Analyse von Elektrokardiogrammen und Verhalten bei Mäusen von der Schwangerschaft bis zur Stillzeit

Zusammenfassung

Eine gleichzeitige Aufzeichnung der autonomen Aktivität und des detaillierten mütterlichen Verhaltens von Muttermäusen von der Trächtigkeit bis zur Laktation wurde mit Hilfe eines Telemetriesystems erreicht. Diese Methode hilft, die Dynamik der physiologischen und verhaltensbezogenen Merkmale bei Müttern von der Schwangerschaft bis zur Entwöhnung zu verstehen.

Zusammenfassung

Veränderungen in der Mutter-Kind-Beziehung gehen vermutlich mit dynamischen Veränderungen im vegetativen Nervensystem einher. Obwohl zeitliche Messungen der autonomen Aktivität bei menschlichen Müttern und Säuglingen durchgeführt wurden, ist die Analyse langfristiger Veränderungen noch unerforscht. Mäusemütter können soziale Bindungen zu ihren Jungtieren aufbauen und haben eine kurze Trächtigkeits- und Laktationszeit, was sie für die Untersuchung physiologischer Veränderungen von der Trächtigkeit bis zur Aufzucht der Welpen nützlich macht. Daher wurde über mehrere Wochen ein Telemetriesystem eingesetzt, um die Veränderungen im vegetativen Nervensystem und das Verhalten von Mäusemüttern zu messen. Die aktuellen Ergebnisse zeigten, dass ein Elektrokardiogramm (EKG) unabhängig von den Bewegungen der Mütter und der Geburt stabil aufgezeichnet werden kann. Die EKG-Analyse zeigte, dass die Herzfrequenz von der Trächtigkeit bis zur Stillzeit allmählich abnahm und die sympathische Aktivität mit der Entwicklung der Jungtiere stark zunahm. Darüber hinaus ermöglichte uns die gleichzeitige Aufzeichnung von Verhalten und EKG im Heimkäfig, die verhaltensabhängigen Einflüsse auf das EKG zu verstehen und dadurch die Charakteristika der autonomen Nervenaktivität während jedes Verhaltens aufzudecken. Die vorliegende experimentelle Methode hilft daher zu verstehen, wie sich die physiologischen Eigenschaften von Müttern von der Schwangerschaft bis zur Aufzucht der Jungtiere verändern, was die gesunde Entwicklung der Jungtiere unterstützt.

Einleitung

Die Mutter-Nachkommen-Beziehung ist einzigartig unter den Beziehungen, die von verschiedenen Tierarten aufgebaut wurden, da sie einen großen Einfluss auf die Zukunft der Nachkommen^{hat 1}. Beim Menschen werden die Entwicklung und das innere/äußere Verhalten von Kindern durch den Erziehungsstil sowie das Ausmaß von Missbrauch und Vernachlässigung beeinflusst ^2,3. In ähnlicher Weise hat bei Nagetieren die Qualität des mütterlichen Verhaltens einen signifikanten Einfluss auf die Entwicklung und das Verhalten der Jungtiere ^4,5,6. Daher kann eine detaillierte Verfolgung und Untersuchung des Fürsorgeverhaltens von Müttern Einblicke in die Mechanismen individueller Unterschiede in der Entwicklung und gesunden Unterstützung ihres Nachwuchses geben.

Verhaltensbezogene und physiologische Studien haben gezeigt, dass Säugetiermütter von der Schwangerschaft bis zur Stillzeit dynamische Verhaltens- und physiologische Veränderungen durchlaufen. Wenn weibliche Säugetiere schwanger werden, beeinflussen Veränderungen der Sekretion von Östrogen und anderen Hormonen das Verhalten der Mutter⁷. Wenn der Nachwuchs wächst und die Häufigkeit der Laktation abnimmt, ändert sich die Hormonsekretion dynamisch in Richtung des Zustands vor der Schwangerschaft, wodurch die Ausprägung des mütterlichen Verhaltens beendet^{wird 8,9,10}. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Interaktion zwischen dem endokrinen System, dem mütterlichen Verhalten und der Entwicklung der Nachkommen eine wichtige Rolle bei den Veränderungen spielt, die Säugetiermütter während der Schwangerschaft und Stillzeit erfahren.

