Analyse des électrocardiogrammes et du comportement chez la souris de la grossesse à la période d’allaitement

Résumé

Un système de télémétrie a permis d’enregistrer simultanément l’activité autonome et le comportement maternel détaillé des souris mères, de la grossesse à la lactation. Cette méthode permet de comprendre la dynamique des caractéristiques physiologiques et comportementales chez les mères, de la grossesse au sevrage.

Résumé

Les changements dans la relation mère-progéniture sont vraisemblablement accompagnés de changements dynamiques dans le système nerveux autonome. Bien que des mesures temporelles de l’activité autonome aient été effectuées chez des mères et des nourrissons humains, l’analyse des changements à long terme reste inexplorée. Les mères souris peuvent nouer des liens sociaux avec leurs petits et avoir une courte période de gestation et de lactation, ce qui les rend utiles pour l’examen des changements physiologiques de la grossesse à l’élevage des petits. Par conséquent, un système de télémétrie a été utilisé pendant plusieurs semaines pour mesurer les changements dans le système nerveux autonome et le comportement des mères de souris. Les résultats actuels ont montré qu’un électrocardiogramme (ECG) pouvait être enregistré de manière stable quels que soient les mouvements des mères et de la parturition. L’analyse ECG a montré que la fréquence cardiaque diminuait progressivement de la gestation à l’allaitement, et que l’activité sympathique augmentait fortement au fur et à mesure que les petits se développaient. De plus, l’enregistrement simultané du comportement et de l’ECG dans la cage domestique nous a permis de comprendre les influences dépendantes du comportement sur l’ECG, révélant ainsi les caractéristiques de l’activité nerveuse autonome au cours de chaque comportement. Ainsi, la présente méthode expérimentale aide à comprendre comment les caractéristiques physiologiques des mères changent de la grossesse à l’élevage des petits, favorisant ainsi le développement sain des petits.

Introduction

La relation mère-progéniture est unique parmi les relations établies par diverses espèces animales en raison de son grand impact sur l’avenir de la progéniture¹. Chez l’homme, le développement et les comportements internes/externes des enfants sont influencés par le style parental ainsi que par l’ampleur de la maltraitance et de la négligence ^2,3. De même, chez les rongeurs, la qualité du comportement maternel a un impact significatif sur le développement et le comportement des petits ^4,5,6. Par conséquent, un suivi et un examen détaillés des comportements d’éducation des mères peuvent donner un aperçu des mécanismes des différences individuelles dans le développement et le soutien sain de leur progéniture.

Des études comportementales et physiologiques ont montré que les mères mammifères subissent des changements comportementaux et physiologiques dynamiques de la grossesse à l’allaitement. Lorsque les mammifères femelles tombent enceintes, la sécrétion d’œstrogènes et d’autres changements hormonaux influencent le comportement maternel⁷. Au fur et à mesure que la progéniture grandit et que la fréquence de la lactation diminue, la sécrétion hormonale change dynamiquement vers l’état pré-enceinte, mettant fin à l’expression du comportement maternel ^8,9,10. Ces résultats suggèrent que l’interaction entre le système endocrinien, le comportement maternel et le développement de la progéniture joue un rôle important dans les changements que les mères mammifères subissent pendant la grossesse et l’allaitement.

Les changements comportementaux et physiologiques chez les mères mammifères de la grossesse à l’allaitement sont étroitement liés non seulement au système endocrinien, mais aussi au système nerveux autonome ^11,12. Des études humaines suggèrent que le contact mère-enfant induit des changements dans le système nerveux autonome des mères et des nourrissons¹³. Plusieurs études ont mesuré l’électrocardiogramme (ECG) et la variabilité de la fréquence cardiaque chez les mères et les nourrissons humains, montrant que chaque comportement modifie la fréquence cardiaque et l’intervalle RR des autres 14,15,16. Cependant, il n’est pas clair comment les trois facteurs - système nerveux autonome, comportement maternel et développement de la progéniture - interagissent les uns avec les autres de la grossesse à l’allaitement. De plus, il est difficile de suivre ces interactions chez l’homme sur une longue période de temps, car la période de lactation humaine est d’environ deux ans.

