Quantificazione della spina dendritica utilizzando un software di ricostruzione automatica dei neuroni tridimensionali

Riepilogo

Le spine dendritiche sono compartimenti post-sinaptici della maggior parte delle sinapsi eccitatorie. Le alterazioni della morfologia della colonna vertebrale dendritica si verificano durante lo sviluppo neurologico, l'invecchiamento, l'apprendimento e molti disturbi neurologici e psichiatrici, sottolineando l'importanza di un'analisi affidabile della colonna vertebrale dendritica. Questo protocollo descrive la quantificazione della morfologia della spina dendritica in modo accurato e riproducibile utilizzando un software di ricostruzione automatica dei neuroni tridimensionali.

Abstract

Le connessioni sinaptiche consentono lo scambio e l'elaborazione di informazioni tra i neuroni. Il sito post-sinaptico delle sinapsi eccitatorie si forma spesso sulle spine dendritiche. Le spine dendritiche sono strutture di grande interesse nella ricerca incentrata sulla plasticità sinaptica, sul neurosviluppo e sui disturbi neurologici e psichiatrici. Le spine dendritiche subiscono modifiche strutturali durante la loro vita, con proprietà come il numero totale delle spine, le dimensioni delle spine dendritiche e il sottotipo morfologicamente definito che si alterano in risposta a diversi processi. La delineazione dei meccanismi molecolari che regolano queste alterazioni strutturali delle spine dendritiche si basa sulla misurazione morfologica. Ciò richiede un'analisi accurata e riproducibile della colonna vertebrale dendritica per fornire prove sperimentali. Il presente studio delinea un protocollo dettagliato per la quantificazione e la classificazione della spina dendritica utilizzando Neurolucida 360 (software automatico di ricostruzione tridimensionale dei neuroni). Questo protocollo consente di determinare le proprietà chiave della spina dendritica, come la densità totale della colonna vertebrale, il volume della testa della colonna vertebrale e la classificazione in sottotipi di colonna vertebrale, consentendo così un'analisi efficace dei fenotipi strutturali della colonna vertebrale dendritica.

Introduzione

Le spine dendritiche sono sporgenze di dendriti che spesso comprendono il sito post-sinaptico delle sinapsi glutammatergiche ^1,2. Le spine dendritiche sono di particolare interesse nel campo della plasticità sinaptica. Le spine sono spesso alterate quando la forza sinaptica cambia, diventando più grandi e più forti nel potenziamento sinaptico a lungo termine o più piccole e più deboli nella depressione sinaptica a lungo termine 3,4,5,6,7.<....

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali hanno seguito le linee guida del National Institutes of Health degli Stati Uniti sull'uso degli animali nella ricerca intramurale e sono state approvate dal National Institute of Mental Health Animal Care and Use Committee.

1. Preparazione di fette fisse di ippocampo

1. Anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale di Ketamina/Xilazina (Ketamina: 100 mg/kg; Xilazina: 8 mg/kg). Convalidare l'anestesia tramite pizzicamento della coda e fissare il mouse alla piastra di perfusione.
2. Utilizzando grandi forbici chirurgiche, rimuovere la pe....

Discussione

Questo protocollo descrive in dettaglio le fasi specifiche della preparazione del campione, l'imaging e il processo di quantificazione e classificazione della spina dendritica utilizzando un software di ricostruzione tridimensionale. Questo software è un potente strumento in grado di produrre dati strutturali robusti che contribuiscono a una vasta gamma di indagini. Durante tutto il processo, ci sono alcuni passaggi critici che rendono questo protocollo meno gravoso dal punto di vista m.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
518F Immersion Oil	Zeiss	444960-0000-000
Cryostat	Leica	CM3050S	For slice preparation
Fine Forceps	FST	11150-10
Hemostat Forceps	FST	13020-12
Large Surgical Scissors	FST	14002-16
LSM 880 Confocal Microscope	Zeiss	LSM 880
Microscope Cover Glass	Fisherbrand	12-541-035
Mini-Peristaltic Pump II	Harvard Apparatus	70-2027	For perfusions
Neurolucida 360	MBF Bioscience	v2022.1.1	Spine Analysis Software
Neurolucida Explorer	MBF Bioscience	v2022.1.1	Spine Analysis Software
OCT Compound	Sakura Finetek	4583	For cryostat sectioning
Paraformaldehyde (37%)	Fisherbrand	F79-1
Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC	Zeiss	440762-9904-000
Scalpel Blade	FST	10022-00
Small Surgical Scissors	FST	14060-09
Spatula	FST	10091-12
Sucrose	FIsherbrand	S5-500
Superfrost Plus Microslides	Diagger	ES4951+
Vectashield HardSet Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1400-10