Efeitos da Oxigenação por Membrana Extracorpórea no Sistema de Coagulação

Resumo

Apresentamos um protocolo para estabelecer um modelo de oxigenação por membrana extracorpórea (ECMO) acordado a longo prazo em ovinos. Atenção especial é dada ao manejo e avaliação do sistema de coagulação durante o modelo de ECMO.

Resumo

Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos da oxigenação por membrana extracorpórea (ECMO) acordada de longo prazo no sistema de coagulação em um modelo de ovinos. Um total de dez ovelhas saudáveis foram incluídas no estudo, com 5 ovelhas em cada grupo. No grupo ECMO veno-arterial (V-A ECMO), foi realizada canulação na artéria carótida direita e na veia jugular externa direita. No grupo ECMO venovenosa (V-V ECMO), um cateter de duplo lúmen foi utilizado para inserir na veia jugular externa direita. Após o início da ECMO, os ovinos foram recuperados da anestesia e permaneceram acordados por 7 dias. A meta de tempo de coagulação ativada (ACT) foi definida em 220-250 s. Em ambos os grupos, o TCA real oscilou em torno de 250 s, com a dose de heparina aumentando gradualmente, chegando a quase 60 UI/kg/min ao final dos experimentos. Além disso, os valores de tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA) e tempo de trombina (TT) foram significativamente maiores no grupo ECMO V-A em comparação com o grupo ECMO V-V, apesar de receber as mesmas doses de heparina. Embora os resultados dos exames laboratoriais tenham oscilado dentro de uma faixa normal e razoável, focos de infarto nos rins foram observados em ambos os grupos ao final do estudo.

Introdução

A oxigenação por membrana extracorpórea (ECMO) serve como uma intervenção que salva vidas, fornecendo suporte cardiopulmonar para pacientes gravemente enfermos. É classificada em duas formas primárias: ECMO veno-arterial (ECMO V-A) e ECMO veno-venosa (ECMO V-V)^1,2. A ECMO V-A é empregada para pacientes com insuficiência circulatória, enquanto a ECMO V-V é preferida para aqueles com insuficiência respiratória, mas sem disfunção cardiovascular grave ^3,4.

Trombose e sangramento são complicações prevalentes em pacientes com ECMO⁵. O circuito de ECMO expõe o sangue a superfícies artificiais, iniciando respostas complexas de coagulação⁶. Esses processos podem levar a danos endoteliais e distúrbios da microcirculação, resultando em disfunção subsequente em órgãos vitais ^7,8. Consequentemente, o manejo eficaz da anticoagulação sistêmica é considerado crucial para pacientes com ECMO. Apesar disso, ainda há uma falta de evidências para orientar as estratégias de anticoagulação em vários ambientes clínicos relacionados à ECMO.

O estabelecimento de um modelo animal de ECMO estável pode fornecer informações sobre o impacto da ECMO no corpo, contribuindo significativamente para a otimização das estratégias de gerenciamento da ECMO, redução de complicações relacionadas à ECMO e melhoria dos resultados dos pacientes na prática clínica. Animais de grande porte, como ovelhas e porcos, são as principais escolhas para o estabelecimento de modelos de ECMO devido aos seus parâmetros fisiológicos muito semelhantes aos dos humanos ^9,10. No entanto, os modelos anteriores de ECMO de animais de grande porte tinham um tempo de manutenção inferior a 24 h, tornando difícil avaliar de forma abrangente o impacto da ECMO no sistema de coagulação¹¹. Portanto, é necessário estabelecer modelos de grandes animais de ECMO de longo prazo para explorar minuciosamente os mecanismos fisiopatológicos da ECMO. A utilização de modelos animais de grande porte a longo prazo para investigar os efeitos da ECMO no sistema de coagulação pode fornecer evidências mais robustas para a prática clínica.

Este estudo tem como objetivo estabelecer um modelo de ECMO V-A e V-V acordado de longo prazo (7 dias) em ovinos saudáveis. O foco central de todo o estabelecimento e avaliação do modelo é o manejo da anticoagulação.

