Auswirkungen der extrakorporalen Membranoxygenierung auf das Gerinnungssystem

Zusammenfassung

Wir stellen ein Protokoll zur Etablierung eines langfristigen Wachmodells für die extrakorporale Membranoxygenierung (ECMO) bei Schafen vor. Besonderes Augenmerk wird auf das Management und die Bewertung des Gerinnungssystems während des ECMO-Modells gelegt.

Zusammenfassung

Ziel dieser Studie war es, die Auswirkungen einer langzeitwachen extrakorporalen Membranoxygenierung (ECMO) auf das Gerinnungssystem in einem Schafmodell zu untersuchen. Insgesamt wurden zehn gesunde Schafe in die Studie eingeschlossen, mit 5 Schafen in jeder Gruppe. In der veno-arteriellen ECMO (V-A ECMO)-Gruppe wurde eine Kanülierung in der rechten Halsschlagader und in der rechten Vena jugularis externa durchgeführt. In der veno-venösen ECMO (V-V ECMO)-Gruppe wurde ein Dual-Lumen-Katheter verwendet, um in die rechte Vena jugularis externa eingeführt zu werden. Nach Beginn der ECMO wurden die Schafe aus der Narkose erholt und blieben 7 Tage lang wach. Das Ziel für die aktivierte Gerinnungszeit (ACT) wurde auf 220-250 s festgelegt. In beiden Gruppen schwankte die tatsächliche ACT um 250 s, wobei die Heparindosis allmählich anstieg und am Ende der Experimente fast 60 IE/kg/min erreichte. Darüber hinaus waren die Werte für die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (APTT) und die Thrombinzeit (TT) in der V-A ECMO-Gruppe signifikant höher als in der V-V ECMO-Gruppe, obwohl sie die gleichen Heparindosen erhielten. Obwohl die Labortestergebnisse in einem normalen und vernünftigen Bereich schwankten, wurden am Ende der Studie in beiden Gruppen Infarktherde in den Nieren beobachtet.

Einleitung

Die extrakorporale Membranoxygenierung (ECMO) dient als lebensrettende Intervention und bietet schwerkranken Patienten kardiopulmonale Unterstützung. Es wird in zwei Hauptformen eingeteilt: veno-arterielle ECMO (V-A ECMO) und veno-venöse ECMO (V-V ECMO^)1,2. V-A ECMO wird bei Patienten mit Kreislaufversagen eingesetzt, während V-V ECMO bei Patienten mit Atemversagen, aber ohne schwere kardiovaskuläre Dysfunktion bevorzugt wird ^3,4.

Thrombosen und Blutungen sind häufige Komplikationen bei ECMO-Patienten⁵. Der ECMO-Kreislauf setzt Blut künstlichen Oberflächen aus und löst so komplexe Gerinnungsreaktionen aus⁶. Diese Prozesse können zu Schädigungen des Endothels und Mikrozirkulationsstörungen führen, was zu einer nachfolgenden Funktionsstörung lebenswichtiger Organe führt ^7,8. Daher wird ein wirksames systemisches Antikoagulationsmanagement für ECMO-Patienten als entscheidend angesehen. Trotzdem gibt es nach wie vor einen Mangel an Evidenz für Antikoagulationsstrategien in verschiedenen ECMO-bezogenen klinischen Umgebungen.

Die Etablierung eines stabilen ECMO-Tiermodells kann Einblicke in die Auswirkungen von ECMO auf den Körper geben und wesentlich zur Optimierung von ECMO-Managementstrategien, zur Reduzierung von ECMO-bedingten Komplikationen und zur Verbesserung der Patientenergebnisse in der klinischen Praxis beitragen. Große Tiere wie Schafe und Schweine sind aufgrund ihrer physiologischen Parameter, die denen des Menschen sehr ähnlich sind, die erste Wahl für die Erstellung von ECMO-Modellen ^9,10. Frühere ECMO-Modelle für Großtiere hatten jedoch eine Wartungszeit von weniger als 24 Stunden, was es schwierig machte, den Einfluss von ECMO auf das Gerinnungssystem umfassend zu bewerten¹¹. Daher besteht die Notwendigkeit, langfristige ECMO-Großtiermodelle zu etablieren, um die pathophysiologischen Mechanismen der ECMO gründlich zu erforschen. Die Verwendung langfristiger Großtiermodelle zur Untersuchung der Auswirkungen von ECMO auf das Gerinnungssystem kann robustere Beweise für die klinische Praxis liefern.

