PyOKR：一种量化光动反射追踪能力的半自动方法

摘要

我们在这里描述 PyOKR，这是一种半自动定量分析方法，可直接测量对二维图像运动的视觉反应产生的眼球运动。与以前的方法相比，基于 Python 的用户界面和分析算法可实现更高的吞吐量和更准确的眼动追踪参数定量测量。

摘要

对视觉刺激的行为反应的研究是理解视觉系统功能的关键组成部分。一个值得注意的反应是视动反射 （OKR），这是一种高度保守的先天行为，是视网膜图像稳定所必需的。OKR 提供了强大的图像跟踪读出能力，并已被广泛研究以了解来自不同遗传背景的动物的视觉系统电路和功能。OKR 包括两个阶段：当眼睛跟随刺激到达视觉平面边缘时的慢速跟踪阶段和重置眼睛在眼眶中位置的补偿性快速阶段扫视。以前的跟踪增益量化方法虽然可靠，但需要耗费大量人力，并且可能是主观的或任意推导的。为了获得更快速和可重复的眼动追踪能力量化，我们开发了一种新颖的半自动分析程序 PyOKR，除了适用于任何类型的视频眼动设备外，还可以量化响应任何方向刺激的二维眼动追踪运动。该方法提供自动过滤、慢速跟踪阶段的选择、垂直和水平眼矢量的建模、相对于刺激速度的眼球运动增益的量化，以及将结果数据组织到可用的电子表格中，用于统计和图形比较。这种定量和简化的分析管道可通过 PyPI 导入轻松访问，提供对 OKR 响应的快速直接测量，从而促进视觉行为响应的研究。

引言

图像稳定功能依赖于精确的动眼神经反应来补偿自我运动过程中发生的整体光流。这种稳定主要由两种运动反应驱动：视动反射 （OKR） 和前庭眼反射 （VOR）^1,2,3。穿过视网膜的缓慢整体运动会引起 OKR，从而引起相应方向的反射性眼睛旋转以稳定图像 ^1,2。这种运动称为慢期，被代偿性扫视打断，称为快期，其中眼睛向相反方向快速重置，以允许新的慢期。在这里，我们将这些快速阶段扫视定义为眼动追踪运动 （ETM）。VOR 依靠前庭系统引发眼球运动以补偿头部运动³，而 OKR 是通过 ON 的触发和随后向中脑中的辅助视系统 （AOS） 发出信号而在视网膜中启动^{的 4,5}。由于直接依赖视网膜回路，OKR 在研究和临床环境中经常用于确定视觉跟踪能力 ^6,7。

OKR 已作为评估基本视觉能力 ^2,6,8、DSGC 发育 9、^10、11、12、动眼神经反应¹³ 和遗传背景之间的生理差异 7 的工具进行了广泛研究。在受到移动刺激的头部固定动物中评估^{OKR 14}。动眼神经反应通常使用各种视频工具捕获，眼动追踪运动被捕获为水平和垂直方向的 OKR 波形⁹。为了量化跟踪能力，已经描述了两个主要指标：跟踪增益（眼睛相对于刺激速度的速度）和 ETM 频率（在给定时间范围内快速相位扫视的数量）。增益的计算历来用于直接测量眼睛的角速度以估计跟踪能力;然而，这些计算是劳动密集型的，可以根据视频眼图采集方法和随后的量化任意推导出来。为了更快速地评估 OKR，ETM 频率计数已用作测量跟踪敏锐度⁷ 的替代方法。尽管这提供了相当准确的跟踪能力估计，但这种方法依赖于间接度量来量化慢速相位响应，并引入了许多偏差。这些因素包括观察者在扫视测定中的偏差，在设定的时期内依赖于时间一致的扫视反应，以及无法评估慢期反应的幅度。

为了用当前的 OKR 评估方法解决这些问题，并实现 OKR 参数的高吞吐量深度量化，我们开发了一种新的分析方法来量化 OKR 波形。我们的方法使用一个名为“PyOKR”的基于 Python 的可访问软件平台。使用该软件，可以更深入地研究 OKR 慢相位响应的建模和量化，并增加参数化。该软件提供可访问且可重复的对无数视觉刺激反应的定量评估，以及响应水平和垂直运动的二维视觉跟踪。

研究方案

在约翰霍普金斯大学医学院 （JHUSOM） 进行的所有动物实验均已获得 JHUSOM 机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。在加州大学旧金山分校 （UCSF） 进行的所有实验均按照 UCSF 机构动物护理和使用计划批准的方案进行。