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Protocolo

Este protocolo experimental recebeu aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Fuwai (nº 0101-2-20-HX(X)). Todos os procedimentos seguiram as diretrizes descritas no Guia do National Institutes of Health para o Uso e Cuidado de Animais de Laboratório. O experimento ocorreu no Laboratório Chave de Pesquisa e Avaliação Pré-clínica de Materiais de Implantes Cardiovasculares de Pequim, Centro Experimental Animal do Hospital Fuwai (registro nº. CNAS LA0009). Ovinos saudáveis que atenderam aos padrões de quarentena exigidos no Centro Experimental Animal do Hospital Fuwai foram utilizados no estudo. Além disso, esta pesquisa seguiu as diretrizes de Pesquisa Animal: Relato de Experimentos In Vivo . Ovelhas Han machos de cauda pequena com uma faixa de peso de 50-65 kg e uma faixa etária de 12-24 meses (ver Tabela de Materiais) foram alojadas em um ambiente específico livre de patógenos com livre acesso a comida e água por pelo menos uma semana antes da cirurgia. Os ovinos foram divididos aleatoriamente em dois grupos, cada um composto por 5 indivíduos: o grupo ECMO Veno-Arterial (VA ECMO) e o grupo ECMO Veno-Venoso (VV ECMO). A seleção de ovinos saudáveis foi justificada pela necessidade de avaliar com precisão os efeitos do suporte de ECMO no organismo. Os equipamentos e reagentes utilizados no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação animal

1. Antes do procedimento cirúrgico, jejuar ovelhas adultas saudáveis por 48 h e privá-las de água por 12 h.
2. Esterilize os instrumentos cirúrgicos e os parâmetros de ECMO antes da cirurgia. Garantir o fornecimento de equipamentos de proteção individual para todos os membros da equipe cirúrgica, incluindo toucas cirúrgicas, máscaras descartáveis, trajes cirúrgicos limpos, capas de sapatos, roupas cirúrgicas estéreis e luvas estéreis.
3. Administre uma injeção de propofol (5 mg / kg) através da veia auricular. Conforme descrito anteriormente, fixe o manguito de pressão arterial na coxa e coloque eletrodos de eletrocardiograma em todos os quatro membros. Conecte o manguito de pressão arterial e os eletrodos de ECG ao monitor médico para ECG e medição não invasiva da pressão arterial¹².
4. Insira um tubo endotraqueal de lúmen único na traqueia e conecte o tubo ao ventilador com o modo controlado por volume. Defina os parâmetros da seguinte forma: volume corrente: 8-10 mL/kg, frequência respiratória: 12-20/min, fração inicial de oxigênio inspiratório (FiO2): 60%.
5. Administre uma combinação de anestesia intravenosa (propofol, 8-10 mg / kg / h) e anestesia inalatória (isoflurano 2% -3%) para manutenção da anestesia. Forneça flurbiprofeno intermitente (1-2 mg / kg) por via intravenosa para analgesia intraoperatória.
6. Coloque as ovelhas na mesa de operação e prenda seus membros com um cinto de pano flexível. Prossiga para isolar a artéria carótida esquerda e a veia jugular e insira um cateter venoso central de lúmen único (18 Fr) e um cateter venoso central de lúmen triplo (7 Fr), respectivamente. Conecte o cateter 18 G na artéria carótida esquerda ao monitor médico para monitoramento hemodinâmico. Conecte o cateter venoso central de lúmen triplo de 7 Fr na veia jugular esquerda à bomba de infusão e ao monitor médico para administração simultânea de fluido intravenoso, injeção de medicamentos e monitoramento da pressão venosa central. Faça todas as conexões usando as torneiras de três vias. Retirar amostras de sangue venoso ou arterial através de uma torneira de três vias.
   NOTA: Após a inserção do cateter, ligue o cateter e o vaso com suturas cirúrgicas 2-0.
7. Exponha a artéria e a veia jugular direita. Obtenha anticoagulação sistêmica com um bolus de heparina (120 UI / kg) através da veia jugular direita.
   NOTA: O tempo de coagulação ativado alvo (ACT) para canulação é superior a 250s.

