: Um unterschiedliche Trainingsprotokolle zu erstellen, ist es wichtig, eine sitzende Gruppe einzubeziehen, die identischen Versuchsbedingungen ausgesetzt ist, um die Auswirkungen von Trainingsprotokollen zu vergleichen, wenn auch ohne hochintensives Training. Es ist auch wichtig, den Umax zu ermitteln, da die Bruchteile des Umax-Wertes notwendig sind, um die Intensität von Trainingsprotokollen zu bestimmen.

1. Sitzende (SED) Gruppe: Setzen Sie den Fisch 60 Minuten lang einem erzwungenen Schwimmen gegen die Wasserströmung mit 0,06 m/s aus.
   HINWEIS: Das Gerät erzeugt eine kontinuierliche Wasserströmung, die den Fisch zwingt, gegen diese Strömung zu schwimmen, basierend auf dem Prinzip der Rheotaxis¹¹.
2. MICT-Gruppe (Moderates Intensitäts-Continuous-Training): Den Fisch 35 Minuten lang bei 60 % des Umax, wie im Test der maximalen Kapazität bestimmt, erzwungenem Schwimmen gegen die Wasserströmung aussetzen.
   HINWEIS: Dieses Protokoll wurde von Húngaro et ^al.18 übernommen. Während der ersten 10 min wurde der Fisch auf die gleiche Geschwindigkeit wie die sitzende Gruppe (0,05 m/s) akklimatisiert.
3. HIIT-Gruppe (High-Intensity Interval Training): Setzen Sie die Fische einem erzwungenen Schwimmen aus, wobei die Schwimmgeschwindigkeiten abwechseln: 2 Minuten bei 90 % Umax, gefolgt von 2 Minuten bei 30 % von Umax, wiederholt für 18 Minuten (9 Zyklen). Dieses Protokoll wurde von Marcinko et ^al.19 übernommen.
   HINWEIS: Während der ersten 10 Minuten der Übungsphase ist es notwendig, den Fisch an die gleiche Geschwindigkeit wie die sitzende Gruppe (0,06 m/s) zu gewöhnen.
4. Implementieren Sie alle Trainingsprotokolle an 5 Tagen in der Woche über einen Zeitraum von vier Wochen.
   HINWEIS: Fische sollten in Aquarien gehalten werden, die geeignete Bedingungen bieten, und sie sollten nur während der dafür vorgesehenen Übungszeiten in das Trainingsgerät eingeführt werden. Fische sollten dreimal täglich mit tropischem Fischfutter versorgt werden, und das Wasser in Pflegeaquarien sollte alle 2 Tage teilweise gewechselt werden.
5. Wiederholen Sie den Ausdauertest am Ende jeder Woche, wobei die Latenz- und Geschwindigkeitsdaten zum Zeitpunkt der Ermüdung als Indikatoren für die körperlichen Konditionsparameter dienen.
6. Um Übertrainingseffekte zu induzieren, erhöhen Sie die Wasserströmungsgeschwindigkeit wöchentlich, basierend auf den Ergebnissen des Ausdauertests, der nach jedem 4-tägigen Trainingszyklus durchgeführt wird. Die Trainingsdauer muss angepasst werden, um die zurückgelegte Strecke (Geschwindigkeit × Zeit) zu berücksichtigen, und diese Dauer sollte zwischen den trainierten Gruppen konsistent bleiben.
7. Passen Sie die Schwimmzeit an den erhöhten Wasserfluss an und standardisieren Sie so die Trainingsbelastung über die trainierten Gruppen hinweg.

5. Körpermaße

1. Betäuben Sie den Fisch mit 0,0075 % Tricain (w/v) durch Eintauchen, um Körpermessungen (Gewicht und Größe) ^{durchzuführen20}.
2. Fotografieren und wiegen Sie den Fisch, um die Körpermaße mit der ImageJ-Software zu bestimmen.
3. Drücken Sie die Daten in Form von Body Condition Indizes aus (Gewicht [g]/Standardlänge [mm]2; BMI) und Body Condition Scoring (BCS)²⁰.
4. Um Größen- und Gewichtsabweichungen durch die Eibildung zu vermeiden, unterziehen Sie die Fische einer Standardzucht²⁰, gefolgt von Messungen und Wiegen.

Ergebnisse

Das Trainingsgerät zeigte eine bemerkenswerte Effizienz bei der Regulierung der Strömungsgeschwindigkeit. Um die Schwimmgeschwindigkeit schrittweise zu erhöhen, wurde der Wasserfluss für alle Gruppen wöchentlich erhöht, mit Ausnahme der SED-Gruppe, die bei einer konstanten Strömungsgeschwindigkeit von 0,06 m/s gehalten wurde. Bemerkenswert ist, dass die Vorrichtung ein bemerkenswertes Maß an Präzision ermöglichte und eine Einstellung der Strömungsgeschwindigkeit von bis zu 0,0...

Diskussion

In dieser Studie wurde ein innovatives, kostengünstiges Übungssystem entwickelt, das in Anlehnung an das Schwimmtunnel-Respirometer von Loligo Systems²¹ und das Rinnensystem²² zur umfassenden Untersuchung der Schwimmleistung von Zebrafischen dient. Der Umax wurde durch systematische Erhöhung des Wasserflusses in diskreten Stufen bestimmt, wobei die Geschwindigkeitsschritte in kurzen Intervallen (20-30 min) erfolgten, bis der Fisch die Er...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
CPVC Female 90-Degree Elbow for Plumbing	Tigre	22150260	3/4-inch
24AWG Wire	Sky Cablo Store		Connection between components in the Perforated Circuit Board (1m)
Acrylic pipe	The Clear Plastic Shop	41138408	3/4-inch
Aquarium Submersible Fish Tank	Aqua Tank		300w
CPVC Pipe	Tigre	10121787	3/4-inch
Female Threaded Gate Water Valve	Tigre	27950310	3/4-inch
Female Threaded Globe Water Valve	Tigre	27940510	3/4-inch
hrough-hole resistor	BXV		10 kΩ, 0.25W t
Lab Support Stand With Clamp with 30 inch rod	Masiye Labs	RSC0001	Support the horizontal pipes
LCD screen	Eichip		16 x 2, model JHD162A
Male x Male Dupont Jumpers	Chyan		Connection between arduino and flow sensor (30 cm)
Perforated Circuit Board single sided	KY WIN ROBOT		5 x 10 cm
Potentiometer	LUSYA	DL-ALPSA01	10kΩ
Roll of Water Blocking Tape	One World	5603131000	To avoid leaks
Silicone hose	Tigre	14211250	2 cm inner
Solder Station	QHTITEC	EU/US PLUG	Arduine system welding
Solder Wire Spool	BEEYIHF	I001-A001-Set	Arduine system welding
Threaded Male Socket and Unthreaded Female Socket CPVC Pipe Fitting	TIgre	35447849	3/4-inch
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich	E10521	Anesthetic
UNO-R3 board UNO R3 CH340G+MEGA328P Chip 16Mhz	FSXSEMI		For Arduino UNO R3 Development board
Unthreaded CPVC Tee Pipe Fitting, Female	Tigre	22200267	3/4-inch
Unthreaded Female CPVC Socket Pipe Fitting	Tigre	22170260	3/4-inch
Water Flow Sensor  model YF-B5	Siqma Robotics	SQ8659	1-25 L/min
Water Pump	Sunsun		Model HJ-2041, 3000L/h, 65W
Water reservoir	Custom		30 L