JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем протокол для создания долгосрочной модели экстракорпоральной мембранной оксигенации (ЭКМО) в бодрствующем состоянии у овец. Особое внимание уделяется управлению и оценке коагуляционной системы при моделировании ЭКМО.

Аннотация

Целью данного исследования было изучение влияния длительной экстракорпоральной мембранной оксигенации (ЭКМО) в бодрствующем состоянии на коагуляционную систему в модели овец. Всего в исследование было включено десять здоровых овец, по 5 овец в каждой группе. В группе веноартериальной ЭКМО (В-А ЭКМО) проводили канюляцию в правой сонной артерии и правой наружной яремной вене. В группе вено-венозной ЭКМО (V-V ЭКМО) для введения в правую наружную яремную вену использовался двухпросветный катетер. После начала ЭКМО овцы оправились от анестезии и оставались в сознании в течение 7 дней. Целевой показатель активированного времени свертывания крови (ACT) был установлен на уровне 220-250 с. В обеих группах фактическая АКТ колебалась в районе 250 с, при этом доза гепарина постепенно увеличивалась, достигая почти 60 МЕ/кг/мин в конце экспериментов. Более того, значения активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) и тромбинового времени (ТТ) были достоверно выше в группе V-A ЭКМО по сравнению с группой V-V ЭКМО, несмотря на получение одинаковых доз гепарина. Несмотря на то, что результаты лабораторных исследований колебались в пределах нормы и разумного диапазона, очаги инфаркта в почках наблюдались в обеих группах в конце исследования.

Введение

Экстракорпоральная мембранная оксигенация (ЭКМО) служит жизненно важным вмешательством, обеспечивая сердечно-легочную поддержку тяжелобольным пациентам. Он классифицируется на две первичные формы: веноартериальная ЭКМО (V-A ECMO) и вено-венозная ЭКМО (V-V ECMO)1,2. V-A ЭКМО используется для пациентов с недостаточностью кровообращения, тогда как V-V ЭКМО предпочтительна для пациентов с дыхательной недостаточностью, но без тяжелой сердечно-сосудистой дисфункции 3,4.

Тромбоз и кровотечение являются распространенными осложнениями у пациентов с ЭКМО5. Контур ЭКМО подвергает кровь воздействию искусственных поверхностей, инициируя сложные реакции свертываниякрови 6. Эти процессы могут приводить к повреждению эндотелия и нарушению микроциркуляции, что приводит к последующей дисфункции жизненно важных органов 7,8. Следовательно, эффективное управление системной антикоагулянтной терапией считается критически важным для пациентов с ЭКМО. Несмотря на это, по-прежнему не хватает доказательств для руководства стратегиями антикоагулянтной терапии в различных клинических условиях, связанных с ЭКМО.

Создание стабильной модели ЭКМО на животных может дать представление о влиянии ЭКМО на организм, внося значительный вклад в оптимизацию стратегий управления ЭКМО, снижение осложнений, связанных с ЭКМО, и улучшение результатов лечения пациентов в клинической практике. Крупные животные, такие как овцы и свиньи, являются основным выбором для создания моделей ЭКМО из-за их физиологических параметров, очень близкихк человеческим. Тем не менее, предыдущие модели ЭКМО крупных животных имели время технического обслуживания менее 24 часов, что затрудняло всестороннюю оценку влияния ЭКМО на свертывающую систему11. Таким образом, существует необходимость в создании долгосрочных моделей ЭКМО на крупных животных для тщательного изучения патофизиологических механизмов ЭКМО. Использование долгосрочных моделей на крупных животных для изучения влияния ЭКМО на свертывающую систему может обеспечить более надежные доказательства для клинической практики.