2. Canulação

1. Estabelecimento do circuito de ECMO VA: Insira um cateter arterial (18 Fr) através da artéria carótida direita a uma profundidade de 10-15 cm e um cateter venoso (24 Fr) através da veia jugular externa direita até o átrio direito.
2. Estabelecimento do circuito de ECMO V-V: Exponha a veia jugular externa direita e insira um cateter de duplo lúmen (23 Fr) através da veia jugular externa direita.
   NOTA: Durante este procedimento, mantenha a pressão arterial e a frequência cardíaca dos ovinos dentro de ±20% dos valores basais. Mantenha a pressão parcial de dióxido de carbono arterial (PaCO2) entre 35-40 mmHg. Certifique-se de que a pressão parcial do dióxido de carbono expirado (EtCO2) permaneça entre 35-45 mmHg. Ajuste a profundidade da anestesia ao encontrar variações na pressão arterial e na frequência cardíaca em ovelhas. Se isso se mostrar ineficaz ou em emergências, considere o uso de drogas vasoativas. Mantenha a PaCO2 e a EtCO2 dentro dos valores normais ajustando os parâmetros do ventilador, com foco principal no volume corrente e na frequência respiratória.
3. Na ECMO V-V, passe a ponta do cateter pelo átrio direito (AD) e posicione-o dentro da veia cava inferior (VCI). Direcione a porta de saída do cateter de duplo lúmen em direção à válvula tricúspide (confirme a posição com assistência de ultrassom).
   NOTA: Após a inserção do cateter, ligue o cateter e o vaso com suturas cirúrgicas 2-0. Feche a incisão da pele usando suturas cirúrgicas 4-0.

3. Início da ECMO

1. Conecte todos os dispositivos ECMO seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais). Certifique-se de que não haja vazamentos.
   NOTA: Siga os princípios assépticos durante a conexão.
2. A solução de priming consiste em solução salina normal (1000 mL) com 2000 UI de heparina. Depois de infundir manualmente a solução de escorva no circuito de ECMO e garantir que não haja bolhas de ar no circuito, ligue a bomba centrífuga para escorva (1000-1500 rpm).
3. Após a conclusão da escorva, desligue a bomba centrífuga. Conecte o cateter de entrada à entrada da bomba centrífuga e conecte o cateter de saída à saída do oxigenador. Faça todas as conexões usando as torneiras de três vias. Esgote o ar na ligação através da torneira de três vias. Conecte a fonte de oxigênio ao sistema ECMO, garantindo o fluxo correto de oxigênio. Em seguida, inicie a bomba centrífuga para execução de ECMO. Defina o fluxo inicial da bomba em 2.0 L/min com uma velocidade de bomba de 3000 rpm.
4. Meio loop da linha do tubo do circuito ECMO ao redor do pescoço da ovelha para evitar deslocamento ou dobra.

4. Manejo e monitoramento pós-operatório

1. Transfira as ovelhas para uma gaiola metabólica e prenda as ovelhas adequadamente após concluir a operação.
   NOTA: Prenda a cabeça e os ombros das ovelhas com ênfase especial na prevenção do deslocamento ou dobra da cânula. Reduza gradualmente a profundidade da anestesia. Garantir a proteção pessoal dos membros da equipe de enfermagem pós-operatória usando equipamentos de proteção (roupas estéreis, luvas, máscaras e toucas).
2. Ao garantir resultados estáveis de respiração e gasometria sanguínea, remova o tubo endotraqueal.
3. Nas primeiras 24 horas após a cirurgia, administrar flurbiprofeno (1-2 mg/kg) e dexmedetomidina (0,2-0,3 μg/kg·h) por via intravenosa para sedação e alívio da dor.
   NOTA: Após as primeiras 24 horas, considere medicamentos sedativos e analgésicos se houver agitação e flutuação da pressão arterial em ovelhas devido à dor pós-operatória.
4. Dentro da gaiola de monitoramento, certifique-se de que as ovelhas se movam livremente dentro de um determinado alcance e tenham acesso irrestrito a uma quantidade adequada de ração e água.
5. Mantenha uma verificação contínua em tempo real dos sinais vitais fundamentais (frequência cardíaca e pressão arterial) junto com os parâmetros hidráulicos da ECMO (fluxo da bomba, velocidade da bomba, pressão pré-bomba, pressão pós-bomba e pressão pós-oxigenador).
   NOTA: Defina os parâmetros-alvo para o gerenciamento de ECMO (fluxo da bomba: 2.0-2.5 L/min, velocidade da bomba: 3000-3500 rpm, vazão de oxigênio: 1.0-1.5 L/min com FiO2 de 50%-80%). Ajuste os parâmetros acima de acordo com os resultados da gasometria.
6. Meça a gasometria e o ACT a cada 6 h e monitore o hemograma, a química do sangue e os testes de coagulação diariamente. Ajuste a estratégia de anticoagulação com base nos indicadores de coagulação.
   NOTA: A meta do ACT: 220-250 s.
7. Ajuste as infusões intravenosas com base no equilíbrio hídrico para manter a pressão venosa central (PVC) entre 5-12 cm H₂O. Administre cefuroxima sódica (1,5 g, i.v., b.i.d.) diariamente para prevenção de infecções. Realize a desinfecção diária da incisão e monitore de perto os sinais de infecção ou sangramento.