Verhaltensbedingte und physiologische Veränderungen bei Säugetiermüttern von der Schwangerschaft bis zur Stillzeit stehen nicht nur in engem Zusammenhang mit dem endokrinen System, sondern auch mit dem autonomen Nervensystem^11,12. Humanstudien deuten darauf hin, dass Mutter-Kind-Kontakt Veränderungen im autonomen Nervensystem von Müttern und Säuglingen hervorruft¹³. Mehrere Studien haben das Elektrokardiogramm (EKG) und die Herzfrequenzvariabilität bei menschlichen Müttern und Säuglingen gemessen und gezeigt, dass jedes Verhalten die Herzfrequenz und das RR-Intervall der anderen verändert 14,15,16. Es ist jedoch nicht klar, wie die drei Faktoren - autonomes Nervensystem, mütterliches Verhalten und Entwicklung der Nachkommen - von der Schwangerschaft bis zur Stillzeit miteinander interagieren. Darüber hinaus ist es schwierig, diese Interaktionen beim Menschen über einen langen Zeitraum zu überwachen, da die Laktationszeit beim Menschen etwa zwei Jahre beträgt.

In solchen Studien werden oft Nagetiere anstelle von Menschen verwendet. Das autonome Nervensystem von Nagetieren wurde unter Narkose oder isoliert von Jungtieren gemessen, um instabile Aufzeichnungen und Schäden am Messgerät zu vermeiden. Daher ist die Messung in verhaltenseingeschränkten Situationen zeitlich 17,18,19. Es ist wichtig, das autonome Nervensystem in einer Umgebung zu beobachten, in der sich Nagetiere frei bewegen und mit anderen kommunizieren können, da Mutter-Welpen-Interaktionen das Verhalten und die Physiologie von Müttern verändern können 8,9,10,15.

Diese experimentelle Methode wurde entwickelt, um der Mutter die freie Bewegung zu ermöglichen. Bei dieser Methode wurde ein EKG-Telemeter subkutan an einer schwangeren Mutter befestigt, um Schäden am Gerät zu vermeiden und eine stabile Langzeit-EKG-Aufzeichnung von der Schwangerschaft bis zur Stillzeit zu ermöglichen. Mäusemütter können allgemeine Verhaltensweisen (Selbstpflege, Nahrungsaufnahme usw.) und das übliche mütterliche Verhalten in ihrem häuslichen Käfig zeigen; So können jedes Verhalten und die EKGs einfach in ein und derselben Maus beobachtet und verglichen werden. Ein Laufwerksrekorder zeichnete das Verhalten der Maus über einen Zeitraum von vier Wochen 24 Stunden lang auf. Dieses experimentelle Protokoll ermöglichte es uns, die dynamischen Veränderungen der autonomen Aktivität und des Verhaltens von der Schwangerschaft bis zur Mutterzeit zu verfolgen.

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Protokoll

Alle Verfahren wurden von der Ethikkommission der Azabu Universität genehmigt (#210319-30). Für die vorliegende Studie wurden C57B/6J-Mäuse am Gestationstag (GD) 14 mit einem Gewicht von mehr als 22 g verwendet. Die Tiere wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen (siehe Materialtabelle). Die für die Studie benötigten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Versuche

1. Schalten Sie die Flächenheizung ein und decken Sie sie mit Alufolie ab. Wischen Sie alle Oberflächen mit 70% Ethanol ab.
2. Alle chirurgischen Instrumente (Schere, Pinzette, Feinpinzette und Pinzette) wurden im Vorfeld autoklaviert.
3. Bereiten Sie die sterilen Nähte auf die gewünschte Länge vor und halten Sie sie bereit.
4. Decken Sie Anästhesiemasken mit Gummimasken ab, um Sterilität und Patientenkomfort zu gewährleisten.
5. Untersuchen Sie das Biopotential-Telemeter der Maus (Abbildung 1A) auf Anomalien oder Beschädigungen mit den Anwendungen tBase und LabChart (der Software zur physiologischen Datenanalyse), die auf einem Computer installiert sind, der aufzeichnen kann.

