כימות עמוד השדרה הדנדריטי באמצעות תוכנה אוטומטית לשחזור נוירונים תלת מימדיים

Summary

קוצים דנדריטיים הם תאים פוסט-סינפטיים של רוב הסינפסות המעוררות. שינויים במורפולוגיה של עמוד השדרה הדנדריטי מתרחשים במהלך התפתחות עצבית, הזדקנות, למידה והפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות רבות, המדגישים את החשיבות של ניתוח עמוד שדרה דנדריטי אמין. פרוטוקול זה מתאר כימות מדויק ושחזור של מורפולוגיה של עמוד השדרה הדנדריטי באמצעות תוכנה אוטומטית לשחזור נוירונים תלת-ממדיים.

Abstract

קשרים סינפטיים מאפשרים חילופי מידע ועיבודו בין נוירונים. האתר הפוסט-סינפטי של סינפסות מעוררות נוצר לעתים קרובות על קוצים דנדריטיים. עמוד השדרה הדנדריטי הוא מבנה בעל עניין רב במחקר המתמקד בפלסטיות סינפטית, התפתחות עצבית והפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות. עמוד השדרה הדנדריטי עובר שינויים מבניים במהלך חייו, כאשר תכונות כגון מספר עמוד השדרה הכולל, גודל עמוד השדרה הדנדריטי ותת-סוג מוגדר מורפולוגית משתנות בתגובה לתהליכים שונים. התוויית המנגנונים המולקולריים המווסתים שינויים מבניים אלה של עמוד השדרה הדנדריטי מסתמכת על מדידה מורפולוגית. זה מחייב ניתוח מדויק וניתן לשחזור של עמוד השדרה הדנדריטי כדי לספק ראיות ניסיוניות. המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול מפורט לכימות וסיווג עמוד השדרה הדנדריטי באמצעות Neurolucida 360 (תוכנה אוטומטית לשחזור נוירונים תלת מימדי). פרוטוקול זה מאפשר לקבוע תכונות מפתח של עמוד השדרה הדנדריטי כגון צפיפות עמוד השדרה הכוללת, נפח ראש עמוד השדרה וסיווג לתת-סוגים של עמוד השדרה ובכך מאפשר ניתוח יעיל של פנוטיפים מבניים של עמוד השדרה הדנדריטי.

Introduction

קוצים דנדריטיים הם בליטות של דנדריטים המהווים לעתים קרובות את האתר הפוסט-סינפטי של סינפסות גלוטמטרגיות ^1,2. קוצים דנדריטיים הם בעלי עניין מיוחד בתחום הפלסטיות הסינפטית. עמוד השדרה משתנה לעתים קרובות כאשר הכוח הסינפטי משתנה, הופך גדול וחזק יותר בעוצמה סינפטית לטווח ארוך או קטן יותר וחלש יותר בדיכאון סינפטי לטווח ארוך 3,4,5,6,7. מעבר לפלסטיות הסינפטית, הפרופיל של עמוד השדרה הדנדריטי משתנה לאורך תוחלת החיים. בהתפתחות מ....

Protocol

כל הנהלים בבעלי חיים פעלו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב המשתמשים בבעלי חיים במחקר אינטרמורלי ואושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המכון הלאומי לבריאות הנפש.

1. הכנת פרוסות היפוקמפוס קבועות

1. מרדימים עכברים בהזרקה תוך צפקית של קטמין/קסילזין (קטמין: 100 מ"ג/ק"ג; קסילזין: 8 מ"ג/ק"ג). יש לאמת את פעולת ההרדמה באמצעות צביטת זנב ולהצמיד את העכבר לצלחת הזילוח.
2. באמצעות מספריים כירורגיים גדולים, להסיר את העור והפרווה מן החזה, המאפשר הדמיה קלה יותר של כלוב הצלעות הבסיסי.
3. בצע חתך אופקי מתחת לרוחב כלוב הצלעות, הימנעות הכבד והסרעפת. בעזרת מלקחיים עד....

תוצאות

שימוש יעיל בשיטת ניתוח זו מתחיל בבחירת מקטעים דנדריטיים למעקב. כפי שמתואר באיור 1, הדנדריטים האידיאליים למעקב אינם קרובים לדנדריטים אחרים. דנדריטים הפועלים במקביל עלולים לגרום לזיהוי לא נכון של קוצים מדנדריט שכן. דנדריטים המצטלבים ישירות או רצים בניצב ב.......

Discussion

פרוטוקול זה מפרט את השלבים הספציפיים של הכנת הדגימה, הדמיה ותהליך הכימות והסיווג של עמוד השדרה הדנדריטי באמצעות תוכנת שחזור תלת מימדית. תוכנה זו היא כלי רב עוצמה המסוגל לייצר נתונים מבניים חזקים התורמים למגוון רחב של חקירות. לאורך התהליך, ישנם כמה שלבים קריטיים שהופכים ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
518F Immersion Oil	Zeiss	444960-0000-000
Cryostat	Leica	CM3050S	For slice preparation
Fine Forceps	FST	11150-10
Hemostat Forceps	FST	13020-12
Large Surgical Scissors	FST	14002-16
LSM 880 Confocal Microscope	Zeiss	LSM 880
Microscope Cover Glass	Fisherbrand	12-541-035
Mini-Peristaltic Pump II	Harvard Apparatus	70-2027	For perfusions
Neurolucida 360	MBF Bioscience	v2022.1.1	Spine Analysis Software
Neurolucida Explorer	MBF Bioscience	v2022.1.1	Spine Analysis Software
OCT Compound	Sakura Finetek	4583	For cryostat sectioning
Paraformaldehyde (37%)	Fisherbrand	F79-1
Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC	Zeiss	440762-9904-000
Scalpel Blade	FST	10022-00
Small Surgical Scissors	FST	14060-09
Spatula	FST	10091-12
Sucrose	FIsherbrand	S5-500
Superfrost Plus Microslides	Diagger	ES4951+
Vectashield HardSet Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1400-10