1. 行为数据收集

1. 使用所选的视频眼球摄影方法记录 OKR 眼球运动，以生成波形数据（即球面坐标中眼睛注视角度的时间序列）。
   注意：在 JHUSOM 收集的代表性数据是使用头柱植入手术和视频眼球造影获得的，如前所述 ^9,13（图 1）。从 UCSF 收集的代表性数据是通过头柱植入手术和视频眼球造影方法获得的，如前面的¹⁰ 所述（图 7）。
   1. 记下刺激和记录参数：记录帧速率、刺激速度和方向，以及刺激 epoch 之间和之后的时间长度。对于正弦刺激，还要注意刺激波的振幅和频率。
2. 将收集的波次数据导出为 .包含水平和垂直（方位角和仰角）波数据的 CSV 文件。
   1. 将波次数据组织为制表符分隔的 。CSV 文件，其中两列包含水平数据 （epxWave） 和垂直数据 （epyWave）。

2. 安装分析软件

1. 下载并安装 Python。
   1. 对于图形监督，请通过 Anaconda 安装 Spyder。
   2. 要确保图形在 Spyder 中正常运行，请转到 Ipython 控制台> Tools > Preferences，>图形>图形后端。将 Inline （内联） 设置为 Automatic （自动）。
2. 使用 Python 创建新的 Anaconda 环境。
3. 通过 PyPi 安装 PyOKR，使用 pip install PyOKR 安装最新版本以及包依赖项（补充编码文件 1 和 补充编码文件 2）
4. 如果使用的是 Windows 计算机，请从 PyOKR 运行 import OKR_win as o，然后运行 o.run（）。
5. 如果使用的是 Mac 计算机，请从 PyOKR 运行 import OKR_osx as o，然后运行 o.run（）。

3. 波浪数据分析

1. 初始化分析和文件导入
   1. 在 .py 脚本中运行 o.run（） 以打开用户界面。
   2. 在 “文件”下，使用函数 Open 或命令 Ctrl+O [iOS 命令] 打开一个浏览器，允许用户选择所需的波形文件。
   3. 在 文件下，使用 导出文件夹 按钮或命令 Ctrl+E 打开文件夹浏览器，该浏览器将允许选择将最终分析导出到的输出文件夹。
   4. 在 Output file （输出文件） 下以推荐的格式输入最终分析文件名，例如 AnimalGenotype_AnimalNumber_Analysis。
   5. 使用命令 File 下的 Set Subject 或命令 Ctrl+S 为单个动物设置程序，以初始化单个动物的数据集。
2. 波形文件参数的定义
   1. 要开始设置激励参数，请在 Select stimulus direction （选择激励方向 ） 下通过选择四个基本方向之一来定义方向性。对于正弦刺激，请相应地选择一个包含 （Horizontal） 或 （Vertical） 的刺激，其中主方向定义正弦波的初始方向。
   2. 将 Select stimulus type （选择激励类型 ） 下的 stimulus type （激励类型） 设置为 Unidirectional（单向）、 Oscillatory （振荡） 或 Oblique（倾斜）。
   3. 设置方向性后，导入自己的刺激位置数据集 （Import own stimulus vector data） 或根据参数自动生成向量 （Generate stimulus vector from parameters）。如果导入刺激向量，请继续 3.2.3.1，然后跳至步骤 3.3。如果生成刺激向量，请继续执行后续步骤。
      1. 如果导入自己的矢量数据，请以步骤 3.2.1 中描述的相同格式导入刺激的距离值（即，描述刺激在每个相邻采集帧之间移动多远的时间序列）。此外，将整个数据集作为一个 epoch 进行分析，而不是将其拆分为单独的 epoch，因为从 PyOKR v1.1.2 开始，尚未添加对导入的刺激值进行子集化的功能。
   4. 在 Stimulus parameters （刺激参数） 下，设置用于数据收集的刺激的参数。
      1. 使用 Head 和 Tail 设置给定试验的开始 （head） 和结束 （tail） 无刺激的时间长度。
      2. 设置显示刺激的时间量、之后无刺激的时间量以及给定试验中的总纪元数，分别具有 Length of epoch、 Length of post-stimulus 和 Number of epochs。
      3. 对于单向和倾斜刺激，使用 Horizontal Speed 和 Vertical Speed 设置刺激速度（以度/秒为单位）。
      4. 使用 Capture frame rate 设置采集相机的采集速率。
      5. 对于正弦刺激，生成正弦波，以使用 Frequency 和 Amplitude 对振荡刺激进行建模。
   5. 参数化后，使用 Generate stimulus vector from parameters 从上面输入的刺激信息中制作合适的模型。
   6. 使用 Select epoch 为输入的刺激选择给定的 epoch 以扫描总波文件。
3. 跟踪阶段的监督选择
   1. 要识别慢速跟踪区域，请单击“未筛选的数据”或“筛选的数据”，使用“初步调整”自动选择快速相位眼跳，这将根据最大速度变化标记潜在的眼跳。
   2. 在 Unfiltered Data （未筛选的数据） 下，确认已使用蓝点准确选择扫视。如果自动选择不准确，请使用 鼠标左键 （LMB） 手动删除点，或使用 鼠标右键 （RMB） 添加点。当充分选择快速相位扫视时，使用 鼠标中键 （MMB） 保存点并关闭图形。
   3. 如果需要自动筛选，请设置 Z 分数阈值 ，然后单击 筛选的数据 以自动筛选扫视。如有必要，请使用步骤 3.3.2 中描述的相同手动监督来消除任何噪音。
   4. 正确选择眼跳后，按 Point Adjustment（点调整 ）选择要删除的区域。通过前面的步骤 3.3.2 中描述的类似控制方案来更改顶部和底部。使用 LMB 或 RMB 编辑顶部（绿色）点，使用 Shift+LMB 或 Shift+RMB 编辑底部（红色）点。正确放置点后，使用 MMB 保存点。
      注意：如果使用 Mac，则底部和顶部点调整位于两个单独的按钮中，并遵循与步骤 3.3.2 中描述的相同的控制方案。
4. 慢速跟踪阶段分析
   1. 使用 Set Polynomial Order 设置多项式模型的顺序，以定义将拟合到各个慢速相位的多项式模型。
      注意：对于单向或倾斜刺激，默认值为 1，因为线性度是计算跟踪增益所必需的。对于正弦刺激，需要更高的阶数来模拟波的曲线，默认值为 15。
   2. 要分析迹线，请选择 Final Analysis 为选定的慢相生成慢相模型（图 2）（参见图 2A-D），并计算整个时期的平均距离、速度和跟踪增益（图 2E）。
   3. 要查看所选区域的二维 （2D） 或三维 （3D） 图形，请分别选择 “查看 2D 图形 ”或 “查看 3D 图形”。
   4. 选择 Add epoch 以保存在步骤 3.4.2 中生成的收集值。要查看给定动物的所有添加值以及收集的试验的平均值，请选择 View current dataset （查看当前数据集）。
   5. 添加纪元后，按照步骤 3.3.1 到 3.4.4 使用 Select epoch 循环浏览文件的其余部分。
   6. 完全分析波形文件后，通过打开新文件、设置适当的参数并相应地分析它们，对给定动物的所有其他文件重复此过程。通过对每个文件重复步骤 3.2.1-3.4.5，生成包含给定动物的所有波数据的最终数据集。
5. 数据的最终导出
   1. 完成给定动物的数据分析后，分析了所有方向或刺激，通过 Export data 导出数据集。
      注意：原始数据集将根据 输出文件名 导出，并沿 输出文件夹 设置的路径保存为 CSV，其中包含单个 epoch 数据以及每个刺激参数的总平均值。
   2. 导出单个动物后，使用 Ctrl+S 重新初始化数据集，然后重复前面的所有步骤以分析新动物。
   3. 如果需要，使用“分析”选项卡下的命令“对数据进行排序”重新组织为多只动物收集的所有输出数据，以便于分析。
      注意：此函数将编译和排序存储在输出文件夹中的所有分析动物文件的所有平均值，以便更轻松地生成图表和统计比较。排序依赖于 v1.1.2 及以上的文件命名。对每个文件使用步骤 3.1.4 中所述的推荐命名方案（例如， WT_123_Analysis）。