Ziel dieser Studie ist es, ein langfristiges (7 Tage) waches V-A- und V-V-ECMO-Modell bei gesunden Schafen zu etablieren. Im Mittelpunkt der gesamten Modelletablierung und -evaluation steht das Management der Antikoagulation.

Protokoll

Dieses Versuchsprotokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee des Fuwai Hospital (Nr. 0101-2-20-HX(X)) genehmigt. Alle Verfahren entsprachen den Richtlinien des National Institutes of Health's Guide for the Use and Care of Laboratory Animals. Das Experiment fand im Beijing Key Laboratory of Pre-clinical Research and Evaluation for Cardiovascular Implant Materials, Animal Experimental Center des Fuwai Hospital (Registrierungs-Nr. CNAS LA0009). In der Studie wurden gesunde Schafe verwendet, die die erforderlichen Quarantänestandards im Tierversuchszentrum des Fuwai Krankenhauses erfüllten. Darüber hinaus folgte diese Forschung den Richtlinien für Tierversuche: Berichterstattung über In-vivo-Versuche . Männliche Kleinschwanz-Han-Schafe mit einem Gewicht von 50-65 kg und einer Altersspanne von 12-24 Monaten (siehe Materialtabelle) wurden mindestens eine Woche vor der Operation in einer spezifisch pathogenfreien Umgebung mit freiem Zugang zu Futter und Wasser untergebracht. Die Schafe wurden nach dem Zufallsprinzip in zwei Gruppen eingeteilt, die jeweils aus 5 Individuen bestanden: der Veno-Arteriellen ECMO (V-A ECMO) Gruppe und der Veno-Venösen ECMO (V-V ECMO) Gruppe. Die Auswahl gesunder Schafe wurde durch die Notwendigkeit gerechtfertigt, die Auswirkungen der ECMO-Unterstützung auf den Organismus genau zu beurteilen. Die in der Studie verwendeten Geräte und Reagenzien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Tiere

1. Vor dem chirurgischen Eingriff fasten Sie gesunde erwachsene Schafe für 48 Stunden und entziehen Sie ihnen 12 Stunden lang das Wasser.
2. Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente und ECMO-Parameter vor der Operation. Stellen Sie sicher, dass allen Mitgliedern des Operationsteams persönliche Schutzausrüstung zur Verfügung gestellt wird, einschließlich OP-Hauben, Einweg-Gesichtsmasken, sauberer OP-Kleidung, Schuhüberzieher, steriler Operationskleidung und steriler Handschuhe.
3. Verabreichen Sie eine Propofol-Injektion (5 mg/kg) durch die Ohrvene. Befestigen Sie wie zuvor beschrieben die Blutdruckmanschette am Oberschenkel und platzieren Sie Elektrokardiogramm-Elektroden an allen vier Gliedmaßen. Verbinden Sie die Blutdruckmanschette und die EKG-Ableitungen mit dem medizinischen Monitor für EKG und nicht-invasive Blutdruckmessung¹².
4. Führen Sie einen einlumigen Endotrachealtubus in die Luftröhre ein und verbinden Sie den Schlauch mit dem volumengesteuerten Modus mit dem Beatmungsgerät. Stellen Sie die Parameter wie folgt ein: Atemzugvolumen: 8-10 ml/kg, Atemfrequenz: 12-20/min, Anfangsanteil an Inspirationsauerstoff (FiO2): 60%.
5. Verabreichen Sie eine Kombination aus intravenöser Anästhesie (Propofol, 8-10 mg/kg/h) und Inhalationsanästhesie (Isofluran 2%-3%) zur Aufrechterhaltung der Anästhesie. Intermittierendes Flurbiprofen (1-2 mg/kg) intravenös zur intraoperativen Analgesie verabreichen.
6. Legen Sie die Schafe auf den Operationstisch und sichern Sie ihre Gliedmaßen mit einem flexiblen Stoffgurt. Fahren Sie mit der Isolierung der linken Halsschlagader und der Halsvene fort und legen Sie einen einlumigen Zentralvenenkatheter (18 Fr) bzw. einen dreilumigen Zentralvenenkatheter (7 Fr) an. Verbinden Sie den 18-G-Katheter an der linken Halsschlagader mit dem medizinischen Monitor für die hämodynamische Überwachung. Verbinden Sie den 7 Fr dreilumigen Zentralvenenkatheter an der linken Jugularvene mit der Infusionspumpe und dem medizinischen Monitor für die gleichzeitige intravenöse Verabreichung von Flüssigkeit, die Injektion von Medikamenten und die Überwachung des zentralvenösen Drucks. Stellen Sie alle Verbindungen mit den Dreiwegehähnen her. Entnahme von venösen oder arteriellen Blutproben über einen Drei-Wege-Absperrhahn.
   HINWEIS: Nach dem Einführen des Katheters Ligaten Sie den Katheter und das Gefäß mit 2-0 chirurgischen Nähten.
7. Legen Sie die rechte Halsschlagader und Vene frei. Erreichen Sie eine systemische Antikoagulation mit einem Heparinbolus (120 IE/kg) durch die rechte Halsvene.
   HINWEIS: Die angestrebte aktivierte Gerinnungszeit (ACT) für die Kanülierung liegt über 250 s.

