小鼠从怀孕到哺乳期的心电图及行为分析

摘要

使用遥测系统同时记录母鼠从怀孕到哺乳期的自主神经活动和详细的母体行为。这种方法有助于了解母亲从怀孕到断奶的生理和行为特征的动态。

摘要

母子关系的变化可能伴随着自主神经系统的动态变化。尽管已经对人类母亲和婴儿进行了自主神经活动的时间测量，但对长期变化的分析仍未得到探索。小鼠妈妈可以与幼崽形成社会纽带，怀孕和哺乳期很短，这使得它们可用于检查从怀孕到幼崽饲养的生理变化。因此，使用遥测系统数周来测量自主神经系统的变化和小鼠母亲的行为。目前的结果表明，无论母亲的运动和分娩如何，都可以稳定地记录心电图 （ECG）。心电图分析显示，从怀孕到哺乳期，心率逐渐降低，随着幼崽的发育，交感神经活动急剧增加。此外，在家笼中同时记录行为和心电图使我们能够了解行为依赖性对心电图的影响，从而揭示每种行为期间自主神经活动的特征。因此，本实验方法有助于了解母亲的生理特征如何从怀孕到幼崽抚养发生变化，从而支持幼崽的健康发育。

引言

母后关系在各种动物物种建立的关系中是独一无二的，因为它对后代的未来有很大影响¹。在人类中，儿童的发展和内部/外部行为受养育方式以及虐待和忽视程度的影响 ^2,3。同样，在啮齿动物中，母体行为的质量对幼崽的发育和行为有重大影响 ^4,5,6。因此，对母亲的养育行为进行详细跟踪和检查可以深入了解其后代发育和健康支持的个体差异机制。

行为和生理研究表明，哺乳动物母亲从怀孕到哺乳期会经历动态的行为和生理变化。当雌性哺乳动物怀孕时，雌激素和其他激素的分泌变化会影响母体的行为⁷。随着后代的生长和泌乳频率的减少，激素分泌动态地向怀孕前状态转变，结束了母体行为的表达 ^8,9,10。这些发现表明，内分泌系统、母体行为和后代发育之间的相互作用在哺乳动物母亲在怀孕和哺乳期间经历的变化中起着重要作用。

哺乳动物母亲从怀孕到哺乳期的行为和生理变化不仅与内分泌系统密切相关，还与自主神经系统密切相关^11,12。人类研究表明，母婴接触会引起母亲和婴儿自主神经系统的变化¹³。几项研究测量了人类母亲和婴儿的心电图 （ECG） 和心率变异性，表明每种行为都会改变其他行为的心率和 RR 间期 14,15,16。然而，目前尚不清楚这三个因素——自主神经系统、母体行为和后代发育——从怀孕到哺乳期是如何相互作用的。此外，由于人类的哺乳期约为两年，因此很难长期监测人类的这些相互作用。

在此类研究中，经常使用啮齿动物代替人类。啮齿动物的自主神经系统已在麻醉下或与幼崽隔离时进行测量，以防止记录不稳定和损坏测量设备;因此，在行为受限的情况下，测量是暂时的 17,18,19。在啮齿动物可以自由移动并与他人交流的环境中观察自主神经系统至关重要，因为母幼犬互动可以改变母亲的行为和生理机能 ^8,9,10,15。

开发这种实验方法是为了让母亲自由活动。在这种方法中，将心电图植入计皮下连接到怀孕的母亲身上，以防止损坏设备，并允许从怀孕到哺乳期的稳定长期心电图记录。小鼠妈妈可以在家笼中表现出一般行为（自我梳理、食物摄入等）和通常的母性行为;因此，可以在同一只鼠标中轻松观察和比较每种行为和心电图。行车记录仪在 4 周内记录了老鼠 24 小时的行为。该实验方案使我们能够跟踪从怀孕到母亲期自主神经活动和行为的动态变化。

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研究方案

所有程序均已获得麻布大学伦理委员会 （#210319-30） 的批准。本研究使用体重超过 22 g 的妊娠日 （GD） 14 的 C57B/6J 小鼠。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。研究所需的试剂和设备列在 材料表中。

1. 实验准备

1. 打开面板加热器并用铝箔覆盖。用 70% 乙醇擦拭所有表面。
2. 所有手术器械（剪刀、镊子、细镊子和镊子）都提前高压灭菌。
3. 将无菌缝合线准备成所需的长度并准备好。
4. 用橡胶面罩覆盖麻醉面罩，以确保无菌和患者舒适度。
5. 使用安装在能够记录的计算机上的 tBase 和 LabChart（生理数据分析软件）应用程序检查小鼠生物电位遥测仪（图 1A）是否有任何异常或损坏。

