Quantification de la colonne dendritique à l’aide d’un logiciel de reconstruction automatique de neurones tridimensionnels

Résumé

Les épines dendritiques sont des compartiments post-synaptiques de la plupart des synapses excitatrices. Des altérations de la morphologie de la colonne dendritique se produisent au cours du neurodéveloppement, du vieillissement, de l’apprentissage et de nombreux troubles neurologiques et psychiatriques, soulignant l’importance d’une analyse fiable de la colonne dendritique. Ce protocole décrit la quantification de la morphologie de la colonne dendritique avec précision et reproductibilité à l’aide d’un logiciel de reconstruction automatique de neurones tridimensionnels.

Résumé

Les connexions synaptiques permettent l’échange et le traitement de l’information entre les neurones. Le site post-synaptique des synapses excitatrices est souvent formé sur les épines dendritiques. Les épines dendritiques sont des structures d’un grand intérêt pour la recherche centrée sur la plasticité synaptique, le neurodéveloppement et les troubles neurologiques et psychiatriques. Les épines dendritiques subissent des modifications structurelles au cours de leur vie, avec des propriétés telles que le nombre total d’épines, la taille des épines dendritiques et les sous-types morphologiquement définis qui changent en réponse à différents processus. La délimitation des mécanismes moléculaires régulant ces altérations structurelles des épines dendritiques repose sur des mesures morphologiques. Cela nécessite une analyse précise et reproductible de la colonne vertébrale dendritique pour fournir des preuves expérimentales. La présente étude décrit un protocole détaillé pour la quantification et la classification des épines dendritiques à l’aide de Neurolucida 360 (logiciel de reconstruction automatique de neurones tridimensionnels). Ce protocole permet de déterminer les principales propriétés de l’épine dendritique telles que la densité totale de l’épine, le volume de la tête de l’épine et la classification en sous-types de l’épine, permettant ainsi une analyse efficace des phénotypes structurels de l’épine dendritique.

Introduction

Les épines dendritiques sont des protubérances de dendrites comprenant souvent le site post-synaptique des synapses glutamatergiques ^1,2. Les épines dendritiques présentent un intérêt particulier dans le domaine de la plasticité synaptique. Les épines sont souvent altérées lorsque la force synaptique change, devenant plus grandes et plus fortes lors de la potentialisation synaptique à long terme ou plus petites et plus faibles lors de la dépression synaptique à long terme 3,4,5,6,7.

Protocole

Toutes les procédures sur les animaux ont suivi les directives des National Institutes of Health des États-Unis sur l’utilisation des animaux dans la recherche intra-muros et ont été approuvées par le comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Institut national de la santé mentale.

1. Préparation de tranches d’hippocampe fixes

1. Anesthésier les souris avec une injection intrapéritonéale de kétamine/xylazine (kétamine : 100 mg/kg ; Xylazine : 8 mg/kg). Validez l’anesthésie par pincement de la queue et fixez la souris sur la plaque de perfusion.
2. À l’aide de grands cise....

Discussion

Ce protocole détaille les étapes spécifiques de la préparation des échantillons, de l’imagerie et du processus de quantification et de classification des épines dendritiques à l’aide d’un logiciel de reconstruction tridimensionnelle. Ce logiciel est un outil puissant capable de produire des données structurelles robustes qui contribuent à un large éventail d’enquêtes. Tout au long du processus, il y a quelques étapes critiques qui rendent ce protocole moins lourd mét.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
518F Immersion Oil	Zeiss	444960-0000-000
Cryostat	Leica	CM3050S	For slice preparation
Fine Forceps	FST	11150-10
Hemostat Forceps	FST	13020-12
Large Surgical Scissors	FST	14002-16
LSM 880 Confocal Microscope	Zeiss	LSM 880
Microscope Cover Glass	Fisherbrand	12-541-035
Mini-Peristaltic Pump II	Harvard Apparatus	70-2027	For perfusions
Neurolucida 360	MBF Bioscience	v2022.1.1	Spine Analysis Software
Neurolucida Explorer	MBF Bioscience	v2022.1.1	Spine Analysis Software
OCT Compound	Sakura Finetek	4583	For cryostat sectioning
Paraformaldehyde (37%)	Fisherbrand	F79-1
Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC	Zeiss	440762-9904-000
Scalpel Blade	FST	10022-00
Small Surgical Scissors	FST	14060-09
Spatula	FST	10091-12
Sucrose	FIsherbrand	S5-500
Superfrost Plus Microslides	Diagger	ES4951+
Vectashield HardSet Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1400-10