使用自动三维神经元重建软件进行树突状脊柱定量

摘要

树突棘是大多数兴奋性突触的突触后隔室。树突状脊柱形态的改变发生在神经发育、衰老、学习以及许多神经和精神疾病的过程中，这强调了可靠的树突状脊柱分析的重要性。该协议描述了使用自动三维神经元重建软件准确且可重复地量化树突棘形态。

摘要

突触连接允许神经元之间交换和处理信息。兴奋性突触的突触后部位通常形成于树突棘上。树突棘是以突触可塑性、神经发育以及神经和精神疾病为中心的研究中非常有趣的结构。树突棘在其生命周期中会发生结构修饰，其特性（如脊柱总数、树突棘大小和形态学定义的亚型）会随着不同的过程而变化。描述调节树突棘这些结构改变的分子机制依赖于形态学测量。这需要准确且可重复的树突棘分析来提供实验证据。本研究概述了使用 Neurolucida 360（自动三维神经元重建软件）进行树突棘定量和分类的详细方案。该协议允许确定关键的树突状脊柱特性，例如总脊柱密度、脊柱头部体积和脊柱亚型的分类，从而能够有效分析树突状脊柱结构表型。

引言

树突棘是树突的突起，通常包括谷氨酸能突触的突触后部位 ^1,2。树突棘在突触可塑性领域特别有趣。当突触强度发生变化时，棘通常会发生变化，在长期突触增强时变得更大更强，在长期突触抑制中变得更小更弱 3,4,5,6,7。除了突触可塑性之外，树突棘的轮廓在整个生命周期中都会发生变化。在早期发育中，有一段树突状脊柱形成和生长的时期，然后是树突状脊柱修剪，直到达到稳定状态 ^8,9,10。在衰老的大脑中，脊柱缺失伴随着大脑萎缩和认知能力下降¹¹。此外，许多神经、神经退行性和精神疾病的特征是异常的树突棘。受精神分裂症影响的个体的多个大脑区域的树突棘较少，可能是由于突触修剪改变所致

研究方案

所有动物程序均遵循美国国立卫生研究院在校内研究中使用动物指南，并得到美国国家心理健康研究所动物护理和使用委员会的批准。

1. 固定海马切片的制备

1. 通过腹膜内注射氯胺酮/甲苯噻嗪（氯胺酮：100 mg/kg;甲苯噻嗪：8 mg/kg）。通过捏尾验证麻醉并将鼠标贴在灌注板上。
2. 使用大型手术剪刀去除胸部的皮肤和毛皮，以便更容易地看到下面的胸腔。
3. 在胸腔宽度以下进行水平切割，避开肝脏和隔膜。使用细镊子，向上拉剑突并切开胸腔的每个外侧。将胸腔向上翻转到颈部区域，并使用止血钳夹住到位。
4. 将 21 G 蝶针插入心脏左心室，开始以大约 5 mL/min 的速度灌注室温 1x PBS。用小手术剪刀在右心房上做一个小切口。用 PBS 灌注，直到离开心房的溶液变清。
5. 关闭灌注泵，确保没有气泡进入管路。将 PBS 中的管路放入冰冷的 4% 多聚甲醛 （PFA） 中的 PBS 中。以 5 mL/min 的速率灌注 PFA，直到动物完全变硬，大约 25 mL。
   注意：确保 PFA 是新鲜的（如果原液储存在 1°C 下，则不超过 4 周）以实现最佳固定。
6. 用小手术剪刀从颅骨表面去除皮肤。用小手术剪刀沿着颅骨的中央裂缝做一个矢状中段的切口。在嗅球和小脑上方进行侧切。

讨论

该协议详细介绍了样品制备、成像以及使用三维重建软件对树突棘进行定量和分类的过程的具体步骤。该软件是一个强大的工具，能够生成强大的结构数据，有助于各种研究。在整个过程中，有一些关键步骤可以减轻该协议的方法负担并提高数据的整体输出。标记树突棘的方法是研究人员在开始该协议之前首先应该考虑的事情之一。标记方法不足可能会导致脊柱定量问题.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
518F Immersion Oil	Zeiss	444960-0000-000
Cryostat	Leica	CM3050S	For slice preparation
Fine Forceps	FST	11150-10
Hemostat Forceps	FST	13020-12
Large Surgical Scissors	FST	14002-16
LSM 880 Confocal Microscope	Zeiss	LSM 880
Microscope Cover Glass	Fisherbrand	12-541-035
Mini-Peristaltic Pump II	Harvard Apparatus	70-2027	For perfusions
Neurolucida 360	MBF Bioscience	v2022.1.1	Spine Analysis Software
Neurolucida Explorer	MBF Bioscience	v2022.1.1	Spine Analysis Software
OCT Compound	Sakura Finetek	4583	For cryostat sectioning
Paraformaldehyde (37%)	Fisherbrand	F79-1
Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC	Zeiss	440762-9904-000
Scalpel Blade	FST	10022-00
Small Surgical Scissors	FST	14060-09
Spatula	FST	10091-12
Sucrose	FIsherbrand	S5-500
Superfrost Plus Microslides	Diagger	ES4951+
Vectashield HardSet Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1400-10