2. 植入测距仪

1. 将鼠标放入含有 4% 异氟醚的诱导麻醉盒中。
2. 达到麻醉手术平面后，将鼠标俯卧放在面板加热器上。将麻醉面罩放在鼠标上，保持 1%-2.0% 的异氟醚水平和 0.5-2 L/min 的氧气流量。
   注意：在该协议中，考虑到它们对胎儿和行为观察的影响，没有使用镇痛药。
3. 用理发器去除耳朵之间的皮毛，并交替使用碘基消毒剂和 70% 酒精对皮肤进行消毒 3 次。
4. 为了确认麻醉的手术平面，用镊子捏住小鼠后爪的脚趾。用剪刀在耳朵之间的皮肤上切开一个切口（2-3 厘米）。将镊子插入切口，以分离颈部和腹侧周围的皮肤和肌肉，在腹侧创造专门用于遥测放置的空间。
5. 将遥测计插入耳朵之间的切口，并将其放置在腹侧间隙。
6. 使用镊子滚动和捆绑正负导联。将引线放在颈部空间（图 1B）。
7. 使用 13 毫米针和 20 厘米缝合线缝合切口，注意避免损坏导线。
8. 将鼠标置于仰卧位，然后用剪刀拔掉锁骨周围的毛发。交替使用碘基消毒剂和 70% 酒精对皮肤进行 3 次消毒。
9. 用剪刀在锁骨皮肤周围切一个小口，将肌肉与颈部皮肤分开。使用镊子从脖子后部提取正负导联。
10. 使用镊子分离唾液腺并露出胸锁乳突肌 （SCM） 的“V 形”外观，该肌起源于锁骨并斜穿过颈部的每一侧（图 1C，D）。
11. 调整负极导联的长度以到达锁骨附近的 SCM。小心地从负极引线上取下引线管，确保使用细镊子拉伸内部的盘绕不锈钢电极。
12. 将缝合针 （7 mm） 用 10 cm 的缝合线穿过 SCM 的 V 形弯曲处，形成一个环。将不锈钢电极从负极引线穿过该回路，并将其放置在锁骨附近的 SCM 下方。
    1. 轻轻系好环以避免损坏 SCM，然后重复 3 次以固定不锈钢电极。通过将第二根缝合线定位在 SCM 的颅侧并将其系在负极导联的管子上，进一步固定负极导联（图 1E）。
13. 在剑突周围进行切片，并小心地将皮肤与肌肉从剑突分离到锁骨。
14. 延长正极导联以到达剑突。与负极引线类似，从正极引线上取下引线管，确保内部的盘绕不锈钢电极用细镊子拉伸。
15. 使用 18 G 针头在剑突周围的肌肉下方形成一条隧道，然后将不锈钢电极放入针头中，穿过剑突周围的肌肉。
16. 取下针头后，使用缝合针 （7 mm） 和 10 cm 缝合线将盘绕的不锈钢电极轻轻缝合到剑突周围的肌肉上（图 1D）。为了进一步固定正极导联，将第二根缝合线放在剑突的颅侧，并将其系在正极导联的管子上。
17. 使用缝合长度为 13 cm 的缝合针 （20 mm） 闭合所有切口（图 1E，F）。
18. 植入后，将鼠标放在干净的笼子中，并将笼子放在 tBase 上，tBase 充当鼠标遥测的接收器（图 1G）。打开可记录计算机并使用已安装的数据分析软件应用程序收集心电图数据。检查 ECG 数据是否显示正常波形（图 2A、B）。
    注意：如果出现异常波形或噪声（如图 2C 所示），请在麻醉下重新连接负极和正极导联。
19. 在两天的恢复期内，通过在笼子底部放置水凝胶和食物来确保小鼠得到适当的治疗。在此恢复期间，使用行车记录仪仅记录房屋笼的行为。

3. 记录从怀孕到断奶的心电图和家笼行为

1. 在黑暗阶段打开红灯，因为行车记录仪在没有光线的情况下无法工作。将行车记录仪放在主笼旁边以记录行为。使用可记录 PC 上的 LabChart 应用程序记录心电图。在收集 ECG 数据之前，请在 LabChart 中验证 ECG 的采样率。
   注意：在此协议中，选择行车记录仪是因为它可以放置在任何地方。此外，与摄像机相比，行车记录仪可以广角录制，并且使用更少的数据存储容量（例如，使用行车记录仪录制 24 小时大约需要 70 GB）。在本演示中，数据分析软件中 ECG 的采样率设置为 1 k/s。
2. 打开行车记录仪后，在计算机上启动 LabChart 以记录行为和心电图。
   注意：在本演示中，使用宏连续记录心电图并每 2 小时自动保存一次文件。这个重复的过程在整个实验过程中执行。此外，选择了一个 256 GB 的 SD 卡用于记录目的，允许每天收集大约 24 小时的数据。
3. 检查鼠标是否有分娩和身体异常，并从行车记录仪和可记录计算机采样数据。小鼠生下幼崽的那一天被认为是出生后日 （PD） 0。出生后每天测量幼犬的体重。
   注意：在这项研究中，每天早上 7：30 至 8：30 收集来自行车记录仪的录制视频和来自可录制 PC 的心电图数据文件。此外，为了防止多只幼崽接触母亲而引起的振动引起的心电图噪声，将幼崽剔除为四只幼崽（其中一半是雄性，另一半是雌性）。
4. 检查鼠标并收集数据后，将所有内容返回到其原始位置。打开行车记录仪和可记录计算机。启动 LabChart 应用程序。
   注意：如果使用宏来记录心电图，请单击宏按钮并通过从管理选项中选择运行按钮来初始化宏。
5. 每周更换一次新的笼子。在此过程中，包括床上用品，其中一半是以前使用过的，另一半是新的。
   注：此过程，包括数据采样和小鼠检查，从 GD 17 到出生后日 （PD） 21 重复。