Данное исследование направлено на установление долгосрочной (7 дней) модели ЭКМО в бодрствующем состоянии у здоровых овец. Центральным направлением всей разработки и оценки модели является управление антикоагулянтами.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Этот экспериментальный протокол получил одобрение Комитета по уходу за животными и их использованию больницы Фувай (No 0101-2-20-HX(X)). Все процедуры проводились в соответствии с рекомендациями, изложенными в Руководстве Национального института здравоохранения по использованию и уходу за лабораторными животными. Эксперимент проводился в Пекинской ключевой лаборатории доклинических исследований и оценки материалов для сердечно-сосудистых имплантатов, Экспериментальном центре животных больницы Фувай (регистрационный номер. CNAS LA0009). В исследовании использовались здоровые овцы, которые соответствовали требуемым карантинным нормам в Экспериментальном центре животных больницы Фувай. Кроме того, это исследование проводилось в соответствии с рекомендациями «Исследования на животных: отчетность об экспериментах in vivo ». Самцы мелкохвостых ханьских овец весом 50-65 кг и возрастом от 12 до 24 месяцев (см. Таблицу материалов) содержались в определенной среде, свободной от патогенов, со свободным доступом к пище и воде в течение как минимум одной недели до операции. Овцы были случайным образом распределены на две группы, каждая из которых состояла из 5 особей: группа веноартериальной ЭКМО (V-A ЭКМО) и группа вено-венозной ЭКМО (V-V ЭКМО). Отбор здоровых овец был обоснован необходимостью точной оценки влияния поддержки ЭКМО на организм. Оборудование и реагенты, использованные в исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка животных

  1. Перед хирургическим вмешательством здоровых взрослых овец голодают в течение 48 ч и лишают их воды в течение 12 ч.
  2. Перед операцией стерилизуйте хирургические инструменты и параметры ЭКМО. Обеспечить всех членов хирургической бригады средствами индивидуальной защиты, включая хирургические шапочки, одноразовые маски для лица, чистую хирургическую одежду, бахилы, стерильную операционную одежду и стерильные перчатки.
  3. Введите инъекцию пропофола (5 мг/кг) через ушную вену. Как описано ранее, зафиксируйте манжету для измерения артериального давления на бедре и поместите электрокардиограмму на все четыре конечности. Подсоедините манжету для измерения артериального давления и провода ЭКГ к медицинскому монитору для измерения ЭКГ и неинвазивного измерения артериального давления12.
  4. Вставьте однопросветную эндотрахеальную трубку в трахею и подключите трубку к аппарату искусственной вентиляции легких в режиме регулировки объема. Установите следующие параметры: дыхательный объем: 8-10 мл/кг, частота дыхания: 12-20/мин, начальная доля кислорода на вдохе (FiO2): 60%.
  5. Применяют комбинацию внутривенной анестезии (пропофол, 8-10 мг/кг/ч) и ингаляционной анестезии (изофлуран 2%-3%) для поддержания анестезии. Введите прерывистый флурбипрофен (1-2 мг/кг) внутривенно для интраоперационной анальгезии.
  6. Поместите овец на операционный стол и закрепите их конечности гибким тканевым ремнем. Продолжайте изолировать левую сонную артерию и яремную вену и введите центральный венозный катетер с одним просветом (18 Fr) и центральный венозный катетер с тройным просветом (7 Fr) соответственно. Подключите катетер 18 G на левой сонной артерии к медицинскому монитору для мониторинга гемодинамики. Подсоедините трехпросветный центральный венозный катетер 7 Fr на левой яремной вене к инфузионному насосу и медицинскому монитору для одновременного внутривенного введения жидкости, инъекции лекарств и мониторинга центрального венозного давления. Выполните все соединения с помощью трехсторонних запорных кранов. Возьмите образцы венозной или артериальной крови с помощью трехстороннего запорного крана.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После введения катетера перевяжите катетер и сосуд 2-0 хирургическими швами.
  7. Обнажите правую яремную артерию и вену. Добиться системной антикоагуляции с помощью болюса гепарина (120 МЕ/кг) через правую яремную вену.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Целевое активированное время свертывания крови (ACT) для канюляции составляет более 250 секунд.