2. Kanülierung

1. Einrichtung eines V-A ECMO-Kreislaufs: Ein arterieller Katheter (18 Fr) wird durch die rechte Halsschlagader bis zu einer Tiefe von 10-15 cm und ein Venenkatheter (24 Fr) durch die rechte Vena jugularis externa in den rechten Vorhof eingeführt.
2. Einrichtung eines V-V ECMO-Kreislaufs: Legen Sie die rechte Vena jugularis externa frei und führen Sie einen Katheter mit zwei Lumen (23 Fr) durch die rechte Vena jugularis externa ein.
   HINWEIS: Halten Sie während dieses Verfahrens den Blutdruck und die Herzfrequenz von Schafen innerhalb von ±20 % der Ausgangswerte. Halten Sie den Partialdruck von arteriellem Kohlendioxid (PaCO2) zwischen 35-40 mmHg. Stellen Sie sicher, dass der Partialdruck von endtidalem Kohlendioxid (EtCO2) zwischen 35 und 45 mmHg bleibt. Passen Sie die Anästhesietiefe an, wenn Sie bei Schafen auf Schwankungen des Blutdrucks und der Herzfrequenz stoßen. Wenn sich dies als unwirksam erweist oder in Notfällen, sollten Sie die Einnahme von vasoaktiven Medikamenten in Betracht ziehen. Halten Sie PaCO2 und EtCO2 innerhalb normaler Werte, indem Sie die Beatmungsparameter anpassen, wobei der Schwerpunkt auf dem Atemzugvolumen und der Atemfrequenz liegt.
3. Bei V-V ECMO führen Sie die Katheterspitze durch den rechten Vorhof (RA) und positionieren sie in der unteren Hohlvene (IVC). Richten Sie die Ausströmöffnung des zweilumigen Katheters auf die Trikuspidalklappe (Position mit Ultraschallunterstützung bestätigen).
   HINWEIS: Nach dem Einführen des Katheters Ligaten Sie den Katheter und das Gefäß mit 2-0 chirurgischen Nähten. Verschließen Sie den Hautschnitt mit 4-0 chirurgischen Nähten.