2. Telemeter-Implantation

1. Legen Sie die Maus in eine Induktionsanästhesiebox mit 4 % Isofluran.
2. Nachdem Sie die chirurgische Ebene der Anästhesie erreicht haben, legen Sie die Maus in Bauchlage auf die Plattenheizung. Positionieren Sie die Anästhesiemaske auf der Maus und halten Sie einen Isofluranspiegel von 1 % bis 2,0 % und einen Sauerstofffluss von 0,5 bis 2 l/min aufrecht.
   HINWEIS: In diesem Protokoll wurden keine Analgetika verwendet, unter Berücksichtigung ihrer Auswirkungen auf den Fötus und der Verhaltensbeobachtungen.
3. Verwenden Sie eine Schere zum Entfernen des Fells zwischen den Ohren und desinfizieren Sie die Haut dreimal mit abwechselnd jodhaltigen Desinfektionsmitteln und 70% Alkohol.
4. Um die chirurgische Ebene der Anästhesie zu bestätigen, kneifen Sie die Zehen der Hinterpfoten der Maus mit einer Pinzette zusammen. Machen Sie mit einer Schere einen Schnitt (2-3 cm) in die Haut zwischen den Ohren. Führen Sie eine Pinzette in den Schnitt ein, um die Haut und den Muskel um den Hals und die ventrale Seite zu trennen und auf der ventralen Seite speziell Platz für die Telemetrieplatzierung zu schaffen.
5. Führen Sie das Telemeter durch den Schnitt zwischen den Ohren ein und platzieren Sie es im ventralen Seitenraum.
6. Verwenden Sie eine Pinzette, um die positiven und negativen Leads zu rollen und zu bündeln. Platzieren Sie die Kabel im Halsraum (Abbildung 1B).
7. Vernähen Sie den Schnitt mit einer 13-mm-Nadel und einer 20-cm-Naht, wobei Sie darauf achten, dass die Elektroden nicht beschädigt werden.
8. Platzieren Sie die Maus in Rückenlage und zupfen Sie das Fell um das Schlüsselbein herum mit einer Haarschneidemaschine. Desinfizieren Sie die Haut dreimal mit abwechselnd jodhaltigen Desinfektionsmitteln und 70% Alkohol.
9. Machen Sie mit einer Schere einen kleinen Schnitt um die Schlüsselbeinhaut und trennen Sie die Muskeln von der Halshaut. Extrahieren Sie die positiven und negativen Elektroden mit einer Pinzette aus dem Nacken.
10. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Speicheldrüsen zu trennen und das "V-förmige" Aussehen des M. sternocleidomastoideus (SCM) freizulegen, der vom Schlüsselbein ausgeht und schräg über jede Seite des Halses verläuft (Abbildung 1C, D).
11. Passen Sie die Länge der Minusleitung an, um den SCM in der Nähe des Schlüsselbeins zu erreichen. Entfernen Sie vorsichtig den Bleischlauch von der Minusleitung und stellen Sie sicher, dass die aufgewickelte Edelstahlelektrode im Inneren mit einer feinen Pinzette gedehnt wird.