2. Канюляция

  1. Установка контура V-A ЭКМО: Введите артериальный катетер (18 Fr) через правую сонную артерию на глубину 10-15 см и венозный катетер (24 Fr) через правую наружную яремную вену в правое предсердие.
  2. Установка контура V-V ЭКМО: Обнажите правую наружную яремную вену и вставьте двухпросветный катетер (23 Fr) через правую наружную яремную вену.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этой процедуры поддерживайте артериальное давление и частоту сердечных сокращений овец в пределах ±20% от исходных значений. Поддерживайте парциальное давление артериального углекислого газа (PaCO2) в пределах 35-40 мм рт.ст. Убедитесь, что парциальное давление углекислого газа (EtCO2) в конце прилива остается в пределах 35-45 мм рт.ст. Отрегулируйте глубину анестезии при столкновении с колебаниями артериального давления и частоты сердечных сокращений у овец. Если это оказывается неэффективным или в экстренных случаях, рассмотрите возможность использования вазоактивных препаратов. Поддерживайте PaCO2 и EtCO2 в пределах нормы, регулируя параметры аппарата ИВЛ, уделяя основное внимание дыхательному объему и частоте дыхания.
  3. При V-V ЭКМО проведите наконечник катетера через правое предсердие (RA) и поместите его в нижнюю полую вену (IVC). Направьте порт оттока двухпросветного катетера в сторону трикуспидального клапана (подтвердите положение с помощью ультразвука).
    ПРИМЕЧАНИЕ: После введения катетера перевяжите катетер и сосуд 2-0 хирургическими швами. Закройте разрез кожи с помощью хирургических швов 4-0.

3. Начало ЭКМО

  1. Подключите все устройства ЭКМО, следуя инструкциям производителя (см. Таблицу материалов). Убедитесь в отсутствии утечек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте принципы асептики во время подключения.
  2. Раствор праймирования состоит из нормального физиологического раствора (1000 мл) с 2000 МЕ гепарина. После ручного введения раствора для заливки в контур ЭКМО и обеспечения отсутствия пузырьков воздуха в контуре запустите центробежный насос для заливки (1000-1500 об/мин).
  3. После завершения заливки выключите центробежный насос. Подсоедините входной катетер к входному отверстию центробежного насоса и подсоедините выходной катетер к выходному отверстию оксигенатора. Выполните все соединения с помощью трехсторонних запорных кранов. Выпускайте воздух в месте соединения через трехходовой запорный кран. Подключите источник кислорода к системе ЭКМО, обеспечив правильный поступление кислорода. Затем запустите центробежный насос для запуска ЭКМО. Установите начальный расход насоса на уровне 2,0 л/мин при скорости насоса 3000 об/мин.
  4. Наденьте на шею овцы полуконтур трубки ЭКМО, чтобы предотвратить смещение или перекручивание.

4. Послеоперационное ведение и мониторинг

  1. Переведите овец в метаболическую клетку и после завершения операции удерживайте овец соответствующим образом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Закрепите голову и плечи овец, уделяя особое внимание предотвращению смещения или перегиба канюли. Постепенно уменьшайте глубину анестезии. Обеспечить личную защиту членов послеоперационной сестринской бригады путем ношения защитных средств (стерильной одежды, перчаток, масок и шапочек).
  2. При обеспечении стабильного дыхания и результатов анализа газов крови удалите эндотрахеальную трубку.
  3. В течение первых 24 ч после операции введите флурбипрофен (1-2 мг/кг) и дексмедетомидин (0,2-0,3 мкг/кг·ч) внутривенно для седации и облегчения боли.
    Примечание: После первых 24 ч рассмотрите прием седативных и обезболивающих препаратов, если у овец наблюдается возбуждение и колебания артериального давления из-за послеоперационных болей.
  4. Внутри клетки для мониторинга убедитесь, что овцы свободно передвигаются в определенном диапазоне и имеют неограниченный доступ к подходящему количеству корма и воды.
  5. Непрерывно проверяйте в режиме реального времени основные жизненно важные показатели (частоту сердечных сокращений и артериальное давление), а также гидравлические параметры ЭКМО (расход насоса, скорость насоса, давление перед насосом, давление после насоса и давление после оксигенатора).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Установите целевые параметры для управления ЭКМО (расход насоса: 2,0-2,5 л/мин, скорость насоса: 3000-3500 об/мин, расход кислорода: 1,0-1,5 л/мин при FiO2 50%-80%). Отрегулируйте вышеуказанные параметры в соответствии с результатами анализа газов крови.
  6. Измеряйте количество газов крови и ACT каждые 6 часов и ежедневно контролируйте анализ крови, биохимический анализ крови и анализы на свертываемость. Корректируйте антикоагулянтную стратегию на основе показателей свертываемости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Целевая цель ACT: 220-250 с.
  7. Корректируйте внутривенные инфузии в зависимости от баланса жидкости для поддержания центрального венозного давления (ЦВД) в диапазоне 5-12 см H2O. Вводите цефуроксим натрия (1,5 г, внутривенно, b.i.d.) ежедневно для профилактики инфекции. Проводите ежедневную дезинфекцию разреза и внимательно следите за признаками инфекции или кровотечения.