5. Eutanásia

1. Após um período experimental de 7 dias, remova o circuito de ECMO.
2. Administre uma injeção intravenosa de cloreto de potássio (100 mg / kg) para eutanásia sob sedação com propofol (20 mg / kg).
   NOTA: Após a eutanásia, os principais órgãos (coração, rim, pulmão, fígado, cérebro e intestino) foram coletados e verificados visualmente quanto à presença de infartos, hemorragias ou danos evidentes. Todas as lesões orgânicas foram registradas em detalhes. Em seguida, os órgãos foram cortados em pequenos pedaços e fixados em formaldeído a 4%, incluídos em parafina e divididos em cortes de 4 μm para coloração de hematoxilina-eosina (HE)¹³. Realize o exame histológico para seções de HE sob um microscópio óptico por pelo menos dois patologistas de forma independente.

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Resultados

Um total de dez ovinos foram avaliados durante todo o experimento, com cinco ovinos em cada grupo (Tabela 1). Após o início da ECMO, todos os ovinos se recuperaram da anestesia e permaneceram acordados por 7 dias. Em ambos os grupos, o fluxo de ECMO excedeu 1,8 L/min. No grupo ECMO V-V, o fluxo oscilou em torno de 1,8 L/min, enquanto no grupo ECMO V-A, variou de 2,3 L/min a 1,8 L/min (Figura 1A). Os sinais vitais de cada ovelha permanecera...

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Discussão

Este estudo descreve o procedimento para estabelecer modelos robustos de sobrevivência de longo prazo para ECMO V-V e V-A em ovinos. Todos os animais sobreviventes exibiram sinais vitais estáveis e não ocorreram eventos graves de sangramento ou coagulação. O fluxo de ECMO e o desempenho da oxigenação permaneceram estáveis, sem lesões patológicas importantes observadas. O estudo fornece informações detalhadas sobre o manejo da anticoagulação.

O ma...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
ACT analyzer	Hemochron, USA	Jr Signature
Anaesthesia machine	Drager, Germany	Primus
Arterial catheter	Edwards Lifescience, USA	18-Fr	Provide return access into an artery for VA-EMCO
Blood chemistry analyzer	IDEXX Laboratories, USA	Catalyst One
Blood gas analyzer	Abbott, USA	Abbott i-STAT1
Centrifugal pump	Jiangsu STMed Technologies, China	STM CP-24 I
Centrifugal pump drive and console	Jiangsu STMed Technologies, China	OASSIST STM001
Coagulation test analyzer	Beijing Succeeder Technology, China	SF-8050
Complete blood count analyzer	Siemens Healthcare, Germany	ADVIA 2120i
Dual-channel micro-injection pump	Zhejiang Smith Medical Instrument, China	WZS-50F6
Dual-lumen catheter	MAQUET Avalon Elite, Germany	23-Fr	Provide return and drainage accesses into the right external jugular vein for VV-ECMO
Flurbiprofen	Beijing Tide Pharmaceutical Co., Ltd., China	5ml: 50mg
GraphPad software	GraphPad Software, USA	GraphPad Prism v9.0	Statistical analysis
Heparin	Shanghai Shangyao No.1 Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd., China	2ml: 12500IU
High-frequency electrosurgical	COVIDIEN, USA	Force F
Multi-parameter medical monitor	Philips, Netherlands	MP60
Oxygenator kit	Medos, Germany	Hilite 7000LT
Oxygenator kit	Maquet, Germany	BE-PLS 2050
Propofol	Xi’an Libang Pharmaceutical Co. Ltd, China	20ml: 0.2g
Single-lumen central venous catheter	TuoRen, China	18Fr	Insert in left carotid artery  for hemodynamic monitoring and blood sampling.
Small Tail Han sheep	Jinyutongfeng Commercial and Trade Co. Ltd, China	weight: 50-65 kg, age: 12-24 months
Triple-lumen central venous catheter	TuoRen, China	7Fr	Insert in left jugular vein for intravenous fluid administration, drug injection, and blood sampling.
Ultrasound machine	GE, USA	E9
Venous catheter	Edwards Lifescience, USA	24-Fr	Provide the drainage access into a vein for VA-ECMO
Ventilator	Drager, Germany	Savina