3. Einleitung der ECMO

1. Schließen Sie alle ECMO-Geräte gemäß den Anweisungen des Herstellers an (siehe Materialtabelle). Stellen Sie sicher, dass keine Lecks vorhanden sind.
   HINWEIS: Befolgen Sie während der Verbindung die aseptischen Prinzipien.
2. Die Grundierungslösung besteht aus normaler Kochsalzlösung (1000 ml) und 2000 IE Heparin. Nachdem Sie die Ansauglösung manuell in den ECMO-Kreislauf infundiert und sichergestellt haben, dass keine Luftblasen im Kreislauf vorhanden sind, starten Sie die Kreiselpumpe zum Ansaugen (1000-1500 U/min).
3. Schalten Sie nach Abschluss des Ansaugens die Kreiselpumpe aus. Verbinden Sie den Zuflusskatheter mit dem Einlass der Kreiselpumpe und verbinden Sie den Auslasskatheter mit dem Ausgang des Oxygenators. Stellen Sie alle Verbindungen mit den Dreiwegehähnen her. Lassen Sie die Luft am Anschluss durch den Dreiwege-Absperrhahn ab. Schließen Sie die Sauerstoffquelle an das ECMO-System an, um einen korrekten Sauerstofffluss zu gewährleisten. Starten Sie dann die Kreiselpumpe für den ECMO-Lauf. Stellen Sie den anfänglichen Pumpendurchfluss auf 2,0 l/min bei einer Pumpendrehzahl von 3000 U/min ein.
4. Legen Sie die Rohrleitung des ECMO-Schaltkreises halb um den Hals des Schafs, um ein Verschieben oder Abknicken zu verhindern.

4. Postoperatives Management und Monitoring

1. Bringen Sie das Schaf in einen Stoffwechselkäfig und halten Sie das Schaf nach Abschluss des Vorgangs entsprechend fest.
   HINWEIS: Sichern Sie den Kopf und die Schultern des Schafes mit besonderem Augenmerk darauf, ein Verschieben oder Knicken der Kanüle zu verhindern. Reduzieren Sie allmählich die Anästhesietiefe. Gewährleisten Sie den persönlichen Schutz der Mitglieder des postoperativen Pflegeteams durch das Tragen von Schutzausrüstung (sterile Kleidung, Handschuhe, Masken und Mützen).
2. Um stabile Ergebnisse der Atmungs- und Blutgasanalyse zu gewährleisten, entfernen Sie den Endotrachealtubus.
3. In den ersten 24 Stunden nach der Operation ist Flurbiprofen (1-2 mg/kg) und Dexmedetomidin (0,2-0,3 μg/kg/h) intravenös zur Sedierung und Schmerzlinderung zu verabreichen.
   HINWEIS: Nach den ersten 24 Stunden sollten Beruhigungsmittel und Analgetika in Betracht gezogen werden, wenn es bei Schafen aufgrund postoperativer Schmerzen zu Unruhe und Blutdruckschwankungen kommt.
4. Im Überwachungskäfig ist darauf zu achten, dass sich die Schafe in einem bestimmten Bereich frei bewegen und uneingeschränkten Zugang zu einer angemessenen Menge an Futter und Wasser haben.
5. Kontrollieren Sie kontinuierlich in Echtzeit die grundlegenden Vitalparameter (Herzfrequenz und arterieller Blutdruck) sowie die hydraulischen ECMO-Parameter (Pumpendurchfluss, Pumpendrehzahl, Druck vor der Pumpe, Druck nach der Pumpe und Druck nach dem Oxygenator).
   HINWEIS: Legen Sie die Zielparameter für das ECMO-Management fest (Pumpendurchfluss: 2,0-2,5 l/min, Pumpendrehzahl: 3000-3500 U/min, Sauerstoffdurchfluss: 1,0-1,5 l/min mit einem FiO2 von 50%-80%). Passen Sie die oben genannten Parameter entsprechend den Blutgasergebnissen an.
6. Messen Sie alle 6 Stunden Blutgase und ACT und überwachen Sie täglich das Blutbild, die Blutchemie und die Gerinnungstests. Passen Sie die Antikoagulationsstrategie auf der Grundlage von Gerinnungsindikatoren an.
   HINWEIS: Das angestrebte ACT-Ziel: 220-250 s.
7. Passen Sie die intravenösen Infusionen basierend auf dem Flüssigkeitshaushalt an, um den zentralvenösen Druck (CVP) zwischen 5-12 cm H₂O aufrechtzuerhalten. Verabreichen Sie täglich Cefuroxim-Natrium (1,5 g, i.v., b.i.d.) zur Infektionsprävention. Führen Sie täglich eine Inzisionsdesinfektion durch und überwachen Sie sie genau auf Anzeichen von Infektionen oder Blutungen.

