Efectos de la oxigenación por membrana extracorpórea en el sistema de coagulación

Resumen

Presentamos un protocolo para establecer un modelo de oxigenación por membrana extracorpórea (ECMO) despierto a largo plazo en ovejas. Se presta especial atención al manejo y evaluación del sistema de coagulación durante el modelo ECMO.

Resumen

Este estudio tuvo como objetivo investigar los efectos de la oxigenación por membrana extracorpórea (ECMO) despierta a largo plazo en el sistema de coagulación en un modelo de oveja. Se incluyeron en el estudio un total de diez ovejas sanas, con 5 ovejas en cada grupo. En el grupo de ECMO VENO-ARTERIAL (ECMO V-A), la canulación se realizó en la arteria carótida derecha y en la vena yugular externa derecha. En el grupo de ECMO veno-venoso (ECMO V-V), se utilizó un catéter de doble lumen para insertarlo en la vena yugular externa derecha. Después de iniciar la ECMO, las ovejas se recuperaron de la anestesia y permanecieron despiertas durante 7 días. El objetivo de tiempo de coagulación activado (ACT) se estableció en 220-250 s. En ambos grupos, la ACT real fluctuó alrededor de 250 s con la dosis de heparina aumentando gradualmente, alcanzando casi 60 UI/kg/min al final de los experimentos. Además, los valores de tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA) y tiempo de trombina (TT) fueron significativamente más altos en el grupo de V-A ECMO en comparación con el grupo V-V ECMO, a pesar de recibir las mismas dosis de heparina. Aunque los resultados de las pruebas de laboratorio fluctuaron dentro de un rango normal y razonable, se observaron focos de infarto en los riñones en ambos grupos al final del estudio.

Introducción

La oxigenación por membrana extracorpórea (ECMO, por sus siglas en inglés) es una intervención que salva vidas, ya que proporciona apoyo cardiopulmonar a los pacientes gravemente enfermos. Se clasifica en dos formas principales: ECMO VENO-ARTERIAL (V-A ECMO) y ECMO VENO-VENOSA (V-V ECMO^)1,2. La ECMO V-A se emplea para los pacientes que experimentan insuficiencia circulatoria, mientras que la ECMO V-V se prefiere para aquellos con insuficiencia respiratoria pero sin disfunción cardiovascular grave ^3,4.

La trombosis y el sangrado son complicaciones prevalentes en los pacientes con ECMO⁵. El circuito ECMO expone la sangre a superficies artificiales, iniciando respuestas complejas de coagulación⁶. Estos procesos pueden conducir a daño endotelial y trastornos de la microcirculación, resultando en una disfunción posterior en órganos vitales ^7,8. En consecuencia, el tratamiento eficaz de la anticoagulación sistémica se considera crucial para los pacientes con ECMO. A pesar de esto, sigue habiendo una falta de evidencia para guiar las estrategias de anticoagulación en varios entornos clínicos relacionados con la ECMO.

El establecimiento de un modelo animal estable de ECMO puede proporcionar información sobre el impacto de la ECMO en el cuerpo, contribuyendo significativamente a la optimización de las estrategias de manejo de la ECMO, la reducción de las complicaciones relacionadas con la ECMO y la mejora de los resultados de los pacientes en la práctica clínica. Los animales grandes, como las ovejas y los cerdos, son las principales opciones para establecer modelos de ECMO debido a que sus parámetros fisiológicos se asemejan mucho a los de los humanos ^9,10. Sin embargo, los modelos anteriores de ECMO en animales grandes tenían un tiempo de mantenimiento de menos de 24 h, lo que dificultaba la evaluación exhaustiva del impacto de la ECMO en el sistema de coagulación¹¹. Por lo tanto, existe la necesidad de establecer modelos animales grandes de ECMO a largo plazo para explorar a fondo los mecanismos fisiopatológicos de la ECMO. El uso de modelos animales grandes a largo plazo para investigar los efectos de la OMEC en el sistema de coagulación puede proporcionar pruebas más sólidas para la práctica clínica.

Este estudio tiene como objetivo establecer un modelo de OMEC V-A y V-V despierto a largo plazo (7 días) en ovejas sanas. El enfoque central de todo el establecimiento y evaluación del modelo es el manejo de la anticoagulación.

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Protocolo

Este protocolo experimental recibió la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital de Fuwai (nº 0101-2-20-HX(X)). Todos los procedimientos se adhirieron a las pautas descritas en la Guía para el uso y cuidado de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El experimento se llevó a cabo en el Laboratorio Clave de Investigación Preclínica y Evaluación de Materiales de Implantes Cardiovasculares de Pekín, Centro Experimental Animal del Hospital de Fuwai (nº de registro. CNAS LA0009). En el estudio se utilizaron ovejas sanas que cumplieron con los estándares de cuarentena requeridos en el Centro Experimental Animal del Hospital de Fuwai. Además, esta investigación siguió las directrices de Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments. Los machos de oveja Han de cola pequeña con un rango de peso de 50 a 65 kg y un rango de edad de 12 a 24 meses (ver Tabla de Materiales) se alojaron en un entorno específico libre de patógenos con libre acceso a alimentos y agua durante al menos una semana antes de la cirugía. Las ovejas fueron asignadas aleatoriamente a dos grupos, cada uno compuesto por 5 individuos: el grupo de ECMO VENO-ARTERIAL (V-A ECMO) y el grupo de ECMO VENO-VENOSO (V-V ECMO). La selección de ovejas sanas se justificó por la necesidad de evaluar con precisión los efectos del soporte de ECMO en el organismo. Los equipos y reactivos utilizados en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación animal

1. Antes del procedimiento quirúrgico, ayunar ovejas adultas sanas durante 48 h y privarlas de agua durante 12 h.
2. Esterilizar el instrumental quirúrgico y los parámetros de ECMO antes de la cirugía. Garantizar el suministro de equipo de protección personal para todos los miembros del equipo quirúrgico, incluidos gorros quirúrgicos, mascarillas desechables, ropa quirúrgica limpia, cubrezapatos, ropa operativa estéril y guantes estériles.
3. Administrar una inyección de propofol (5 mg/kg) a través de la vena auricular. Como se describió anteriormente, fije el manguito de presión arterial en el muslo y coloque los cables del electrocardiograma en las cuatro extremidades. Conecte el manguito de presión arterial y los cables de ECG al monitor médico para ECG y medición no invasiva de la presión arterial¹².
4. Inserte un tubo endotraqueal de un solo lumen en la tráquea y conecte el tubo al ventilador con modo de volumen controlado. Ajuste los parámetros de la siguiente manera: volumen corriente: 8-10 mL/kg, frecuencia respiratoria: 12-20/min, fracción inicial de oxígeno de inspiración (FiO2): 60%.
5. Administrar una combinación de anestesia intravenosa (propofol, 8-10 mg/kg/h) y anestesia inhalada (isoflurano 2%-3%) para el mantenimiento de la anestesia. Proporcionar flurbiprofeno intermitente (1-2 mg/kg) por vía intravenosa para la analgesia intraoperatoria.
6. Coloque las ovejas en la mesa de operaciones y asegure sus extremidades con un cinturón de tela flexible. Se procede al aislamiento de la arteria carótida izquierda y de la vena yugular y se introduce un catéter venoso central de un solo lumen (18 Fr) y un catéter venoso central de triple luz (7 Fr), respectivamente. Conecte el catéter de 18 G en la arteria carótida izquierda al monitor médico para la monitorización hemodinámica. Conecte el catéter venoso central de triple luz de 7 Fr en la vena yugular izquierda a la bomba de infusión y al monitor médico para la administración simultánea de líquidos intravenosos, la inyección de fármacos y la monitorización de la presión venosa central. Realice todas las conexiones utilizando las llaves de paso de tres vías. Extraiga muestras de sangre venosa o arterial a través de una llave de paso de tres vías.
   NOTA: Después de la inserción del catéter, ligar el catéter y el vaso con suturas quirúrgicas 2-0.
7. Exponga la arteria yugular y la vena derechas. Lograr la anticoagulación sistémica con un bolo de heparina (120 UI/kg) a través de la vena yugular derecha.
   NOTA: El tiempo de coagulación activado (ACT) objetivo para la canulación es superior a 250 s.

2. Canulación

1. Establecimiento del circuito V-A ECMO: Insertar un catéter arterial (18 Fr) a través de la arteria carótida derecha hasta una profundidad de 10-15 cm y un catéter venoso (24 Fr) a través de la vena yugular externa derecha hasta la aurícula derecha.
2. Establecimiento del circuito V-V ECMO: Exponga la vena yugular externa derecha e inserte un catéter de doble lumen (23 Fr) a través de la vena yugular externa derecha.
   NOTA: Durante este procedimiento, mantenga la presión arterial y la frecuencia cardíaca de las ovejas dentro del ±20% de los valores iniciales. Mantener la presión parcial de dióxido de carbono arterial (PaCO2) entre 35-40 mmHg. Asegúrese de que la presión parcial del dióxido de carbono (EtCO2) al final de la espiración permanezca entre 35 y 45 mmHg. Ajuste la profundidad de la anestesia cuando encuentre variaciones en la presión arterial y la frecuencia cardíaca en las ovejas. Si esto resulta ineficaz o en casos de emergencia, considere el uso de medicamentos vasoactivos. Mantener la PaCO2 y la EtCO2 dentro de los valores normales ajustando los parámetros del ventilador, centrándose principalmente en el volumen corriente y la frecuencia respiratoria.
3. En la ECMO v-v, se pasa la punta del catéter a través de la aurícula derecha (AR) y se coloca dentro de la vena cava inferior (IVC). Dirija el puerto de salida del catéter de doble luz hacia la válvula tricúspide (confirme la posición con asistencia de ultrasonido).
   NOTA: Después de la inserción del catéter, ligar el catéter y el vaso con suturas quirúrgicas 2-0. Cierre la incisión cutánea con suturas quirúrgicas 4-0.

3. Inicio de la OMEC

1. Conecte todos los dispositivos ECMO siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales). Asegúrese de que no haya fugas.
   NOTA: Siga los principios asépticos durante la conexión.
2. La solución de cebado consiste en solución salina normal (1000 mL) con 2000 UI de heparina. Después de infundir manualmente la solución de cebado en el circuito ECMO y asegurarse de que no haya burbujas de aire en el circuito, encienda la bomba centrífuga para cebado (1000-1500 rpm).
3. Una vez finalizado el cebado, apague la bomba centrífuga. Conecte el catéter de entrada a la entrada de la bomba centrífuga y conecte el catéter de salida a la salida del oxigenador. Realice todas las conexiones utilizando las llaves de paso de tres vías. Expulse el aire en la conexión a través de la llave de paso de tres vías. Conecte la fuente de oxígeno al sistema ECMO, asegurando el flujo de oxígeno correcto. A continuación, ponga en marcha la bomba centrífuga para el funcionamiento de la ECMO. Ajuste el caudal inicial de la bomba a 2,0 L/min con una velocidad de la bomba de 3000 rpm.
4. Enrolle la línea del tubo del circuito ECMO alrededor del cuello de la oveja para evitar que se desplace o se retuerza.

4. Gestión y seguimiento postoperatorio

1. Transfiera las ovejas a una jaula metabólica y sujete a las ovejas adecuadamente después de completar la operación.
   NOTA: Asegure la cabeza y los hombros de las ovejas con especial énfasis en evitar el desplazamiento o la torcedura de la cánula. Reduzca gradualmente la profundidad de la anestesia. Asegurar la protección personal de los miembros del equipo de enfermería postoperatorio mediante el uso de equipos de protección (ropa estéril, guantes, mascarillas y gorros).
2. Para asegurarse de que los resultados de la respiración y los análisis de gases en sangre sean estables, retire el tubo endotraqueal.
3. En las primeras 24 h postoperatorias, administrar flurbiprofeno (1-2 mg/kg) y dexmedetomidina (0,2-0,3 μg/kg·h) por vía intravenosa para la sedación y el alivio del dolor.
   NOTA: Después de las primeras 24 h, considerar fármacos sedantes y analgésicos si hay agitación y fluctuación de la presión arterial en las ovejas debido al dolor postoperatorio.
4. Dentro de la jaula de monitoreo, asegúrese de que las ovejas se muevan libremente dentro de un cierto rango y tengan acceso sin restricciones a una cantidad adecuada de alimento y agua.
5. Mantenga un control continuo en tiempo real de los signos vitales fundamentales (frecuencia cardíaca y presión arterial) junto con los parámetros hidráulicos de ECMO (flujo de la bomba, velocidad de la bomba, presión previa a la bomba, presión posterior a la bomba y presión posterior al oxigenador).
   NOTA: Establezca los parámetros objetivo para la gestión de ECMO (caudal de la bomba: 2,0-2,5 L/min, velocidad de la bomba: 3000-3500 rpm, caudal de oxígeno: 1,0-1,5 L/min con una FiO2 del 50%-80%). Ajuste los parámetros anteriores de acuerdo con los resultados de gases en sangre.
6. Mida la gasometría y el ACT cada 6 horas y controle el hemograma, la química sanguínea y las pruebas de coagulación a diario. Ajustar la estrategia de anticoagulación en función de los indicadores de coagulación.
   NOTA: El objetivo del ACT: 220-250 s.
7. Ajustar las infusiones intravenosas en función del equilibrio de líquidos para mantener la presión venosa central (PVC) entre 5-12 cm H₂O. Administrar cefuroxima sódica (1,5 g, i.v., b.i.d.) diariamente para la prevención de infecciones. Lleve a cabo la desinfección diaria de las incisiones y vigile de cerca si hay signos de infección o sangrado.

5. Eutanasia

1. Después de un período experimental de 7 días, retire el circuito ECMO.
2. Administrar una inyección intravenosa de cloruro potásico (100 mg/kg) para eutanasia bajo sedación con propofol (20 mg/kg).
   NOTA: Después de la eutanasia, se recogieron los órganos principales (corazón, riñón, pulmón, hígado, cerebro e intestino) y se examinaron visualmente para detectar la presencia de infartos, hemorragias o daños manifiestos. Todas las lesiones orgánicas fueron registradas en detalle. Luego, los órganos se cortaron en pedazos pequeños y se fijaron en formaldehído al 4%, se incrustaron con parafina y se dividieron en secciones de 4 μm para la tinción de hematoxilina-eosina (HE)¹³. Realizar un examen histológico para secciones de HE bajo un microscopio óptico por al menos dos patólogos de forma independiente.

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Resultados

Se evaluaron un total de diez ovejas durante todo el experimento, con cinco ovejas en cada grupo (Tabla 1). Tras el inicio de la ECMO, todas las ovejas se recuperaron de la anestesia y permanecieron despiertas durante 7 días. En ambos grupos, el caudal de ECMO superó los 1,8 L/min. En el grupo V-V ECMO, el caudal fluctuó alrededor de 1,8 L/min, mientras que en el grupo V-A ECMO, osciló entre 2,3 L/min y 1,8 L/min (Figura 1A). Los signos ...

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Discusión

Este estudio describe el procedimiento para establecer modelos robustos de supervivencia a largo plazo para V-V y V-A ECMO en ovejas. Todos los animales supervivientes mostraron signos vitales estables y no se produjeron hemorragias graves ni eventos de coagulación. El flujo de ECMO y el rendimiento de la oxigenación se mantuvieron estables, sin que se observaran lesiones patológicas importantes. El estudio proporciona información detallada sobre el tratamiento de la anticoagulación...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
ACT analyzer	Hemochron, USA	Jr Signature
Anaesthesia machine	Drager, Germany	Primus
Arterial catheter	Edwards Lifescience, USA	18-Fr	Provide return access into an artery for VA-EMCO
Blood chemistry analyzer	IDEXX Laboratories, USA	Catalyst One
Blood gas analyzer	Abbott, USA	Abbott i-STAT1
Centrifugal pump	Jiangsu STMed Technologies, China	STM CP-24 I
Centrifugal pump drive and console	Jiangsu STMed Technologies, China	OASSIST STM001
Coagulation test analyzer	Beijing Succeeder Technology, China	SF-8050
Complete blood count analyzer	Siemens Healthcare, Germany	ADVIA 2120i
Dual-channel micro-injection pump	Zhejiang Smith Medical Instrument, China	WZS-50F6
Dual-lumen catheter	MAQUET Avalon Elite, Germany	23-Fr	Provide return and drainage accesses into the right external jugular vein for VV-ECMO
Flurbiprofen	Beijing Tide Pharmaceutical Co., Ltd., China	5ml: 50mg
GraphPad software	GraphPad Software, USA	GraphPad Prism v9.0	Statistical analysis
Heparin	Shanghai Shangyao No.1 Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd., China	2ml: 12500IU
High-frequency electrosurgical	COVIDIEN, USA	Force F
Multi-parameter medical monitor	Philips, Netherlands	MP60
Oxygenator kit	Medos, Germany	Hilite 7000LT
Oxygenator kit	Maquet, Germany	BE-PLS 2050
Propofol	Xi’an Libang Pharmaceutical Co. Ltd, China	20ml: 0.2g
Single-lumen central venous catheter	TuoRen, China	18Fr	Insert in left carotid artery  for hemodynamic monitoring and blood sampling.
Small Tail Han sheep	Jinyutongfeng Commercial and Trade Co. Ltd, China	weight: 50-65 kg, age: 12-24 months
Triple-lumen central venous catheter	TuoRen, China	7Fr	Insert in left jugular vein for intravenous fluid administration, drug injection, and blood sampling.
Ultrasound machine	GE, USA	E9
Venous catheter	Edwards Lifescience, USA	24-Fr	Provide the drainage access into a vein for VA-ECMO
Ventilator	Drager, Germany	Savina