结果

为了验证上述分析方法，我们量化了从野生型小鼠和具有已知跟踪缺陷的条件敲除突变体收集的波迹的 OKR 跟踪增益。此外，为了测试我们分析方法的更广泛适用性，我们分析了来自不同视频眼影采集方法获得的单独野生型小鼠队列的痕迹。扫视的自动过滤有助于 OKR 数据处理和分析（图 3）。使用来自单向和正弦刺激的记录（图 1D），我们计算了野生?...

讨论

PyOKR 为研究眼球运动中反映的视觉反应提供了几个优势。这些功能包括准确性、可访问性和数据收集选项，以及整合参数化和可变刺激速度的能力。

直接眼动追踪增益评估提供了准确的眼动特征，与传统的快速相位眼跳 （ETM） 手动计数相比，这是一个更直接的定量指标。尽管扫视计数很有用，但它提供了对实际跟踪运动的间接评估。PyOKR 软件平台提供跟踪速度的直接量化，...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J  mice	Jackson Labs	664
Igor Pro	WaveMetrics	RRID: SCR_000325
MATLAB	MathWorks	RRID: SCR_001622
Optokinetic reflex recording chamber - JHUSOM	Custom-built	N/A	As described in Al-Khindi et al.(2022)9 and Kodama et al. (2016)13
Optokinetic reflex recording chamber - UCSF	Custom-built	N/A	As described in Harris and Dunn, 201510
Python	Python Software Foundation	RRID: SCR_008394
Tbx5 flox/+ mice	Gift from B. Bruneau	N/A	As described in Al-Khindi et al.(2022)9
Tg(Pcdh9-cre)NP276Gsat/Mmucd	MMRRC	MMRRC Stock # 036084-UCD; RRID: MMRRC_036084-UCD