4. 分析心电图

1. 要分析 ECG 数据，请使用数据分析软件。启动 LabChart 并打开记录期间 的数据文件 。要分析心率变异性 （HRV），请单击 HRV 按钮并调整心跳检测设置。
   注：在本演示中，选择 自定义 设置并将最小峰高更改为 1.2 以进行检测调整。
2. 调整设置后，查看所有节拍并删除任何噪声数据（如图 2C 所示）。
   注意：如果未检测到 R 波，请使用 HRV 按钮添加或修改它。
3. 单击 HRV 按钮并选择 beat 分类器视图。在 beat classificationifier （节拍分类器） 视图上选择 all beats（节拍），然后从 HRV 按钮中选择报告视图。从报表视图中复制数据并将其粘贴到 Excel 中。
   注意： 如表 1 所示，HRV 结果通过数据分析软件显示时域和光谱域，从而实现观察。

5. 对家笼行为的行为图进行分类

1. 查看所有录制的视频以检查是否有异常情况，例如暗时红灯不亮和行车记录仪不工作。
   注意：视频的录制方式与心电图相同，每 2 小时捕获一次视频剪辑。
2. 根据母亲在行为过程中的姿势、行为所花费的时间以及行为发生的位置等参数对行为图进行分类（表 2），然后观察行车记录仪中的视频。

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结果

将测距计植入怀孕的小鼠体内后，我们在家笼中记录了从怀孕到哺乳期的心电图。采样率设置为 1 k/s。为了在避免昼夜节律影响的同时比较母鼠各生理状态的心电图，分析了 2 h 数据文件中 23：32 至 23：42 对 GD 17、分娩、PD 0 和 PD 21 的 10 分钟数据（图 3， 表 1）。选择 23：32 到 23：42 的时间是因为它代表分娩期间第一只幼崽出生前 10 分?...

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讨论

在这种方法中，将植入子植入怀孕的小鼠体内，可以连续跟踪同一只小鼠从怀孕到哺乳期的心电图。小鼠表现出包括运动在内的行为图，表明从 GD 17 到 PD 21 的所有分析期间 （23：32-23：42） 都处于清醒状态。此外，目前的结果表明，从怀孕到哺乳期，心率逐渐降低。这种降低被认为是由于心率正常化，因为多项研究表明，由于血流量增加，怀孕女性的心率会增加

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-h repeating timer	Panasonic	WH3311BP
5-0 Nylon suture	Natsume Seisakusho Co	-23s-N2
Anesthesia box	Natsume Seisakusho Co	KN-1010	W110×D110×H110mm
Anesthesia mask	Natsume Seisakusho Co	KN-1019-1
Anesthesic machine	Natsume Seisakusho Co	KN-1071-E
C57BL6/J mice	Clea Japan, Inc		Pregnancy mouse at 14 day
Clip light	Yazawa corporation	CLX60X02WH
Configurator System	Adinstuments	TR190
drive recorder	Transcend	TS-DP250A-32G
Food holder	Clea Japan, Inc	CL-2802
Isoflurane	FujiFilM	099-06571
LabChart Pro V8	Adinstuments	MLU260/8
LabChart8	Adinstuments	MLS060/8
Mouse Biopotential Telemeter	Adinstuments	MT10B
Needle 18 G 1 1/2	Terumo	NN-1838R
Panel heater	SANKO	4976285145407
PowerLab 4/26	Adinstuments	PL2604
Recordable computer	Mouse computer	mouse K7-H
red light bulb	ELPA	LDG1R-G-GWP254
Rubber mask	Natsume Seisakusho Co	KN-1019-M
SD card (256GB)	Transcend	TS256GUSD350V	It can record approximately 24 h
Suture needle 13 mm	Natsume Seisakusho Co	C-24-540-NO.0
Suture needle 7 mm	Natsume Seisakusho Co	C-24-540-NO.0000
tBase	Adinstuments	MT110