임신부터 수유기까지 생쥐의 심전도 및 행동 분석

요약

임신부터 수유까지 어미 마우스의 자율신경 활동과 상세한 모성 행동을 동시에 기록하는 것은 원격 측정 시스템을 사용하여 달성되었습니다. 이 방법은 임신에서 이유식까지 산모의 생리적, 행동적 특성의 역학을 이해하는 데 도움이 됩니다.

초록

모체와 자손 관계의 변화는 아마도 자율신경계의 역동적인 변화를 동반하는 것으로 추정됩니다. 인간 어머니와 유아에서 자율신경 활동의 시간적 측정이 수행되었지만, 장기적인 변화에 대한 분석은 아직 밝혀지지 않았습니다. 어미 생쥐는 새끼와 사회적 유대감을 형성할 수 있고 임신과 수유 기간이 짧기 때문에 임신에서 새끼 양육에 이르는 생리적 변화를 검사하는 데 유용합니다. 따라서 몇 주 동안 원격 측정 시스템을 사용하여 자율 신경계의 변화와 생쥐 어미의 행동을 측정했습니다. 이번 연구 결과는 산모의 움직임과 분만에 관계없이 심전도(ECG)를 안정적으로 기록할 수 있음을 보여주었다. 심전도 분석 결과, 임신부터 수유까지 심박수가 점차 감소하고, 새끼가 성장함에 따라 교감신경 활동이 급격히 증가하는 것으로 나타났다. 또한, 가정용 케이지에서 행동과 ECG를 동시에 기록함으로써 ECG에 대한 행동 의존적 영향을 이해할 수 있었고, 이를 통해 각 행동 중 자율 신경 활동의 특성을 밝힐 수 있었습니다. 따라서, 본 실험방법은 임신부터 새끼 양육에 이르기까지 어미의 생리적 특성이 어떻게 변화하는지 이해하는 데 도움을 주어 새끼의 건강한 발달을 지원한다.

서문

모종과 자손의 관계는 자손의 미래에 큰 영향을 미치기 때문에 다양한 동물 종에 의해 형성된 관계 중에서도 독특하다¹. 인간의 경우, 아동의 발달과 내적/외적 행동은 양육 스타일뿐만 아니라 학대와 방치의 정도에 영향을 받는다 ^2,3. 마찬가지로, 설치류의 경우 모성 행동의 질이 강아지의 발달과 행동에 큰 영향을 미친다 ^4,5,6. 따라서 어미의 양육 행동에 대한 자세한 추적과 조사는 자손의 발달과 건강한 지원에 있어 개인차의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

행동 및 생리학적 연구에 따르면 포유류 어미는 임신에서 수유까지 역동적인 행동적, 생리학적 변화를 겪는다. 암컷 포유류가 임신을 하면 에스트로겐 및 기타 호르몬의 분비 변화가 모성 행동에 영향을 미친다⁷. 자손이 성장하고 수유 빈도가 감소함에 따라 호르몬 분비는 임신 전 상태로 동적으로 변화하여 모성 행동의 발현을 종식시킵니다 ^8,9,10. 이러한 결과는 내분비계, 모성 행동 및 자손 발달 간의 상호 작용이 포유류 어미가 임신과 수유 중에 경험하는 변화에 중요한 역할을 한다는 것을 시사합니다.

임신에서 수유에 이르기까지 포유류 어미의 행동적, 생리적 변화는 내분비계뿐만 아니라 자율신경계와도 밀접한 관련이 있다^11,12. 인체를 대상으로 한 연구에 따르면 엄마와 아기의 접촉은 엄마와 아기 모두의 자율신경계에 변화를 일으킨다¹³. 여러 연구에서 인간 산모와 영아의 심전도(ECG)와 심박수 변동성을 측정했으며, 각 행동이 다른 사람의 심박수와 RR 간격을 변화시킨다는 것을 보여주었습니다 14,15,16. 그러나 자율신경계, 모계 행동, 자손 발달의 세 가지 요인이 임신에서 수유까지 서로 어떻게 상호 작용하는지는 명확하지 않습니다. 더욱이, 인간의 수유 기간은 약 2년이기 때문에 장기간에 걸쳐 인간의 이러한 상호 작용을 모니터링하기는 어렵습니다.

이러한 연구에서는 인간 대신 설치류가 자주 사용됩니다. 설치류의 자율 신경계는 불안정한 기록 및 측정 장치의 손상을 방지하기 위해 마취 상태에서 또는 새끼와 격리 될 때 측정되었습니다. 따라서 측정은 행동적으로 제한된 상황 ^17,18,19에서 일시적입니다. 어미와 새끼의 상호 작용이 어미의 행동과 생리를 바꿀 수 있기 때문에 설치류가 자유롭게 움직이고 다른 사람들과 의사 소통할 수 있는 환경에서 자율 신경계를 관찰하는 것이 필수적입니다 ^8,9,10,15.

이 실험법은 어미가 자유롭게 움직일 수 있도록 개발된 것입니다. 이 방법에서는 ECG 원격 측정기를 임산부에게 피하로 부착하여 장치의 손상을 방지하고 임신부터 수유까지 안정적인 장기 ECG 기록이 가능했습니다. 어미 생쥐는 집 우리에서 일반적인 행동(자기 그루밍, 음식 섭취 등)과 일반적인 모성 행동을 보일 수 있습니다. 따라서 동일한 마우스에서 각 동작과 ECG를 쉽게 관찰하고 비교할 수 있습니다. 주행 기록장치는 4주 동안 24시간 동안 마우스의 동작을 기록했습니다. 이 실험 프로토콜을 통해 임신부터 출산 기간까지 자율신경 활동과 행동의 역동적인 변화를 추적할 수 있었습니다.

프로토콜

모든 절차는 Azabu University의 윤리 위원회(#210319-30)의 승인을 받았습니다. 본 연구에는 재태일(GD) 14의 체중이 22g이 넘는 C57B/6J 마우스가 사용되었습니다. 동물은 상업적 출처에서 얻었습니다 ( 재료 표 참조). 연구에 필요한 시약과 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 실험 준비

1. 패널 히터를 켜고 알루미늄 호일로 덮으십시오. 70% 에탄올로 모든 표면을 닦습니다.
2. 모든 수술 기구(가위, 겸자, 가는 핀셋 및 핀셋)는 사전에 고압멸균되었습니다.
3. 멸균 봉합사를 원하는 길이로 준비하고 준비하십시오.
4. 마취 마스크를 고무 마스크로 덮어 무균 상태와 환자의 편안함을 보장합니다.
5. 기록할 수 있는 컴퓨터에 설치된 tBase 및 LabChart(생리학적 데이터 분석 소프트웨어) 응용 프로그램을 사용하여 마우스 생체전위 텔레미터(그림 1A)에 이상이나 손상이 있는지 검사합니다.

2. 원격 측정기 이식

1. 마우스를 4% 이소플루란이 함유된 유도 마취 상자에 넣습니다.
2. 마취 수술 평면에 도달한 후 마우스를 패널 히터에 엎드린 자세로 놓습니다. 마우스에 마취 마스크를 놓고 1%-2.0%의 이소플루란 수준과 0.5-2L/min의 산소 흐름을 유지합니다.
   참고: 이 프로토콜에서는 진통제가 태아에 미치는 영향과 행동 관찰을 고려하여 진통제를 사용하지 않았습니다.
3. 클리퍼를 사용하여 귀 사이의 털을 제거하고 요오드 기반 소독제와 70% 알코올을 번갈아 가며 피부를 3회 소독합니다.
4. 마취의 수술 평면을 확인하려면 핀셋으로 마우스의 뒷발 발가락을 꼬집습니다. 가위를 사용하여 귀 사이의 피부를 절개 (2-3cm)하십시오. 절개 부위에 집게를 삽입하여 목과 복부 쪽 주위의 피부와 근육을 분리하고 원격 측정 배치를 위해 특별히 복부 쪽에 공간을 만듭니다.
5. 귀 사이의 절개 부위를 통해 텔레미터를 삽입하고 복부 쪽 공간에 놓습니다.
6. 집게를 사용하여 양극 및 음극 리드를 굴리고 묶습니다. 넥 공간에 리드를 놓습니다(그림 1B).
7. 13mm 바늘과 20cm 봉합사를 사용하여 절개 부위를 봉합하고 리드가 손상되지 않도록 주의합니다.
8. 마우스를 누운 자세로 놓고 클리퍼로 쇄골 주변의 털을 뽑습니다. 요오드 기반 소독제와 70% 알코올을 번갈아 가며 피부를 세 번 소독합니다.
9. 가위로 쇄골 피부 주위를 작게 자르고 목 피부에서 근육을 분리합니다. 집게를 사용하여 목 뒤쪽에서 양극 및 음극 리드를 추출합니다.
10. 겸자를 사용하여 침샘을 분리하고 쇄골에서 시작하여 목의 양쪽을 비스듬히 가로질러 이동하는 흉쇄유돌근(SCM)의 "V자형" 모양을 노출시킵니다(그림 1C, D).
11. 쇄골 근처의 SCM에 도달하도록 음극 리드의 길이를 조정합니다. 음극 리드에서 리드 튜브를 조심스럽게 제거하고 내부의 코일 스테인리스강 전극이 미세한 핀셋을 사용하여 늘어나도록 합니다.
12. 7cm 봉합사가 있는 재봉 바늘(10mm)을 SCM의 V자형 굴곡부에 통과시켜 고리를 만듭니다. 음극 리드의 스테인리스강 전극을 이 루프를 통해 통과시키고 쇄골 근처의 SCM 아래에 배치합니다.
    1. SCM이 손상되지 않도록 루프를 가볍게 묶고 스테인리스 스틸 전극을 고정하기 위해 세 번 반복합니다. 두 번째 봉합사를 SCM의 두개골 쪽에 배치하고 음극 리드의 튜브 주위에 묶어 음극 리드를 추가로 고정합니다(그림 1E).
13. xiphoid 돌기 주위를 절편화하고 xiphoid 돌기에서 쇄골에 이르기까지 근육에서 피부를 조심스럽게 분리합니다.
14. xiphoid 프로세스에 도달하기 위해 긍정적 인 리드를 확장하십시오. 음극 리드와 유사하게, 양극 리드에서 리드 튜브를 제거하고 내부의 코일 스테인리스강 전극이 미세한 핀셋을 사용하여 늘어나도록 합니다.
15. 18G 바늘을 사용하여 xiphoid 돌기 주변의 근육 아래에 터널을 만든 다음 스테인리스 스틸 전극을 바늘에 넣고 xiphoid 돌기 주변의 근육에 통과시킵니다.
16. 바늘을 제거한 후 10cm 봉합사가 있는 봉합 바늘(7mm)을 사용하여 코일형 스테인리스강 전극을 xiphoid 돌기 주변 근육에 가볍게 봉합합니다(그림 1D). 양성 리드를 더 확보하려면 두 번째 봉합사를 xiphoid 프로세스의 두개골 쪽에 배치하고 양극 리드의 튜브 주위에 묶습니다.
17. 봉합사 길이가 13cm인 재봉 바늘(20mm)을 사용하여 모든 절개 부위를 닫습니다(그림 1E, F).
18. 이식 후 마우스를 깨끗한 케이지에 넣고 마우스 원격 측정을 위한 수신기 역할을 하는 tBase에 케이지를 배치합니다(그림 1G). 기록 가능한 컴퓨터를 켜고 설치된 데이터 분석 소프트웨어 응용 프로그램을 사용하여 ECG 데이터를 수집합니다. ECG 데이터가 정상 파형을 표시하는지 확인합니다(그림 2A, B).
    알림: 비정상적인 파형 또는 잡음이 있는 경우( 그림 2C 참조) 마취 상태에서 음극 및 양극 리드를 다시 연결하십시오.
19. 이틀의 회복 기간 동안 케이지 바닥에 물, 젤, 음식을 놓아 마우스가 적절하게 치료되었는지 확인합니다. 이 복구 기간 동안 드라이브 레코더로 가정용 케이지 동작만 기록하십시오.

3. 임신부터 이유식까지 ECG 및 가정 케이지 행동 기록

1. 드라이브 레코더는 조명 없이는 작동할 수 없으므로 어두운 단계에서는 빨간색 표시등을 켜십시오. 드라이브 레코더를 홈 케이지 옆에 배치하여 동작을 기록하십시오. 기록 가능한 PC에서 LabChart 애플리케이션을 사용하여 ECG를 기록합니다. ECG 데이터를 수집하기 전에 LabChart에서 ECG의 샘플링 속도를 확인하십시오.
   참고: 이 프로토콜에서는 드라이브 레코더를 선택하여 어디에나 배치할 수 있습니다. 또한 비디오 카메라와 비교할 때 드라이브 레코더는 광각으로 녹화할 수 있으며 데이터 저장 용량을 덜 사용할 수 있습니다(예: 드라이브 레코더로 24시간 녹화하는 경우 약 70GB 사용). 이 데모에서는 데이터 분석 소프트웨어에서 ECG의 샘플링 속도가 1k/s로 설정되어 있습니다.
2. 드라이브 레코더를 켠 후 컴퓨터에서 LabChart를 실행하여 동작과 ECG를 기록합니다.
   참고: 이 데모에서는 매크로를 사용하여 ECG를 지속적으로 기록하고 2시간마다 파일을 자동으로 저장했습니다. 이 반복적인 과정은 실험 전반에 걸쳐 실행되었습니다. 또한 기록 목적으로 256GB SD 카드를 선택하여 하루에 약 24시간 동안 데이터를 수집할 수 있습니다.
3. 마우스에 분만 및 신체 이상이 있는지 확인하고 samp드라이브 레코더와 기록 가능한 컴퓨터의 데이터를 le. 쥐가 새끼를 낳은 날은 출생 후일(PD) 0로 간주됩니다. 출생 후 매일 새끼의 체중을 측정하십시오.
   참고: 본 연구에서는 드라이브 레코더의 녹화 영상과 녹화 가능한 PC의 ECG 데이터 파일을 매일 아침 7시 30분부터 8시 30분까지 수집했습니다. 또한 여러 마리의 새끼가 어미에게 닿을 때 발생하는 진동으로 인한 ECG 소음을 방지하기 위해 새끼를 4마리의 새끼(그 중 절반은 수컷, 나머지 절반은 암컷)로 도태시켰습니다.
4. 마우스를 확인하고 데이터를 수집한 후 모든 것을 원래 위치로 되돌립니다. 드라이브 레코더와 기록 가능한 컴퓨터를 켭니다. LabChart 응용 프로그램을 시작합니다.
   참고: 매크로를 사용하여 ECG를 기록하는 경우 매크로 버튼을 클릭하고 관리 옵션에서 실행 버튼을 선택하여 매크로를 초기화합니다.
5. 일주일에 한 번 케이지를 새 케이지로 교체하십시오. 이 과정에서 침구를 포함시키고, 그 중 절반은 이전에 사용되었고 나머지 절반은 새 침구입니다.
   참고: 데이터 샘플링 및 마우스 검사를 포함한 이 프로세스는 GD 17부터 산후일(PD) 21까지 반복되었습니다.

4. ECG 분석

1. ECG 데이터를 분석하려면 데이터 분석 소프트웨어를 사용하십시오. LabChart 를 시작하고 기록 기간 동안의 데이터 파일을 엽니다. 심박 변이도(HRV)를 분석하려면 HRV 버튼을 클릭하고 박동 감지 설정을 조정하십시오.
   참고: 이 데모에서는 사용자 지정 설정을 선택하고 감지 조정을 위해 최소 피크 높이를 1.2로 변경합니다.
2. 설정을 조정한 후 다시view 모든 비트를 삭제하고 노이즈 데이터를 삭제합니다( 그림 2C 참조).
   참고: R 웨이브가 감지되지 않으면 HRV 버튼을 사용하여 추가하거나 수정하십시오.
3. HRV 버튼을 클릭하고 비트 분류기 보기를 선택합니다. 비트 분류기 보기에서 모든 비트를 선택한 다음 HRV 버튼에서 보고서 보기를 선택합니다. 보고서 보기에서 데이터를 복사하여 Excel에 붙여넣습니다.
   참고: 표 1과 같이 HRV 결과는 데이터 분석 소프트웨어를 통해 시간 및 스펙트럼 영역을 모두 표시하여 관찰을 가능하게 합니다.

5. 가정 케이지 행동의 에토그램 분류

1. Review 녹화된 모든 비디오를 검토하여 어두운 단계에서 빨간색 표시등이 켜지지 않고 드라이브 레코더가 작동하지 않는 등의 이상을 확인하십시오.
   참고: 비디오는 ECG와 동일한 방식으로 녹화되며 비디오 클립은 2시간마다 캡처됩니다.
2. 행동 중 엄마의 자세, 행동에 소요된 시간, 행동이 발생한 위치(표 2)와 같은 매개변수를 기반으로 에토그램을 분류한 다음 주행 레코더에서 비디오를 관찰합니다.

결과

임신한 쥐에게 망원계를 이식한 후, 가정용 케이지에서 임신부터 수유까지의 ECG를 기록했습니다. 샘플링 속도는 1k/s로 설정되었습니다. 일주기 리듬의 영향을 피하면서 어미 마우스의 각 생리적 상태의 ECG를 비교하기 위해 2시간 데이터 파일(그림 3, 표 1)에서 GD 17, 분만, PD 0 및 PD 21에 대한 23:32부터 23:42까지의 10분 데이터를 분석했습니?...

토론

텔레미터를 임신한 마우스에 이식하는 이 방법에서는 임신부터 수유까지 동일한 마우스에서 ECG를 지속적으로 추적할 수 있습니다. 마우스는 GD 17부터 PD 21까지의 모든 분석 기간(23:32-23:42) 동안 각성을 나타내는 움직임을 포함하는 에토그램을 보였습니다. 또한, 본 연구 결과는 임신부터 수유기까지 심박수가 점진적으로 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 감소는 심박수?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-h repeating timer	Panasonic	WH3311BP
5-0 Nylon suture	Natsume Seisakusho Co	-23s-N2
Anesthesia box	Natsume Seisakusho Co	KN-1010	W110×D110×H110mm
Anesthesia mask	Natsume Seisakusho Co	KN-1019-1
Anesthesic machine	Natsume Seisakusho Co	KN-1071-E
C57BL6/J mice	Clea Japan, Inc		Pregnancy mouse at 14 day
Clip light	Yazawa corporation	CLX60X02WH
Configurator System	Adinstuments	TR190
drive recorder	Transcend	TS-DP250A-32G
Food holder	Clea Japan, Inc	CL-2802
Isoflurane	FujiFilM	099-06571
LabChart Pro V8	Adinstuments	MLU260/8
LabChart8	Adinstuments	MLS060/8
Mouse Biopotential Telemeter	Adinstuments	MT10B
Needle 18 G 1 1/2	Terumo	NN-1838R
Panel heater	SANKO	4976285145407
PowerLab 4/26	Adinstuments	PL2604
Recordable computer	Mouse computer	mouse K7-H
red light bulb	ELPA	LDG1R-G-GWP254
Rubber mask	Natsume Seisakusho Co	KN-1019-M
SD card (256GB)	Transcend	TS256GUSD350V	It can record approximately 24 h
Suture needle 13 mm	Natsume Seisakusho Co	C-24-540-NO.0
Suture needle 7 mm	Natsume Seisakusho Co	C-24-540-NO.0000
tBase	Adinstuments	MT110