12. Führen Sie die Stichnadel (7 mm) mit einer 10 cm Naht durch die V-förmige Biegung des SCM, um eine Schlaufe zu erzeugen. Führen Sie die Edelstahlelektrode vom Minuspol durch diese Schleife und positionieren Sie sie unter dem SCM in der Nähe des Schlüsselbeins.
    1. Binden Sie die Schlaufe leicht zusammen, um eine Beschädigung des SCM zu vermeiden, und wiederholen Sie den Vorgang dreimal, um die Edelstahlelektrode zu sichern. Sichern Sie die negative Elektrode weiter, indem Sie die zweite Naht auf der kranialen Seite des SCM positionieren und um den Schlauch der negativen Elektrode binden (Abbildung 1E).
13. Führen Sie Schnitte um den Xiphoid-Prozess durch und trennen Sie vorsichtig die Haut vom Muskel vom Xiphoid-Prozess bis zum Schlüsselbein.
14. Verlängern Sie die positive Leitung, um den Xiphoid-Prozess zu erreichen. Ähnlich wie bei der Minusleitung entfernen Sie den Bleischlauch von der Plusleitung und stellen Sie sicher, dass die aufgewickelte Edelstahlelektrode im Inneren mit einer feinen Pinzette gedehnt wird.
15. Verwenden Sie eine 18-G-Nadel, um einen Tunnel unter dem Muskel um den Xiphoid-Prozess zu erzeugen, platzieren Sie dann die Edelstahlelektrode in einer Nadel und führen Sie sie durch den Muskel um den Xiphoid-Prozess.
16. Nach dem Entfernen der Nadel nähen Sie die aufgewickelte Edelstahlelektrode mit einer Nähnadel (7 mm) mit einer 10 cm langen Naht leicht an den Muskel um den Xiphoid-Prozess herum (Abbildung 1D). Um die positive Elektrode weiter zu sichern, positionieren Sie die zweite Naht auf der kranialen Seite des Xiphoidfortsatzes und binden Sie sie um den Schlauch der positiven Elektrode.
17. Verschließen Sie alle Schnitte mit einer Nahtnadel (13 mm) mit einer Nahtlänge von 20 cm (Abbildung 1E,F).
18. Platzieren Sie die Maus nach der Implantation in einem sauberen Käfig und positionieren Sie den Käfig auf der tBase, die als Empfänger für die Maustelemetrie dient (Abbildung 1G). Schalten Sie den beschreibbaren Computer ein und verwenden Sie die installierte Datenanalyse-Softwareanwendung, um EKG-Daten zu sammeln. Vergewissern Sie sich, dass die EKG-Daten normale Wellenformen anzeigen (Abbildung 2A,B).
    HINWEIS: Im Falle von abnormalen Wellenformen oder Rauschen (wie in Abbildung 2C gezeigt), schließen Sie die negativen und positiven Elektroden unter Narkose wieder an.
19. Stellen Sie während der zweitägigen Erholungsphase sicher, dass die Maus angemessen behandelt wird, indem Sie Wasser, Gel und Futter auf den Boden des Käfigs legen. Zeichnen Sie während dieses Wiederherstellungszeitraums nur das Verhalten des Heimkäfigs mit einem Laufwerksrekorder auf.