Les rongeurs sont souvent utilisés à la place des humains dans de telles études. Le système nerveux autonome des rongeurs a été mesuré sous anesthésie ou lorsqu’il est isolé des petits pour éviter un enregistrement instable et des dommages à l’appareil de mesure ; Par conséquent, la mesure est temporelle dans des situations de restriction comportementale 17,18,19. Il est essentiel d’observer le système nerveux autonome dans un environnement où les rongeurs peuvent se déplacer librement et communiquer avec les autres, car les interactions mère-petit peuvent modifier le comportement et la physiologie des mères 8,9,10,15.

Cette méthode expérimentale a été développée pour permettre la libre circulation de la mère. Dans cette méthode, un télémètre ECG a été fixé par voie sous-cutanée à une mère enceinte pour éviter d’endommager l’appareil et permettre un enregistrement ECG stable à long terme, de la grossesse à l’allaitement. Les mères souris peuvent présenter des comportements généraux (auto-toilettage, prise de nourriture, etc.) et un comportement maternel habituel dans leur cage domestique ; par conséquent, chaque comportement et ECG peuvent être observés et comparés facilement dans la même souris. Un enregistreur de conduite a enregistré le comportement de la souris pendant 24 heures sur une période de quatre semaines. Ce protocole expérimental nous a permis de suivre les changements dynamiques de l’activité et du comportement autonomes de la grossesse à la période maternelle.

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Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’Université Azabu (#210319-30). Des souris C57B/6J pesant plus de 22 g au jour de gestation (JG) 14 ont été utilisées pour la présente étude. Les animaux ont été obtenus d’une source commerciale (voir la Table des matières). Les réactifs et l’équipement nécessaires à l’étude sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Préparation expérimentale

1. Allumez le panneau chauffant et couvrez-le de papier d’aluminium. Essuyez toutes les surfaces avec de l’éthanol à 70 %.
2. Tous les instruments chirurgicaux (ciseaux, pinces, pinces fines et pinces à épiler) ont été autoclavés à l’avance.
3. Préparez les sutures stériles à la longueur souhaitée et gardez-les prêtes.
4. Couvrez les masques d’anesthésie avec des masques en caoutchouc pour assurer la stérilité et le confort du patient.
5. Inspectez le télémètre de biopotentiel de la souris (Figure 1A) à la recherche d’anomalies ou de dommages à l’aide des applications tBase et LabChart (le logiciel d’analyse des données physiologiques) installées sur un ordinateur capable d’enregistrer.

2. Implantation du télémètre

1. Placez la souris dans une boîte d’anesthésie par induction avec 4 % d’isoflurane.
2. Après avoir atteint le plan chirurgical de l’anesthésie, placez la souris en position couchée sur le panneau chauffant. Positionnez le masque d’anesthésie sur la souris, en maintenant un taux d’isoflurane de 1 % à 2,0 % et un débit d’oxygène de 0,5 à 2 L/min.
   REMARQUE : Dans ce protocole, aucun analgésique n’a été utilisé, compte tenu de leurs effets sur le fœtus et des observations comportementales.
3. À l’aide d’une tondeuse, retirez la fourrure entre les oreilles et désinfectez la peau trois fois avec une alternance de désinfectants à base d’iode et d’alcool à 70 %.
4. Pour confirmer le plan chirurgical de l’anesthésie, pincez les orteils des pattes arrière de la souris à l’aide d’une pince à épiler. Faites une incision (2-3 cm) dans la peau entre les oreilles à l’aide de ciseaux. Insérez une pince dans l’incision pour séparer la peau et les muscles autour du cou et de la face ventrale, créant ainsi un espace sur la face ventrale spécifiquement pour le placement de la télémétrie.
5. Insérez le télémètre dans l’incision entre les oreilles et placez-le dans l’espace latéral ventral.
6. Utilisez des pinces pour rouler et regrouper les fils positifs et négatifs. Placez les fils dans l’espace du manche (Figure 1B).
7. Suturez l’incision à l’aide d’une aiguille de 13 mm et d’une suture de 20 cm, en prenant soin d’éviter d’endommager les sondes.
8. Placez la souris en position couchée et épilez la fourrure autour de la clavicule avec une tondeuse. Désinfectez la peau trois fois avec une alternance de désinfectants à base d’iode et d’alcool à 70 %.
9. Faites une petite incision autour de la peau de la clavicule avec des ciseaux et séparez les muscles de la peau du cou. Extrayez les fils positifs et négatifs de l’arrière du cou à l’aide d’une pince.
10. À l’aide d’une pince, séparez les glandes salivaires et exposez l’aspect en forme de « V » du muscle sterno-cléido-mastoïdien (MCS), qui prend naissance à la clavicule et se déplace obliquement de chaque côté du cou (figures 1C et D).
11. Ajustez la longueur du fil négatif pour atteindre le SCM près de la clavicule. Retirez soigneusement le tube en plomb du fil négatif, en vous assurant que l’électrode enroulée en acier inoxydable à l’intérieur est étirée à l’aide d’une pince à épiler fine.
12. Passez l’aiguille à coudre (7 mm) avec une suture de 10 cm dans le coude en forme de V du SCM pour créer une boucle. Passez l’électrode en acier inoxydable du fil négatif à travers cette boucle et positionnez-la sous le SCM près de la clavicule.
    1. Attachez légèrement la boucle pour éviter d’endommager le SCM et répétez l’opération trois fois pour fixer l’électrode en acier inoxydable. Fixez davantage la sonde négative en positionnant la deuxième suture sur le côté crânien de la MCS et en l’attachant autour du tube de la sonde négative (Figure 1E).
13. Effectuez une section autour de l’apophyse xiphoïde et séparez soigneusement la peau du muscle de l’apophyse xiphoïde à la clavicule.
14. Étendez l’avance positive pour atteindre le processus xiphoïde. Semblable au fil négatif, retirez le tube de plomb du fil positif, en vous assurant que l’électrode en acier inoxydable enroulée à l’intérieur est étirée à l’aide d’une pince à épiler fine.
15. Utilisez une aiguille de 18 G pour créer un tunnel sous le muscle autour du processus xiphoïde, puis placez l’électrode en acier inoxydable dans une aiguille et passez-la à travers le muscle autour du processus xiphoïde.
16. Après avoir retiré l’aiguille, suturez légèrement l’électrode enroulée en acier inoxydable sur le muscle autour du processus xiphoïde à l’aide d’une aiguille à coudre (7 mm) avec une suture de 10 cm (Figure 1D). Pour sécuriser davantage la sonde positive, positionnez la deuxième suture sur le côté crânien de l’apophyse xiphoïde et attachez-la autour du tube de la sonde positive.
17. Fermez toutes les incisions à l’aide d’une aiguille à coudre (13 mm) avec une longueur de suture de 20 cm (Figure 1E,F).
18. Après l’implantation, placez la souris dans une cage propre et positionnez-la sur la tBase, qui sert de récepteur pour la télémétrie de la souris (Figure 1G). Allumez l’ordinateur enregistrable et utilisez l’application logicielle d’analyse de données installée pour collecter les données ECG. Vérifiez que les données de l’ECG affichent des formes d’onde normales (Figure 2A,B).
    REMARQUE : En cas de formes d’onde ou de bruit anormaux (comme illustré à la Figure 2C), rattachez les fils négatif et positif sous anesthésie.
19. Pendant la période de récupération de deux jours, assurez-vous que la souris est traitée de manière appropriée en plaçant du gel d’eau et de la nourriture au fond de la cage. N’enregistrez que le comportement de la cage domestique avec un enregistreur de disque pendant cette période de récupération.

3. Enregistrement des ECG et du comportement en cage domestique de la grossesse au sevrage

1. Allumez les voyants rouges pendant la phase d’obscurité car l’enregistreur de conduite ne peut pas fonctionner sans lumière. Placez l’enregistreur de disque près de la cage d’accueil pour enregistrer le comportement. Enregistrez l’ECG à l’aide de l’application LabChart sur le PC enregistrable. Avant de collecter les données de l’ECG, vérifiez le taux d’échantillonnage de l’ECG dans LabChart.
   REMARQUE : Dans ce protocole, l’enregistreur de lecteur a été choisi car il peut être placé n’importe où. De plus, par rapport à une caméra vidéo, les enregistreurs d’entraînement peuvent enregistrer à un grand angle et utiliser moins de capacité de stockage de données (par exemple, l’enregistrement de 24 heures avec un enregistreur d’entraînement utilise environ 70 Go). Dans cette démonstration, la fréquence d’échantillonnage de l’ECG dans le logiciel d’analyse de données est fixée à 1 k/s.
2. Après avoir allumé l’enregistreur de lecteur, lancez le LabChart sur l’ordinateur pour enregistrer le comportement et l’ECG.
   REMARQUE : Dans cette démonstration, une macro a été utilisée pour enregistrer en continu l’ECG et sauvegarder automatiquement les fichiers toutes les 2 h. Ce processus répétitif a été exécuté tout au long de l’expérience. De plus, une carte SD de 256 Go a été sélectionnée à des fins d’enregistrement, ce qui a permis de collecter environ 24 heures de données par jour.
3. Vérifiez que la souris ne présente pas d’anomalies de la parturition et du corps et échantillonnez les données de l’enregistreur de disque et de l’ordinateur enregistrable. Le jour où la souris a donné naissance à ses petits est considéré comme le jour postnatal () 0. Mesurez le poids des chiots tous les jours après la naissance.
   REMARQUE : Dans cette étude, la vidéo d’enregistrement de l’enregistreur de disque et le fichier de données ECG de l’ordinateur enregistrable ont été recueillis tous les matins de 7 h 30 à 8 h 30. De plus, pour éviter le bruit de l’ECG dû aux vibrations causées par plusieurs petits touchant la mère, la portée a été réduite à quatre petits (la moitié d’entre eux étaient des mâles et l’autre moitié étaient des femelles).
4. Après avoir vérifié la souris et collecté les données, remettez tout à sa position d’origine. Allumez l’enregistreur de lecteur et l’ordinateur enregistrable. Démarrez l’application LabChart.
   REMARQUE : Si une macro est utilisée pour enregistrer l’ECG, cliquez sur le bouton macro et initialisez la macro en sélectionnant le bouton Exécuter dans l’option de gestion .
5. Une fois par semaine, remplacez la cage par une neuve. Au cours de ce processus, incluez la litière, dont la moitié est déjà utilisée et l’autre moitié est neuve.
   REMARQUE : Ce processus, y compris l’échantillonnage des données et les vérifications chez la souris, a été répété du JG 17 au jour postnatal () 21.

4. Analyse des ECG

1. Pour analyser les données ECG, utilisez le logiciel d’analyse de données. Démarrez LabChart et ouvrez le fichier de données pour la période d’enregistrement. Pour analyser la variabilité de la fréquence cardiaque (VFC), cliquez sur le bouton VFC et ajustez les paramètres de détection du battement.
   REMARQUE : Dans cette démonstration, sélectionnez le paramètre personnalisé et modifiez la hauteur de crête minimale à 1,2 pour le réglage de la détection.
2. Après avoir ajusté les paramètres, passez en revue tous les battements et supprimez toutes les données de bruit (comme illustré à la Figure 2C).
   REMARQUE : Si une onde R n’est pas détectée, ajoutez-la ou modifiez-la à l’aide du bouton HRV .
3. Cliquez sur le bouton HRV et sélectionnez la vue du classificateur de rythmes. Choisissez tous les battements dans la vue du classificateur de temps, puis sélectionnez la vue du rapport à partir du bouton HRV . Copiez les données de la vue du rapport et collez-les dans Excel.
   REMARQUE : Les résultats de la VRC, comme le montre le tableau 1, affichent à la fois les domaines temporel et spectral à l’aide du logiciel d’analyse de données, ce qui permet l’observation.

5. Catégoriser l’éthogramme du comportement en cage domestique

1. Examinez toutes les vidéos enregistrées pour vérifier s’il n’y a pas d’anomalies, telles que le voyant rouge qui ne s’allume pas pendant la phase d’obscurité et l’enregistreur de conduite qui ne fonctionne pas.
   REMARQUE : La vidéo est enregistrée de la même manière que les ECG, avec des clips vidéo capturés toutes les 2 heures.
2. Catégorisez l’éthogramme en fonction de paramètres tels que la posture de la mère pendant le comportement, le temps passé sur le comportement et l’endroit où le comportement s’est produit (Tableau 2), puis observez la vidéo à partir de l’enregistreur de disque.

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Résultats

Après avoir implanté le télémètre dans la souris enceinte, nous avons enregistré les ECG de la grossesse à l’allaitement dans une cage à domicile. La fréquence d’échantillonnage a été fixée à 1 k/s. Pour comparer l’ECG de chaque état physiologique de la souris mère tout en évitant l’influence du rythme circadien, les données de 10 min de 23:32 à 23:42 sur le JG 17, la parturition, la 0 et la 21 du fichier de données de 2 h (Figure 3

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Discussion

Dans cette méthode, dans laquelle le télémètre a été implanté dans des souris enceintes, l’ECG a pu être suivi en continu chez la même souris de la grossesse à l’allaitement. La souris présentait des éthogrammes qui incluaient le mouvement, indiquant l’éveil pendant toutes les périodes d’analyse (23:32-23:42) du JG 17 au 21. De plus, les résultats actuels ont montré que la fréquence cardiaque diminuait progressivement de la grossesse à l’allaitement. Cette dim...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-h repeating timer	Panasonic	WH3311BP
5-0 Nylon suture	Natsume Seisakusho Co	-23s-N2
Anesthesia box	Natsume Seisakusho Co	KN-1010	W110×D110×H110mm
Anesthesia mask	Natsume Seisakusho Co	KN-1019-1
Anesthesic machine	Natsume Seisakusho Co	KN-1071-E
C57BL6/J mice	Clea Japan, Inc		Pregnancy mouse at 14 day
Clip light	Yazawa corporation	CLX60X02WH
Configurator System	Adinstuments	TR190
drive recorder	Transcend	TS-DP250A-32G
Food holder	Clea Japan, Inc	CL-2802
Isoflurane	FujiFilM	099-06571
LabChart Pro V8	Adinstuments	MLU260/8
LabChart8	Adinstuments	MLS060/8
Mouse Biopotential Telemeter	Adinstuments	MT10B
Needle 18 G 1 1/2	Terumo	NN-1838R
Panel heater	SANKO	4976285145407
PowerLab 4/26	Adinstuments	PL2604
Recordable computer	Mouse computer	mouse K7-H
red light bulb	ELPA	LDG1R-G-GWP254
Rubber mask	Natsume Seisakusho Co	KN-1019-M
SD card (256GB)	Transcend	TS256GUSD350V	It can record approximately 24 h
Suture needle 13 mm	Natsume Seisakusho Co	C-24-540-NO.0
Suture needle 7 mm	Natsume Seisakusho Co	C-24-540-NO.0000
tBase	Adinstuments	MT110