自動三次元ニューロン再構成ソフトウェアによる樹状突起スパインの定量化

要約

樹状突起棘は、ほとんどの興奮性シナプスのシナプス後コンパートメントです。樹状突起スパインの形態の変化は、神経発達、老化、学習、および多くの神経学的および精神医学的障害の間に起こり、信頼性の高い樹状突起スパイン解析の重要性が強調されています。このプロトコルでは、自動 3 次元ニューロン再構成ソフトウェアを使用して、樹状突起スパインの形態を正確かつ再現性よく定量化する方法について説明します。

要約

シナプス接続により、ニューロン間の情報の交換と処理が可能になります。興奮性シナプスのシナプス後部位は、しばしば樹状突起棘上に形成されます。樹状突起スパインは、シナプス可塑性、神経発達、神経疾患、精神疾患を中心とした研究で非常に興味深い構造です。樹状突起スパインは、その生涯の間に構造的変化を受け、総スパイン数、樹状突起スパインのサイズ、形態学的に定義されたサブタイプなどの特性は、さまざまなプロセスに応じて変化します。樹状突起スパインのこれらの構造変化を制御する分子メカニズムを明らかにするには、形態学的測定が必要です。これにより、実験的証拠を提供するために、正確で再現性のある樹状突起スパイン分析が義務付けられています。本研究では、Neurolucida 360(自動三次元ニューロン再構成ソフトウェア)を使用した樹状突起脊椎の定量化と分類のための詳細なプロトコルを概説します。このプロトコルにより、総脊椎密度、脊椎頭容積、脊椎サブタイプへの分類などの主要な樹状突起スパイン特性の決定が可能になり、樹状突起スパインの構造表現型の効果的な分析が可能になります。

概要

樹状突起スパインは樹状突起の突起であり、しばしばグルタミン酸作動性シナプスのシナプス後部位を構成する^1,2。樹状突起スパインは、シナプス可塑性の分野で特に興味深いものです。棘は、シナプスの強度が変化するとしばしば変化し、長期のシナプス増強では大きくて強くなり、長期的なシナプス抑制では小さくて弱くなります3,4,5,6,7。シナプス可塑性を超えて、樹状突起スパインのプロファイルは生涯を通じて変化します。初期の発達では、樹状突起スパインの形成と成長の期間があり、その後、定常状態に達するまで樹状突起スパインの剪定が行われます^8,9,10。老化した脳では、脊椎の喪失は脳の萎縮と認知機能の低下を伴います¹¹

プロトコル

すべての動物用処置は、学内研究における動物の使用に関する米国国立衛生研究所ガイドラインに従い、国立精神衛生研究所の動物管理および使用委員会によって承認されました。

1.固定海馬スライスの調製

1. ケタミン/キシラジン(ケタミン:100 mg / kg;キシラジン:8 mg / kg)。.テールピンチで麻酔を検証し、マウスを灌流プレートに貼り付けます。
2. 大きな手術用ハサミを使用して、胸部の皮膚と被毛を取り除き、下にある胸郭の視覚化を容易にします。
3. 肝臓と横隔膜を避けて、胸郭の幅より下に水平に切り込みを入れます。細い鉗子を使用して、剣状突起を引き上げ、胸郭の両側を切断します。胸郭を首の領域まで跳ね上げ、止血鉗子を使用して所定の位置にクランプします。
4. 21 Gのバタフライ針を心臓の左心室に挿入し、室温の1x PBSで約5 mL /分で灌流を開始します。小さな手術用ハサミで右心房に小さな切り込みを入れます。心房を出る溶液が透明になるまでPBSで灌流します。
5. 灌流ポンプをオフにして、気泡がチューブに入らないようにします。PBSのチューブをPBS中の氷冷した4%パラホルムアルデヒド(PFA)に入れます。動物が完全に硬化するまで、PFAを5 mL/分の速度で灌流します(約25 mL)。
   注....

ディスカッション

このプロトコルでは、サンプル調製、イメージング、および3次元再構成ソフトウェアを使用した樹状突起スパインの定量化と分類のプロセスの具体的な手順について詳しく説明します。このソフトウェアは、さまざまな調査に貢献する堅牢な構造データを生成できる強力なツールです。プロセス全体を通じて、このプロトコルを方法論的な負担を軽減し、データの?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
518F Immersion Oil	Zeiss	444960-0000-000
Cryostat	Leica	CM3050S	For slice preparation
Fine Forceps	FST	11150-10
Hemostat Forceps	FST	13020-12
Large Surgical Scissors	FST	14002-16
LSM 880 Confocal Microscope	Zeiss	LSM 880
Microscope Cover Glass	Fisherbrand	12-541-035
Mini-Peristaltic Pump II	Harvard Apparatus	70-2027	For perfusions
Neurolucida 360	MBF Bioscience	v2022.1.1	Spine Analysis Software
Neurolucida Explorer	MBF Bioscience	v2022.1.1	Spine Analysis Software
OCT Compound	Sakura Finetek	4583	For cryostat sectioning
Paraformaldehyde (37%)	Fisherbrand	F79-1
Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC	Zeiss	440762-9904-000
Scalpel Blade	FST	10022-00
Small Surgical Scissors	FST	14060-09
Spatula	FST	10091-12
Sucrose	FIsherbrand	S5-500
Superfrost Plus Microslides	Diagger	ES4951+
Vectashield HardSet Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1400-10