5. Euthanasie

1. Entfernen Sie nach einer 7-tägigen Versuchsphase den ECMO-Schaltkreis.
2. Verabreichen Sie eine intravenöse Injektion von Kaliumchlorid (100 mg/kg) zur Euthanasie unter Sedierung mit Propofol (20 mg/kg).
   HINWEIS: Nach der Euthanasie wurden die Hauptorgane (Herz, Niere, Lunge, Leber, Gehirn und Darm) entnommen und visuell auf das Vorhandensein von Infarkten, Blutungen oder offensichtlichen Schäden untersucht. Alle Organverletzungen wurden detailliert erfasst. Dann wurden die Organe in kleine Stücke geschnitten und in 4 % Formaldehyd fixiert, mit Paraffin eingebettet und in 4-μm-Abschnitte für die Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung¹³ unterteilt. Führen Sie die histologische Untersuchung von HE-Schnitten unter einem Lichtmikroskop durch mindestens zwei Pathologen unabhängig voneinander durch.

Ergebnisse

Insgesamt wurden während des gesamten Versuchs zehn Schafe bewertet, davon fünf Schafe in jeder Gruppe (Tabelle 1). Nach Beginn der ECMO erholten sich alle Schafe von der Narkose und blieben 7 Tage lang wach. In beiden Gruppen lag der ECMO-Durchfluss bei über 1,8 l/min. In der V-V ECMO-Gruppe schwankte der Durchfluss um 1,8 l/min, während er in der V-A ECMO-Gruppe zwischen 2,3 l/min und 1,8 l/min lag (Abbildung 1A). Die Vitalparameter je...

Diskussion

Diese Studie skizziert das Verfahren zur Etablierung robuster, langfristiger Überlebensmodelle für V-V und V-A ECMO bei Schafen. Alle überlebenden Tiere zeigten stabile Vitalfunktionen, und es traten keine schweren Blutungen oder Gerinnungsereignisse auf. Der ECMO-Fluss und die Oxygenierungsleistung blieben stabil, es wurden keine größeren pathologischen Verletzungen beobachtet. Die Studie liefert detaillierte Informationen zum Antikoagulationsmanagement.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
ACT analyzer	Hemochron, USA	Jr Signature
Anaesthesia machine	Drager, Germany	Primus
Arterial catheter	Edwards Lifescience, USA	18-Fr	Provide return access into an artery for VA-EMCO
Blood chemistry analyzer	IDEXX Laboratories, USA	Catalyst One
Blood gas analyzer	Abbott, USA	Abbott i-STAT1
Centrifugal pump	Jiangsu STMed Technologies, China	STM CP-24 I
Centrifugal pump drive and console	Jiangsu STMed Technologies, China	OASSIST STM001
Coagulation test analyzer	Beijing Succeeder Technology, China	SF-8050
Complete blood count analyzer	Siemens Healthcare, Germany	ADVIA 2120i
Dual-channel micro-injection pump	Zhejiang Smith Medical Instrument, China	WZS-50F6
Dual-lumen catheter	MAQUET Avalon Elite, Germany	23-Fr	Provide return and drainage accesses into the right external jugular vein for VV-ECMO
Flurbiprofen	Beijing Tide Pharmaceutical Co., Ltd., China	5ml: 50mg
GraphPad software	GraphPad Software, USA	GraphPad Prism v9.0	Statistical analysis
Heparin	Shanghai Shangyao No.1 Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd., China	2ml: 12500IU
High-frequency electrosurgical	COVIDIEN, USA	Force F
Multi-parameter medical monitor	Philips, Netherlands	MP60
Oxygenator kit	Medos, Germany	Hilite 7000LT
Oxygenator kit	Maquet, Germany	BE-PLS 2050
Propofol	Xi’an Libang Pharmaceutical Co. Ltd, China	20ml: 0.2g
Single-lumen central venous catheter	TuoRen, China	18Fr	Insert in left carotid artery  for hemodynamic monitoring and blood sampling.
Small Tail Han sheep	Jinyutongfeng Commercial and Trade Co. Ltd, China	weight: 50-65 kg, age: 12-24 months
Triple-lumen central venous catheter	TuoRen, China	7Fr	Insert in left jugular vein for intravenous fluid administration, drug injection, and blood sampling.
Ultrasound machine	GE, USA	E9
Venous catheter	Edwards Lifescience, USA	24-Fr	Provide the drainage access into a vein for VA-ECMO
Ventilator	Drager, Germany	Savina