5. Эвтаназия

  1. После 7-дневного экспериментального периода снимите контур ЭКМО.
  2. Введите внутривенную инъекцию хлорида калия (100 мг/кг) для эвтаназии под седацией с пропофолом (20 мг/кг).
    ПРИМЕЧАНИЕ: После эвтаназии основные органы (сердце, почки, легкие, печень, мозг и кишечник) были собраны и визуально проверены на наличие инфарктов, кровоизлияний или явных повреждений. Все повреждения органов были подробно зафиксированы. Затем органы разрезали на мелкие кусочки и закрепили в 4% формальдегиде, засыпанном парафином, и разделили на участки по 4 мкм для окрашивания гематоксилин-эозином (HE)13. Гистологическое исследование срезов ПЭ под световым микроскопом не менее чем двумя патологоанатомами независимо друг от друга.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В общей сложности в течение всего эксперимента было оценено десять овец, по пять овец в каждой группе (Таблица 1). После начала ЭКМО все овцы оправились от анестезии и оставались в сознании в течение 7 дней. В обеих группах поток ЭКМО превышал 1,8 л/мин. В группе V-V ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этом исследовании описана процедура создания надежных, долгосрочных моделей выживаемости для V-V и V-A ЭКМО у овец. У всех выживших животных наблюдались стабильные жизненные показатели, тяжелых кровотечений или свертываний крови не наблюдалось. Показатели потока ЭКМ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Никакой.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
ACT analyzerHemochron, USAJr Signature
Anaesthesia machineDrager, Germany Primus
Arterial catheterEdwards Lifescience, USA18-FrProvide return access into an artery for VA-EMCO
Blood chemistry analyzerIDEXX Laboratories, USA Catalyst One
Blood gas analyzerAbbott, USAAbbott i-STAT1
Centrifugal pumpJiangsu STMed Technologies, ChinaSTM CP-24 I
Centrifugal pump drive and consoleJiangsu STMed Technologies, ChinaOASSIST STM001
Coagulation test analyzerBeijing Succeeder Technology, ChinaSF-8050
Complete blood count analyzerSiemens Healthcare, GermanyADVIA 2120i
Dual-channel micro-injection pumpZhejiang Smith Medical Instrument, ChinaWZS-50F6
Dual-lumen catheterMAQUET Avalon Elite, Germany23-FrProvide return and drainage accesses into the right external jugular vein for VV-ECMO
FlurbiprofenBeijing Tide Pharmaceutical Co., Ltd., China5ml: 50mg
GraphPad softwareGraphPad Software, USAGraphPad Prism v9.0Statistical analysis
Heparin Shanghai Shangyao No.1 Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd., China2ml: 12500IU
High-frequency electrosurgicalCOVIDIEN, USAForce F
Multi-parameter medical monitorPhilips, NetherlandsMP60
Oxygenator kitMedos, GermanyHilite 7000LT
Oxygenator kitMaquet, GermanyBE-PLS 2050
Propofol  Xi’an Libang Pharmaceutical Co. Ltd, China20ml: 0.2g
Single-lumen central venous catheterTuoRen, China18FrInsert in left carotid artery  for hemodynamic monitoring and blood sampling.
Small Tail Han sheepJinyutongfeng Commercial and Trade Co. Ltd, Chinaweight: 50-65 kg, age: 12-24 months
Triple-lumen central venous catheterTuoRen, China7FrInsert in left jugular vein for intravenous fluid administration, drug injection, and blood sampling.
Ultrasound machineGE, USAE9
Venous catheterEdwards Lifescience, USA24-FrProvide the drainage access into a vein for VA-ECMO
VentilatorDrager, Germany Savina

