体外膜肺氧合对凝血系统的影响

摘要

我们提出了一种在绵羊中建立长期清醒体外膜肺氧合 （ECMO） 模型的方案。在 ECMO 模型期间，特别注意凝血系统的管理和评估。

摘要

本研究旨在探讨长期清醒体外膜肺氧合 （ECMO） 对绵羊模型凝血系统的影响。研究共纳入 10 只健康绵羊，每组 5 只绵羊。在静脉-动脉 ECMO （V-A ECMO） 组中，在右侧颈动脉和右侧颈外静脉进行插管。静脉-静脉 ECMO （V-V ECMO） 组采用双腔导管插入右颈外静脉。开始 ECMO 后，绵羊从麻醉中恢复并保持清醒 7 天。目标激活凝血时间 （ACT） 目标设定为 220-250 秒。在两组中，实际 ACT 在 250 s 左右波动，肝素剂量逐渐增加，在实验结束时达到近 60 IU/kg/min。此外，尽管接受相同剂量的肝素，但与 V-V ECMO 组相比，V-A ECMO 组的活化部分凝血活酶时间 （APTT） 和凝血酶时间 （TT） 值显着升高。尽管实验室检查结果在正常和合理的范围内波动，但在研究结束时，两组均观察到肾脏梗死病灶。

引言

体外膜肺氧合 （ECMO） 是一种挽救生命的干预措施，为重症患者提供心肺支持。它分为两种主要形式：静脉-动脉 ECMO （V-A ECMO） 和静脉-静脉 ECMO （V-V ECMO^）1,2。V-A ECMO 用于循环衰竭患者，而 V-V ECMO 则适用于呼吸衰竭但没有严重心血管功能障碍的患者 ^3,4。

血栓形成和出血是 ECMO 患者普遍的并发症⁵。ECMO 回路将血液暴露于人工表面，引发复杂的凝血反应⁶。这些过程可导致内皮损伤和微循环障碍，从而导致重要器官随后功能障碍 ^7,8。因此，有效的全身抗凝管理被认为对 ECMO 患者至关重要。尽管如此，在各种 ECMO 相关临床环境中，仍然缺乏指导抗凝策略的证据。

建立稳定的 ECMO 动物模型可以深入了解 ECMO 对身体的影响，为优化 ECMO 管理策略、减少 ECMO 相关并发症和改善临床实践中的患者预后做出重大贡献。大型动物（如绵羊和猪）是建立 ECMO 模型的主要选择，因为它们的生理参数与人类非常相似 ^9,10。然而，以前的大型动物 ECMO 模型的维护时间不到 24 h，因此很难全面评估 ECMO 对凝血系统的影响¹¹。因此，需要建立长期的 ECMO 大型动物模型，以深入探索 ECMO 的病理生理机制。利用长期大型动物模型研究 ECMO 对凝血系统的影响，可以为临床实践提供更有力的证据。

本研究旨在建立健康绵羊长期 （7 天） 清醒 V-A 和 V-V ECMO 模型。整个模型的建立和评估的中心重点是抗凝管理。

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研究方案

该实验方案获得了阜外医院机构动物护理和使用委员会的批准 （no. 0101-2-20-HX（X））。所有程序均符合美国国立卫生研究院的《实验动物使用和护理指南》中概述的指南。该实验在阜外医院动物实验中心心血管植入物材料临床前研究与评价北京市重点实验室进行（注册号。CNAS LA0009）。该研究使用了阜外医院动物实验中心符合所需检疫标准的健康绵羊。此外，这项研究遵循动物研究： 体内 实验报告指南。体重为 50-65 公斤，年龄为 12-24 个月（见 材料表）的雄性小尾汉羊被饲养在特定的无病原体环境中，手术前至少一周可以自由获得食物和水。将绵羊随机分为两组，每组由 5 只个体组成：静脉-动脉 ECMO （V-A ECMO） 组和静脉-静脉 ECMO （V-V ECMO） 组。选择健康的绵羊是合理的，因为有必要精确评估 ECMO 支持对生物体的影响。研究中使用的设备和试剂列在 材料表中。

1. 动物准备

1. 手术前，将健康的成年绵羊禁食 48 小时，并剥夺它们的水分 12 小时。
2. 手术前对手术器械和 ECMO 参数进行消毒。确保为手术团队的所有成员提供个人防护设备，包括手术帽、一次性口罩、干净的手术服、鞋套、无菌手术服和无菌手套。
3. 通过耳静脉注射异丙酚 （5 mg/kg）。如前所述，将血压袖带固定在大腿上，并在所有四个肢体上放置心电图导线。将血压袖带和心电图导联线连接到医用监护仪，用于心电图和无创血压测量¹².
4. 将单腔气管插管插入气管，并以容量控制模式将插管连接到呼吸机。设置参数如下：潮气量：8-10 mL/kg，呼吸频率：12-20/min，吸气氧初始分数 （FiO2）：60%。
5. 静脉麻醉（异丙酚，8-10 mg/kg/h）和吸入麻醉（异氟醚 2%-3%）的组合给药以维持麻醉。静脉提供间歇性氟比洛芬 （1-2 mg/kg） 用于术中镇痛。
6. 将绵羊放在手术台上，并用灵活的布带固定它们的四肢。继续分离左颈动脉和颈静脉，并分别插入单腔中心静脉导管 （18 Fr） 和三腔中心静脉导管 （7 Fr）。将左颈动脉上的 18 G 导管连接到医用监护仪以进行血流动力学监测。将左颈静脉上的 7 Fr 三腔中心静脉导管连接到输液泵和医疗监护仪，以同时进行静脉输液、药物注射和中心静脉压监测。使用三通旋塞阀进行所有连接。 通过 三通旋塞阀抽取静脉或动脉血样。
   注意：导管插入后，用 2-0 手术缝合线结扎导管和血管。
7. 暴露右颈动脉和静脉。通过右颈静脉推注肝素 （120 IU/kg） 实现全身抗凝。
   注意：插管的目标活化凝血时间 （ACT） 高于 250 秒。

2. 插管

1. V-A ECMO 回路建立：将动脉导管 （18 Fr） 穿过右颈动脉插入 10-15 cm 深处，将静脉导管 （24 Fr） 穿过右颈外静脉插入右心房。
2. V-V ECMO 电路建立：暴露右侧颈外静脉并通过右侧颈外静脉插入双腔导管 （23 Fr）。
   注意：在此过程中，将绵羊的血压和心率保持在基线值的 ±20% 以内。将动脉二氧化碳 （PaCO2） 的分压保持在 35-40 mmHg 之间。确保呼气末二氧化碳 （EtCO2） 的分压保持在 35-45 mmHg 之间。当绵羊遇到血压和心率变化时，调整麻醉深度。如果证明无效或在紧急情况下，请考虑使用血管活性药物。通过调整呼吸机参数将 PaCO2 和 EtCO2 维持在正常值内，主要关注潮气量和呼吸频率。
3. 在 V-V ECMO 中，将导管尖端穿过右心房 （RA） 并将其定位在下腔静脉 （IVC） 内。将双腔导管的流出口对准三尖瓣（在超声辅助下确认位置）。
   注意：导管插入后，用 2-0 手术缝合线结扎导管和血管。使用 4-0 手术缝合线闭合皮肤切口。

3. ECMO 的启动

1. 按照制造商的说明连接所有 ECMO 设备（参见 材料表）。确保没有泄漏。
   注意： 连接过程中遵循无菌原则。
2. 引发液由生理盐水 （1000 mL） 和 2000 IU 肝素组成。将灌注溶液手动注入 ECMO 回路并确保回路中没有气泡后，启动离心泵进行灌注 （1000-1500 rpm）。
3. 灌注完成后，关闭离心泵。将流入导管连接到离心泵的入口，并将流出导管连接到氧合器的出口。使用三通旋塞阀进行所有连接。通过三通旋塞阀在连接处排出空气。将氧源连接到 ECMO 系统，确保氧气流量正确。然后启动离心泵进行 ECMO 运行。将初始泵流量设置为 2.0 L/min，泵速为 3000 rpm。
4. 将 ECMO 电路管线半绕在绵羊的脖子上，以防止移位或扭结。

4. 术后管理和监测

1. 将绵羊转移到代谢笼中，并在完成手术后适当约束绵羊。
   注意：固定绵羊的头部和肩部，特别强调防止套管移位或扭结。逐渐减少麻醉深度。通过穿戴防护装备（无菌衣服、手套、口罩和帽子）确保术后护理团队成员的个人保护。
2. 在确保稳定的呼吸和血气分析结果时，取出气管插管。
3. 在手术后最初的 24 小时内，静脉注射氟比洛芬 （1-2 mg/kg） 和右美托咪定 （0.2-0.3 μg/kg·h） 以镇静和缓解疼痛。
   注意：第一个 24 小时后，如果绵羊因术后疼痛而出现激动和血压波动，则考虑使用镇静和镇痛药物。
4. 在监控笼内，确保绵羊在一定范围内自由移动，并可以不受限制地获得适量的饲料和水。
5. 持续实时检查基本生命体征（心率和动脉血压）以及 ECMO 液压参数（泵流量、泵速、泵前压力、泵后压力和氧合器后压力）。
   注：设置 ECMO 管理的目标参数（泵流量：2.0-2.5 L/min，泵速：3000-3500 rpm，氧气流速：1.0-1.5 L/min，FiO2 为 50%-80%）。根据血气检测结果调整以上参数。
6. 每 6 小时测量一次血气和 ACT，并每天监测血细胞计数、血液化学和凝血试验。根据凝血指标调整抗凝策略。
   注意：目标 ACT 目标：220-250 秒。
7. 根据体液平衡调整静脉输注，以将中心静脉压 （CVP） 维持在 5-12 cm H₂O 之间。每天服用头孢呋辛钠（1.5 g，iv，b.i.d.）以预防感染。每天进行切口消毒，并密切监测感染或出血的迹象。

5. 安乐死

1. 实验期 7 天后，移除 ECMO 回路。
2. 静脉注射氯化钾 （100 mg/kg） 在异丙酚 （20 mg/kg） 镇静下实施安乐死。
   注意：安乐死后，收集主要器官（心脏、肾脏、肺、肝脏、脑和肠）并目视检查是否存在梗塞、出血或明显损伤。所有器官损伤均被详细记录。然后，将器官切成小块，用 4% 甲醛固定，用石蜡包埋，分成 4 μm 切片进行苏木精-伊红 （HE） 染色¹³。由至少两名病理学家在光学显微镜下独立对 HE 切片进行组织学检查。

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结果

在整个实验中，总共评估了 10 只绵羊，每组 5 只绵羊（表 1）。ECMO 开始后，所有绵羊从麻醉中恢复并保持清醒 7 天。在两组中，ECMO 流量均超过 1.8 L/min。在 V-V ECMO 组中，流量在 1.8 L/min 左右波动，而在 V-A ECMO 组中，流量在 2.3 L/min 至 1.8 L/min 之间波动（图 1A）。每只羊的生命体征保持稳定。两组醒来后 60 h 至 180 h 的血液乳酸水平均低?...

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讨论

本研究概述了为绵羊 V-V 和 V-A ECMO 建立稳健、长期生存模型的程序。所有存活的动物均表现出稳定的生命体征，未发生严重出血或凝血事件。ECMO 流量和氧合性能保持稳定，未观察到重大病理损伤。该研究提供了有关抗凝管理的详细信息。

抗凝管理在 ECMO 围手术期护理中起着至关重要的作用。最初，根据以前的研究，目标 ACT 设定为 180-220 s 14,15,16,17?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ACT analyzer	Hemochron, USA	Jr Signature
Anaesthesia machine	Drager, Germany	Primus
Arterial catheter	Edwards Lifescience, USA	18-Fr	Provide return access into an artery for VA-EMCO
Blood chemistry analyzer	IDEXX Laboratories, USA	Catalyst One
Blood gas analyzer	Abbott, USA	Abbott i-STAT1
Centrifugal pump	Jiangsu STMed Technologies, China	STM CP-24 I
Centrifugal pump drive and console	Jiangsu STMed Technologies, China	OASSIST STM001
Coagulation test analyzer	Beijing Succeeder Technology, China	SF-8050
Complete blood count analyzer	Siemens Healthcare, Germany	ADVIA 2120i
Dual-channel micro-injection pump	Zhejiang Smith Medical Instrument, China	WZS-50F6
Dual-lumen catheter	MAQUET Avalon Elite, Germany	23-Fr	Provide return and drainage accesses into the right external jugular vein for VV-ECMO
Flurbiprofen	Beijing Tide Pharmaceutical Co., Ltd., China	5ml: 50mg
GraphPad software	GraphPad Software, USA	GraphPad Prism v9.0	Statistical analysis
Heparin	Shanghai Shangyao No.1 Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd., China	2ml: 12500IU
High-frequency electrosurgical	COVIDIEN, USA	Force F
Multi-parameter medical monitor	Philips, Netherlands	MP60
Oxygenator kit	Medos, Germany	Hilite 7000LT
Oxygenator kit	Maquet, Germany	BE-PLS 2050
Propofol	Xi’an Libang Pharmaceutical Co. Ltd, China	20ml: 0.2g
Single-lumen central venous catheter	TuoRen, China	18Fr	Insert in left carotid artery  for hemodynamic monitoring and blood sampling.
Small Tail Han sheep	Jinyutongfeng Commercial and Trade Co. Ltd, China	weight: 50-65 kg, age: 12-24 months
Triple-lumen central venous catheter	TuoRen, China	7Fr	Insert in left jugular vein for intravenous fluid administration, drug injection, and blood sampling.
Ultrasound machine	GE, USA	E9
Venous catheter	Edwards Lifescience, USA	24-Fr	Provide the drainage access into a vein for VA-ECMO
Ventilator	Drager, Germany	Savina