Farelerde Gebelikten Emzirme Dönemine Kadar Elektrokardiyogramların ve Davranışların Analizi

Özet

Anne farelerin hamilelikten emzirmeye kadar otonomik aktivitesinin ve ayrıntılı anne davranışının eşzamanlı olarak kaydedilmesi, bir telemetri sistemi kullanılarak elde edildi. Bu yöntem, annelerde hamilelikten sütten kesmeye kadar fizyolojik ve davranışsal özelliklerin dinamiklerini anlamaya yardımcı olur.

Özet

Anne-yavru ilişkisindeki değişikliklere muhtemelen otonom sinir sistemindeki dinamik değişiklikler eşlik eder. Otonomik aktivitenin zamansal ölçümleri insan anne ve bebeklerde yapılmış olsa da, uzun vadeli değişikliklerin analizi keşfedilmemiştir. Fare anneler yavruları ile sosyal bağlar kurabilir ve kısa bir hamilelik ve emzirme dönemine sahip olabilirler, bu da onları hamilelikten yavru yetiştirmeye kadar fizyolojik değişikliklerin incelenmesi için faydalı kılar. Bu nedenle, otonom sinir sistemindeki değişiklikleri ve fare annelerinin davranışlarını ölçmek için birkaç hafta boyunca bir telemetri sistemi kullanıldı. Mevcut sonuçlar, bir elektrokardiyogramın (EKG) annelerin ve doğumun hareketlerinden bağımsız olarak stabil bir şekilde kaydedilebileceğini gösterdi. EKG analizi, kalp atış hızının hamilelikten emzirmeye kadar kademeli olarak azaldığını ve yavrular geliştikçe sempatik aktivitenin keskin bir şekilde arttığını gösterdi. Ayrıca, ev kafesinde davranış ve EKG'nin eş zamanlı olarak kaydedilmesi, EKG üzerindeki davranışa bağlı etkileri anlamamızı sağladı ve böylece her davranış sırasında otonom sinir aktivitesinin özelliklerini ortaya çıkardı. Bu nedenle, mevcut deneysel yöntem, annelerin fizyolojik özelliklerinin hamilelikten yavru yetiştirmeye kadar nasıl değiştiğini anlamaya yardımcı olur ve yavruların sağlıklı gelişimini destekler.

Giriş

Anne-yavru ilişkisi, yavruların geleceği üzerindeki büyük etkisi nedeniyle çeşitli hayvan türleri tarafından kurulan ilişkiler arasında benzersizdir¹. İnsanlarda, çocukların gelişimi ve içsel/dışsal davranışları, istismar ve ihmalin boyutunun yanı sıra ebeveynlik tarzından da etkilenmektedir ^2,3. Benzer şekilde, kemirgenlerde, anne davranışının kalitesi yavru gelişimi ve davranışı üzerinde önemli bir etkiye sahiptir ^4,5,6. Bu nedenle, annelerin besleyici davranışlarının ayrıntılı bir şekilde izlenmesi ve incelenmesi, yavrularının gelişimi ve sağlıklı desteklenmesindeki bireysel farklılıkların mekanizmaları hakkında fikir verebilir.

Davranışsal ve fizyolojik çalışmalar, memeli annelerin hamilelikten emzirmeye kadar dinamik davranışsal ve fizyolojik değişikliklere uğradığını göstermiştir. Dişi memeliler hamile kaldıklarında, östrojen ve diğer hormonların salgılanması anne davranışını etkiler⁷. Yavrular büyüdükçe ve laktasyon sıklığı azaldıkça, hormon salgılanması dinamik olarak hamilelik öncesi duruma doğru değişir ve anne davranışının ifadesine son verir ^8,9,10. Bu bulgular, endokrin sistem, anne davranışı ve yavru gelişimi arasındaki etkileşimin, memeli annelerin hamilelik ve emzirme döneminde yaşadıkları değişikliklerde önemli bir rol oynadığını göstermektedir.

Memeli annelerde gebelikten emzirmeye kadar olan davranışsal ve fizyolojik değişiklikler sadece endokrin sistemle değil, aynı zamanda otonom sinir sistemi ile de yakından ilişkilidir^11,12. İnsan çalışmaları, anne-bebek temasının hem annelerin hem de bebeklerin otonom sinir sisteminde değişikliklere neden olduğunu göstermektedir¹³. İnsan anne ve bebeklerde elektrokardiyogram (EKG) ve kalp atış hızı değişkenliğini ölçen birkaç çalışma, her davranışın diğerlerinin kalp atış hızını ve RR aralığını değiştirdiğini göstermiştir 14,15,16. Bununla birlikte, üç faktörün - otonom sinir sistemi, anne davranışı ve yavru gelişimi - hamilelikten emzirmeye kadar birbirleriyle nasıl etkileşime girdiği açık değildir. Ayrıca, insan laktasyon süresi yaklaşık iki yıl olduğu için insanlarda bu etkileşimleri uzun bir süre boyunca izlemek zordur.

Bu tür çalışmalarda genellikle insanlar yerine kemirgenler kullanılır. Kemirgenlerin otonom sinir sistemi, kararsız kaydı ve ölçüm cihazının hasar görmesini önlemek için anestezi altında veya yavrulardan izole edildiğinde ölçülmüştür; bu nedenle, davranışsal olarak kısıtlı durumlar altında ölçüm zamansaldır 17,18,19. Kemirgenlerin serbestçe hareket edebildiği ve başkalarıyla iletişim kurabildiği bir ortamda otonom sinir sistemini gözlemlemek önemlidir çünkü anne-yavru etkileşimleri annelerin davranışlarını ve fizyolojisini değiştirebilir 8,9,10,15.

Bu deneysel yöntem, annenin serbest dolaşımına izin vermek için geliştirilmiştir. Bu yöntemde, cihazın zarar görmesini önlemek ve hamilelikten emzirmeye kadar stabil uzun süreli EKG kaydına izin vermek için hamile bir anneye deri altından bir EKG telemetresi takıldı. Fare anneler ev kafeslerinde genel davranışlar (kendi kendini tımarlama, gıda alımı vb.) ve olağan anne davranışları sergileyebilir; bu nedenle, her davranış ve EKG'ler aynı farede kolayca gözlemlenebilir ve karşılaştırılabilir. Bir sürücü kaydedici, farenin davranışını dört haftalık bir süre boyunca 24 saat boyunca kaydetti. Bu deneysel protokol, hamilelikten annelik dönemine kadar otonomik aktivite ve davranıştaki dinamik değişiklikleri izlememize izin verdi.

Protokol

Tüm prosedürler Azabu Üniversitesi Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (#210319-30). Bu çalışma için gebelik gününde (GD) 14 ağırlığı 22 g'ın üzerinde olan C57B/6J fareleri kullanıldı. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz . Çalışma için gerekli olan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Deney hazırlığı

1. Panel ısıtıcısını açın ve alüminyum folyo ile kaplayın. Tüm yüzeyleri %70 etanol ile silin.
2. Tüm cerrahi aletler (makas, forseps, ince cımbız ve cımbız) önceden otoklavlandı.
3. Steril dikişleri istenilen uzunlukta hazırlayın ve hazır bulundurun.
4. Sterilite ve hasta konforunu sağlamak için anestezi maskelerini lastik maskelerle örtün.
5. Kayıt yapabilen bir bilgisayarda kurulu tBase ve LabChart (fizyolojik veri analiz yazılımı) uygulamalarını kullanarak fare biyopotansiyel telemetresinde (Şekil 1A) herhangi bir anormallik veya hasar olup olmadığını inceleyin.

2. Telemetre implantasyonu

1. Fareyi% 4 izofluran içeren bir indüksiyon anestezi kutusuna yerleştirin.
2. Anestezi cerrahi düzlemine ulaştıktan sonra, fareyi panel ısıtıcısı üzerinde yüzüstü pozisyonda yerleştirin. Anestezi maskesini, %1-2.0'lık bir izofluran seviyesini ve 0.5-2 L / dk'da bir oksijen akışını koruyarak farenin üzerine yerleştirin.
   NOT: Bu protokolde fetüs üzerine etkileri ve davranışsal gözlemler göz önünde bulundurularak herhangi bir analjezik kullanılmamıştır.
3. Kulaklar arasındaki tüyü çıkarmak için bir kesme makinesi kullanın ve cildi alternatif iyot bazlı dezenfektanlar ve% 70 alkol ile üç kez dezenfekte edin.
4. Anestezinin cerrahi düzlemini doğrulamak için, farenin arka pençelerinin ayak parmaklarını bir cımbız ile sıkıştırın. Makas kullanarak kulaklar arasındaki deride bir kesi (2-3 cm) yapın. Boyun ve ventral taraftaki cildi ve kasları ayırmak için insizyona forseps yerleştirin ve ventral tarafta özellikle telemetri yerleşimi için boşluk yaratın.
5. Telemetreyi kulaklar arasındaki kesiden geçirin ve ventral yan boşluğa yerleştirin.
6. Pozitif ve negatif uçları yuvarlamak ve demetlemek için forseps kullanın. Uçları boyun boşluğuna yerleştirin (Şekil 1B).
7. 13 mm'lik bir iğne ve 20 cm'lik bir dikiş kullanarak kesiği dikin ve derivasyonlara zarar vermemeye dikkat edin.
8. Fareyi sırtüstü pozisyona getirin ve bir makasla köprücük kemiğinin etrafındaki kürkü koparın. Cildi alternatif iyot bazlı dezenfektanlar ve% 70 alkol ile üç kez dezenfekte edin.
9. Köprücük kemiği derisinin etrafını makasla küçük bir kesi yapın ve kasları boyun derisinden ayırın. Forseps kullanarak pozitif ve negatif uçları boynun arkasından çıkarın.
10. Tükürük bezlerini ayırmak için forseps kullanın ve klavikula kemiğinden çıkan ve boynun her iki yanında eğik olarak hareket eden sternokleidomastoid kasın (SCM) "V şeklindeki" görünümünü ortaya çıkarın (Şekil 1C,D).
11. Klavikula yakınındaki SCM'ye ulaşmak için negatif ucun uzunluğunu ayarlayın. Kurşun boruyu negatif kablodan dikkatlice çıkarın ve içindeki sarmal paslanmaz çelik elektrotun ince cımbız kullanılarak gerildiğinden emin olun.
12. Dikiş iğnesini (7 mm) 10 cm'lik bir dikişle SCM'nin V şeklindeki kıvrımından geçirin ve bir halka oluşturun. Paslanmaz çelik elektrodu negatif kablodan bu döngüden geçirin ve klavikula yakınındaki SCM'nin altına yerleştirin.
    1. SCM'ye zarar vermemek için halkayı hafifçe bağlayın ve paslanmaz çelik elektrodu sabitlemek için üç kez tekrarlayın. İkinci ipliği SCM'nin kraniyal tarafına yerleştirerek ve negatif ucun hortumunun etrafına bağlayarak negatif ucu daha da sabitleyin (Şekil 1E).
13. Ksifoid sürecin etrafında kesit alma yapın ve cildi kastan ksifoid sürecinden klavikulaya kadar dikkatlice ayırın.
14. Ksifoid sürecine ulaşmak için pozitif ucu uzatın. Negatif kabloya benzer şekilde, kurşun boruyu pozitif kablodan çıkarın ve içindeki sarmal paslanmaz çelik elektrotun ince cımbız kullanılarak gerildiğinden emin olun.
15. Ksifoid işleminin etrafındaki kasın altında bir tünel oluşturmak için 18 G'lik bir iğne kullanın, ardından paslanmaz çelik elektrodu bir iğneye yerleştirin ve kifoid işleminin etrafındaki kasın içinden geçirin.
16. İğneyi çıkardıktan sonra, sarmal paslanmaz çelik elektrodu, 10 cm'lik bir dikişle bir dikiş iğnesi (7 mm) kullanarak ksifoid işleminin etrafındaki kaslara hafifçe dikin (Şekil 1D). Pozitif lead'ı daha da sabitlemek için, ikinci sütürü ksifoid prosesin kraniyal tarafına yerleştirin ve pozitif lead'ın hortumunun etrafına bağlayın.
17. Tüm kesileri 20 cm dikiş uzunluğunda bir dikiş iğnesi (13 mm) kullanarak kapatın (Şekil 1E,F).
18. İmplantasyondan sonra, fareyi temiz bir kafese yerleştirin ve kafesi, fare telemetrisi için alıcı görevi gören tBase üzerine yerleştirin (Şekil 1G). Kaydedilebilir bilgisayarı açın ve EKG verilerini toplamak için yüklü veri analizi yazılımı uygulamasını kullanın. EKG verilerinin normal dalga formlarını gösterip göstermediğini kontrol edin (Şekil 2A,B).
    NOT: Anormal dalga formları veya gürültü olması durumunda ( Şekil 2C'de gösterildiği gibi), negatif ve pozitif uçları anestezi altında yeniden takın.
19. İki günlük iyileşme süresi boyunca, kafesin dibine su jeli ve yiyecek koyarak farenin uygun şekilde tedavi edildiğinden emin olun. Bu kurtarma süresi boyunca bir sürücü kaydedici ile yalnızca ev kafesi davranışını kaydedin.

3. Hamilelikten sütten kesmeye kadar EKG'lerin ve ev kafesi davranışlarının kaydedilmesi

1. Karanlık aşamada kırmızı ışıkları açın, çünkü sürücü kaydedici ışık olmadan çalışamaz. Davranışı kaydetmek için sürücü kaydediciyi ev kafesinin yanına yerleştirin. Kaydedilebilir PC'deki LabChart uygulamasını kullanarak EKG kaydedin. EKG verilerini toplamadan önce, LabChart'ta EKG'nin örnekleme hızını doğrulayın.
   NOT: Bu protokolde, sürücü kaydedici herhangi bir yere yerleştirilebildiği için seçilmiştir. Ek olarak, bir video kamerayla karşılaştırıldığında, sürücü kaydediciler geniş bir açıda kayıt yapabilir ve daha az veri depolama kapasitesi kullanabilir (örneğin, bir sürücü kaydedici ile 24 saat kayıt yapmak yaklaşık 70 GB kullanır). Bu gösterimde, veri analiz yazılımındaki EKG örnekleme hızı 1 k/s olarak ayarlanmıştır.
2. Sürücü kaydediciyi açtıktan sonra, davranışı ve EKG'yi kaydetmek için bilgisayarda LabChart'ı başlatın.
   NOT: Bu gösterimde, EKG'yi sürekli olarak kaydetmek ve dosyaları her 2 saatte bir otomatik olarak kaydetmek için bir makro kullanılmıştır. Bu tekrarlayan işlem deney boyunca yürütüldü. Ek olarak, kayıt amacıyla 256 GB'lık bir SD kart seçildi ve günde yaklaşık 24 saat veri toplanmasına izin verildi.
3. Farede doğum ve vücut anormallikleri olup olmadığını kontrol edin ve sürücü kaydediciden ve kaydedilebilir bilgisayardan verileri örnekleyin. Farenin yavrularını doğurduğu gün, doğum sonrası gün (PD) 0 olarak kabul edilir. Doğumdan sonra her gün yavruların ağırlığını ölçün.
   NOT: Bu çalışmada, her sabah 7:30-8:30 saatleri arasında sürücü kayıt cihazından kaydedilen video ve kaydedilebilir PC'den EKG veri dosyası toplanmıştır. Ek olarak, birden fazla yavrunun anneye dokunmasının neden olduğu titreşimlerden kaynaklanan EKG gürültüsünü önlemek için, çöp dört yavruya (yarısı erkek, diğer yarısı dişi) ayrıldı.
4. Fareyi kontrol ettikten ve verileri topladıktan sonra, her şeyi orijinal konumuna geri getirin. Sürücü kaydediciyi ve kaydedilebilir bilgisayarı açın. LabChart uygulamasını başlatın.
   NOT: EKG kaydetmek için bir makro kullanılıyorsa, makro düğmesine tıklayın ve yönet seçeneğinden çalıştır düğmesini seçerek makroyu başlatın.
5. Haftada bir kez kafesi yenisiyle değiştirin. Bu işlem sırasında, yarısı daha önce kullanılmış ve diğer yarısı yeni olan yatak takımlarını dahil edin.
   NOT: Veri örneklemesi ve fare kontrolleri de dahil olmak üzere bu işlem, GD 17'den doğum sonrası gün (PD) 21'e kadar tekrarlandı.

4. EKG'lerin analiz edilmesi

1. EKG verilerini analiz etmek için veri analiz yazılımını kullanın. LabChart'ı başlatın ve kayıt dönemi için veri dosyasını açın. Kalp atış hızı değişkenliğini (HRV) analiz etmek için HRV düğmesine tıklayın ve atış algılama ayarlarını yapın.
   NOT: Bu gösterimde, özel ayarı seçin ve algılama ayarı için minimum tepe yüksekliğini 1.2 olarak değiştirin.
2. Ayarları yaptıktan sonra, tüm vuruşları gözden geçirin ve tüm gürültü verilerini silin ( Şekil 2C'de gösterildiği gibi).
   NOT: Bir R dalgası algılanmazsa, HRV düğmesini kullanarak ekleyin veya değiştirin.
3. HRV düğmesine tıklayın ve vuruş sınıflandırıcı görünümünü seçin. Vuruş sınıflandırıcı görünümünde tüm vuruşları seçin, ardından HRV düğmesinden rapor görünümünü seçin. Rapor görünümünden verileri kopyalayın ve Excel'e yapıştırın.
   NOT: HRV sonuçları, Tablo 1'de gösterildiği gibi, veri analiz yazılımı aracılığıyla hem zaman hem de spektrum alanlarını görüntüleyerek gözlem yapılmasını sağlar.

5. Ev kafesi davranışının etogramını kategorize etmek

1. Karanlık fazda kırmızı ışığın yanmaması ve sürücü kaydedicinin çalışmaması gibi anormallikleri kontrol etmek için kaydedilen tüm videoları inceleyin.
   NOT: Video, EKG'lerle aynı şekilde kaydedilir ve video klipler her 2 saatte bir çekilir.
2. Etogramı, annenin davranış sırasındaki duruşu, davranış için harcanan zaman ve davranışın meydana geldiği yer gibi parametrelere göre kategorilere ayırın (Tablo 2) ve ardından videoyu sürücü kaydediciden izleyin.

Sonuçlar

Telemetreyi hamile fareye yerleştirdikten sonra, EKG'leri hamilelikten emzirmeye kadar bir ev kafesinde kaydettik. Örnekleme hızı 1 k/s olarak ayarlandı. Sirkadiyen ritmin etkisinden kaçınırken anne farenin her fizyolojik durumunun EKG'sini karşılaştırmak için, 2 saatlik veri dosyasından GD 17, doğum, PD 0 ve PD 21'de 23:32 ile 23:42 arasındaki 10 dakikalık veriler (Şekil 3, Tablo 1) analiz edildi. 23:32 ile 23:42 arasında...

Tartışmalar

Telemetrenin hamile farelere implante edildiği bu yöntemde, EKG aynı farede hamilelikten emzirmeye kadar sürekli olarak izlenebilir. Fare, GD 17'den PD 21'e kadar tüm analiz dönemlerinde (23:32-23:42) uyanıklığı gösteren hareketi içeren etogramlar sergiledi. Ek olarak, mevcut sonuçlar kalp atış hızının hamilelikten emzirmeye kadar kademeli olarak azaldığını göstermiştir. Bu düşüşün kalp hızının normalleşmesine bağlı olduğu düşünülmektedir, çünkü...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-h repeating timer	Panasonic	WH3311BP
5-0 Nylon suture	Natsume Seisakusho Co	-23s-N2
Anesthesia box	Natsume Seisakusho Co	KN-1010	W110×D110×H110mm
Anesthesia mask	Natsume Seisakusho Co	KN-1019-1
Anesthesic machine	Natsume Seisakusho Co	KN-1071-E
C57BL6/J mice	Clea Japan, Inc		Pregnancy mouse at 14 day
Clip light	Yazawa corporation	CLX60X02WH
Configurator System	Adinstuments	TR190
drive recorder	Transcend	TS-DP250A-32G
Food holder	Clea Japan, Inc	CL-2802
Isoflurane	FujiFilM	099-06571
LabChart Pro V8	Adinstuments	MLU260/8
LabChart8	Adinstuments	MLS060/8
Mouse Biopotential Telemeter	Adinstuments	MT10B
Needle 18 G 1 1/2	Terumo	NN-1838R
Panel heater	SANKO	4976285145407
PowerLab 4/26	Adinstuments	PL2604
Recordable computer	Mouse computer	mouse K7-H
red light bulb	ELPA	LDG1R-G-GWP254
Rubber mask	Natsume Seisakusho Co	KN-1019-M
SD card (256GB)	Transcend	TS256GUSD350V	It can record approximately 24 h
Suture needle 13 mm	Natsume Seisakusho Co	C-24-540-NO.0
Suture needle 7 mm	Natsume Seisakusho Co	C-24-540-NO.0000
tBase	Adinstuments	MT110