Ссылки

  1. Descamps, R., et al. Anti-Xa activity and hemorrhagic events under extracorporeal membrane oxygenation (ECMO): A multicenter cohort study. Crit Care. 25 (1), 127(2021).
  2. Keller, S. P. Contemporary approaches in the use of extracorporeal membrane oxygenation to support patients waiting for lung transplantation. Ann Cardiothorac Surg. 9 (1), 29-41 (2020).
  3. Smith, M., et al. Duration of veno-arterial extracorporeal life support (VA ECMO) and outcome: An analysis of the Extracorporeal Life Support Organization (ELSO) registry. Crit Care. 21 (1), 45(2017).
  4. Yang, L., et al. Risk factors for bloodstream infection (BSI) in patients with severe acute respiratory distress syndrome (ARDS) supported by veno-venous extracorporeal membrane oxygenation (VV-ECMO). BMC Pulm Med. 22 (1), 370(2022).
  5. Arachchillage, D. J., et al. Impact of major bleeding and thrombosis on 180-day survival in patients with severe COVID-19 supported with veno-venous extracorporeal membrane oxygenation in the United Kingdom: A multicentre observational study. Br J Haematol. 196 (3), 566-576 (2022).
  6. King, C. S., Roy, A., Ryan, L., Singh, R. Cardiac support: Emphasis on venoarterial ECMO. Crit Care Clin. 33 (4), 777-794 (2017).
  7. Rajsic, S., et al. Anticoagulation Strategies during extracorporeal membrane oxygenation: A narrative review. J Clin Med. 11 (17), 5147(2022).
  8. Rajsic, S., et al. The Role of Excessive anticoagulation and missing hyperinflammation in ECMO-associated bleeding. J Clin Med. 11 (9), 2314(2022).
  9. Djordjevic, I., et al. Fluid management in veno-arterial extracorporeal membrane oxygenation therapy-analysis of an experimental pig model. J Clin Med. 12 (16), 5330(2023).
  10. Passmore, M. R., et al. Evidence of altered haemostasis in an ovine model of venovenous extracorporeal membrane oxygenation support. Crit Care. 21 (1), 191(2017).
  11. Heinsar, S., et al. Heart failure supported by veno-arterial extracorporeal membrane oxygenation (ECMO): a systematic review of pre-clinical models. Intensive Care Med Exp. 8 (1), 16(2020).
  12. MohanKumar, S. M., et al. Effects of prenatal bisphenol-A exposure and postnatal overfeeding on cardiovascular function in female sheep. J Dev Orig Health Dis. 8 (1), 65-74 (2017).
  13. Zou, Z., et al. Naturally-occurring spinosyn A and its derivatives function as argininosuccinate synthase activator and tumor inhibitor. Nat Commun. 12 (1), 2263(2021).
  14. Cianchi, G., Lazzeri, C., Bonizzoli, M., Batacchi, S., Peris, A. Echo-guided insertion of a dual-lumen cannula for venovenous extracorporeal membrane oxygenation. ASAIO J. 65 (4), 414-416 (2019).
  15. Conway, R. G., et al. Evaluation of an autoregulatory ECMO system for total respiratory support in an acute ovine model. Artif Organs. 44 (5), 478-487 (2020).
  16. McDonald, C. I., et al. The impact of acute lung injury, ECMO and transfusion on oxidative stress and plasma selenium levels in an ovine model. J Trace Elem Med Biol. 30, 4-10 (2015).
  17. Zhou, X., et al. Long-term support with an ambulatory percutaneous paracorporeal artificial lung. J Heart Lung Transplant. 31 (6), 648-654 (2012).
  18. Brodard, J., et al. COVID-19 patients often show high-titer non-platelet-activating anti-PF4/heparin IgG antibodies. J Thromb Haemost. 19 (5), 1294-1298 (2021).
  19. Cartwright, B., et al. Hemostasis, coagulation and thrombin in venoarterial and venovenous extracorporeal membrane oxygenation: the HECTIC study. Sci Rep. 11 (1), 7975(2021).
  20. Lim, M. S., McRae, S. COVID-19 and immunothrombosis: Pathophysiology and therapeutic implications. Crit Rev Oncol Hematol. 168, 103529(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены