Cuantificación de la columna dendrítica mediante un software automático de reconstrucción de neuronas tridimensional

Resumen

Las espinas dendríticas son compartimentos postsinápticos de la mayoría de las sinapsis excitatorias. Las alteraciones en la morfología de la espina dendrítica ocurren durante el neurodesarrollo, el envejecimiento, el aprendizaje y muchos trastornos neurológicos y psiquiátricos, lo que subraya la importancia de un análisis confiable de la columna dendrítica. Este protocolo describe la cuantificación de la morfología de la espina dendrítica de forma precisa y reproducible utilizando un software automático de reconstrucción de neuronas tridimensionales.

Resumen

Las conexiones sinápticas permiten el intercambio y procesamiento de información entre neuronas. El sitio postsináptico de las sinapsis excitadoras a menudo se forma en las espinas dendríticas. Las espinas dendríticas son estructuras de gran interés en la investigación centrada en la plasticidad sináptica, el neurodesarrollo y los trastornos neurológicos y psiquiátricos. Las espinas dendríticas experimentan modificaciones estructurales durante su vida útil, con propiedades como el número total de espinas, el tamaño de las espinas dendríticas y el subtipo morfológicamente definido que se alteran en respuesta a diferentes procesos. La delineación de los mecanismos moleculares que regulan estas alteraciones estructurales de las espinas dendríticas se basa en la medición morfológica. Esto exige un análisis preciso y reproducible de la espina dendrítica para proporcionar evidencia experimental. El presente estudio describe un protocolo detallado para la cuantificación y clasificación de la columna dendrítica utilizando Neurolucida 360 (software automático de reconstrucción de neuronas tridimensionales). Este protocolo permite la determinación de las propiedades clave de la espina dendrítica, como la densidad total de la espina, el volumen de la cabeza de la espina y la clasificación en subtipos de espina, lo que permite un análisis eficaz de los fenotipos estructurales de la espina dendrítica.

Introducción

Las espinas dendríticas son protuberancias de las dendritas, que a menudo comprenden el sitio postsináptico de las sinapsis glutamatérgicas ^1,2. Las espinas dendríticas son de particular interés en el campo de la plasticidad sináptica. Las espinas a menudo se alteran cuando cambia la fuerza sináptica, volviéndose más grandes y fuertes en la potenciación sináptica a largo plazo o más pequeñas y débiles en la depresión sináptica a largo plazo 3,4,5,6,7.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales siguieron las Directrices de los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. sobre el uso de animales en la investigación intramuros y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional de Salud Mental.

1. Preparación de rodajas fijas del hipocampo

1. Anestesiar ratones con una inyección intraperitoneal de ketamina/xilacina (ketamina: 100 mg/kg; Xilacina: 8 mg/kg). Validar la anestesia mediante un pellizco de cola y fijar el ratón a la placa de perfusión.
2. Con unas tijeras quirúrgicas grandes, retire la piel....

Discusión

Este protocolo detalla los pasos específicos de la preparación de la muestra, la obtención de imágenes y el proceso de cuantificación y clasificación de la columna dendrítica mediante software de reconstrucción tridimensional. Este software es una poderosa herramienta capaz de producir datos estructurales robustos que contribuyen a una amplia gama de investigaciones. A lo largo del proceso, hay algunos pasos críticos que hacen que este protocolo sea menos una carga metodológica.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
518F Immersion Oil	Zeiss	444960-0000-000
Cryostat	Leica	CM3050S	For slice preparation
Fine Forceps	FST	11150-10
Hemostat Forceps	FST	13020-12
Large Surgical Scissors	FST	14002-16
LSM 880 Confocal Microscope	Zeiss	LSM 880
Microscope Cover Glass	Fisherbrand	12-541-035
Mini-Peristaltic Pump II	Harvard Apparatus	70-2027	For perfusions
Neurolucida 360	MBF Bioscience	v2022.1.1	Spine Analysis Software
Neurolucida Explorer	MBF Bioscience	v2022.1.1	Spine Analysis Software
OCT Compound	Sakura Finetek	4583	For cryostat sectioning
Paraformaldehyde (37%)	Fisherbrand	F79-1
Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC	Zeiss	440762-9904-000
Scalpel Blade	FST	10022-00
Small Surgical Scissors	FST	14060-09
Spatula	FST	10091-12
Sucrose	FIsherbrand	S5-500
Superfrost Plus Microslides	Diagger	ES4951+
Vectashield HardSet Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1400-10