3. Aufzeichnung von EKGs und Käfigverhalten von der Trächtigkeit bis zur Entwöhnung

1. Schalten Sie während der Dunkelphase die roten Lichter ein, da der Laufwerksrekorder ohne Licht nicht funktionieren kann. Positionieren Sie den Laufwerksrekorder neben dem Home-Käfig, um das Verhalten aufzuzeichnen. Zeichnen Sie das EKG mit der LabChart-Anwendung auf dem beschreibbaren PC auf. Überprüfen Sie vor dem Erfassen der EKG-Daten die Abtastrate des EKGs in LabChart.
   HINWEIS: In diesem Protokoll wurde der Laufwerksrekorder gewählt, da er überall platziert werden kann. Darüber hinaus können Laufwerksrekorder im Vergleich zu einer Videokamera in einem Weitwinkel aufzeichnen und verbrauchen weniger Datenspeicherkapazität (z. B. verbraucht die Aufzeichnung von 24 Stunden mit einem Laufwerksrekorder etwa 70 GB). In dieser Demonstration ist die Abtastrate des EKGs in der Datenanalysesoftware auf 1 k/s eingestellt.
2. Starten Sie nach dem Einschalten des Laufwerksrekorders das LabChart auf dem Computer, um das Verhalten und das EKG aufzuzeichnen.
   HINWEIS: In dieser Demonstration wurde ein Makro verwendet, um das EKG kontinuierlich aufzuzeichnen und die Dateien automatisch alle 2 Stunden zu speichern. Dieser sich wiederholende Prozess wurde während des gesamten Experiments ausgeführt. Zusätzlich wurde eine 256 GB SD-Karte für die Aufzeichnung ausgewählt, die eine Datenerfassung von ca. 24 Stunden pro Tag ermöglicht.
3. Überprüfen Sie die Maus auf Geburts- und Körperanomalien und nehmen Sie Proben aus den Daten des Laufwerksrekorders und des beschreibbaren Computers. Der Tag, an dem die Maus ihre Jungen zur Welt brachte, gilt als postnataler Tag (PD) 0. Messen Sie das Gewicht der Welpen jeden Tag nach der Geburt.
   HINWEIS: In dieser Studie wurden das Aufzeichnungsvideo vom Laufwerksrekorder und die EKG-Datendatei vom beschreibbaren PC jeden Morgen von 7:30 bis 8:30 Uhr gesammelt. Um EKG-Lärm durch Vibrationen zu vermeiden, die durch mehrere Jungtiere verursacht wurden, die die Mutter berührten, wurde der Wurf auf vier Jungtiere ausgeteilt (die Hälfte von ihnen war männlich und die andere Hälfte weiblich).
4. Nachdem Sie die Maus überprüft und die Daten gesammelt haben, bringen Sie alles wieder in seine ursprüngliche Position. Schalten Sie den Laufwerksrekorder und den beschreibbaren Computer ein. Starten Sie die LabChart-Anwendung.
   HINWEIS: Wenn ein Makro zum Aufzeichnen des EKG verwendet wird, klicken Sie auf die Makroschaltfläche und initialisieren Sie das Makro, indem Sie die Schaltfläche Ausführen aus der Option Verwalten auswählen.
5. Ersetzen Sie den Käfig einmal pro Woche durch einen neuen. Beziehen Sie während dieses Prozesses die Einstreu mit ein, von der die Hälfte bereits verwendet wurde und die andere Hälfte neu ist.
   HINWEIS: Dieser Prozess, einschließlich Datenproben und Mauskontrollen, wurde von GD 17 bis zum 21. postnatalen Tag (PD) wiederholt.

4. Analyse der EKGs

1. Um die EKG-Daten zu analysieren, verwenden Sie die Datenanalysesoftware. Starten Sie LabChart und öffnen Sie die Datendatei für den Aufzeichnungszeitraum. Um die Herzfrequenzvariabilität (HRV) zu analysieren, klicken Sie auf die Schaltfläche HRV und passen Sie die Einstellungen für die Beat-Erkennung an.
   HINWEIS: Wählen Sie in dieser Demonstration die benutzerdefinierte Einstellung aus und ändern Sie die minimale Peakhöhe auf 1,2 für die Erkennungseinstellung.
2. Überprüfen Sie nach dem Anpassen der Einstellungen alle Beats und löschen Sie alle Rauschdaten (siehe Abbildung 2C).
   HINWEIS: Wenn eine R-Welle nicht erkannt wird, fügen Sie sie hinzu oder ändern Sie sie mit der HRV-Taste .
3. Klicken Sie auf die Schaltfläche HRV und wählen Sie die Ansicht des Beat-Klassifikators aus. Wählen Sie alle Beats in der Ansicht des Beat-Klassifikators aus und wählen Sie dann die Berichtsansicht über die Taste "HRV" aus. Kopieren Sie die Daten aus der Berichtsansicht, und fügen Sie sie in Excel ein.
   HINWEIS: Die HRV-Ergebnisse, wie in Tabelle 1 gezeigt, zeigen sowohl den Zeit- als auch den Spektrumbereich über die Datenanalysesoftware an, was eine Beobachtung ermöglicht.

5. Kategorisierung des Ethogramms des Verhaltens im Heimkäfig

1. Überprüfen Sie alle aufgezeichneten Videos, um nach Anomalien zu suchen, z. B. wenn das rote Licht während der Dunkelphase nicht aufleuchtet und der Laufwerksrekorder nicht funktioniert.
   HINWEIS: Das Video wird auf die gleiche Weise wie die EKGs aufgezeichnet, wobei die Videoclips alle 2 Stunden aufgenommen werden.
2. Kategorisieren Sie das Ethogramm basierend auf Parametern wie der Haltung der Mutter während des Verhaltens, der für das Verhalten aufgewendeten Zeit und dem Ort, an dem das Verhalten aufgetreten ist (Tabelle 2), und beobachten Sie dann das Video vom Laufwerksrekorder.

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Ergebnisse

Nach der Implantation des Telemeters in die trächtige Maus zeichneten wir die EKGs von der Trächtigkeit bis zur Stillzeit in einem Heimkäfig auf. Die Abtastrate wurde auf 1 k/s eingestellt. Um das EKG jedes physiologischen Zustands der Muttermaus zu vergleichen und gleichzeitig den Einfluss des zirkadianen Rhythmus zu vermeiden, wurden die 10-Minuten-Daten von 23:32 bis 23:42 Uhr zu GD 17, Geburt, PD 0 und PD 21 aus der 2-Stunden-Datendatei (Abbildung 3, ...

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Diskussion

Bei diesem Verfahren, bei dem das Telemeter in trächtige Mäuse implantiert wurde, konnte das EKG in ein und derselben Maus von der Schwangerschaft bis zur Stillzeit kontinuierlich verfolgt werden. Die Maus zeigte Ethogramme, die Bewegungen beinhalteten, was auf Wachheit während aller Analysezeiträume (23:32-23:42) von GD 17 bis PD 21 hindeutete. Darüber hinaus zeigten die vorliegenden Ergebnisse, dass die Herzfrequenz von der Schwangerschaft bis zur Stillzeit allmählich abnahm. Es ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-h repeating timer	Panasonic	WH3311BP
5-0 Nylon suture	Natsume Seisakusho Co	-23s-N2
Anesthesia box	Natsume Seisakusho Co	KN-1010	W110×D110×H110mm
Anesthesia mask	Natsume Seisakusho Co	KN-1019-1
Anesthesic machine	Natsume Seisakusho Co	KN-1071-E
C57BL6/J mice	Clea Japan, Inc		Pregnancy mouse at 14 day
Clip light	Yazawa corporation	CLX60X02WH
Configurator System	Adinstuments	TR190
drive recorder	Transcend	TS-DP250A-32G
Food holder	Clea Japan, Inc	CL-2802
Isoflurane	FujiFilM	099-06571
LabChart Pro V8	Adinstuments	MLU260/8
LabChart8	Adinstuments	MLS060/8
Mouse Biopotential Telemeter	Adinstuments	MT10B
Needle 18 G 1 1/2	Terumo	NN-1838R
Panel heater	SANKO	4976285145407
PowerLab 4/26	Adinstuments	PL2604
Recordable computer	Mouse computer	mouse K7-H
red light bulb	ELPA	LDG1R-G-GWP254
Rubber mask	Natsume Seisakusho Co	KN-1019-M
SD card (256GB)	Transcend	TS256GUSD350V	It can record approximately 24 h
Suture needle 13 mm	Natsume Seisakusho Co	C-24-540-NO.0
Suture needle 7 mm	Natsume Seisakusho Co	C-24-540-NO.0000
tBase	Adinstuments	MT110