JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

ここでは、2次元画像の動きに対する視覚反応に起因する眼球運動を直接測定する半自動定量分析法であるPyOKRについて説明します。Pythonベースのユーザーインターフェースと分析アルゴリズムにより、従来の方法よりも高いスループットと正確なアイトラッキングパラメータの定量的測定が可能になります。

要約

視覚刺激に対する行動反応の研究は、視覚系の機能を理解するための重要な要素です。注目すべき反応の1つは、網膜の画像安定化に必要な高度に保存された先天的な行動である視運動反射(OKR)です。OKRは、画像追跡能力の堅牢な読み出しを提供し、さまざまな遺伝的背景を持つ動物の視覚系回路と機能を理解するために広く研究されてきました。OKR は、視面の端への刺激を目が追う低速追跡フェーズと、眼窩内の目の位置をリセットする代償高速フェーズ サッケードの 2 つのフェーズで構成されます。ゲインの定量化を追跡する従来の方法は、信頼性は高いものの、労働集約的であり、主観的または任意に導き出される可能性があります。アイトラッキング能力のより迅速で再現性のある定量化を得るために、私たちは、あらゆるタイプのビデオ眼球撮影装置に適応できることに加えて、あらゆる方向刺激に応答する2次元アイトラッキング運動の定量化を可能にする新しい半自動分析プログラムPyOKRを開発しました。この方法では、自動フィルタリング、低速トラッキングフェーズの選択、垂直および水平の視線ベクトルのモデリング、刺激速度に対する眼球運動ゲインの定量化、および結果データの統計的およびグラフィカルな比較に使用できるスプレッドシートへの整理が提供されます。この定量的で合理化された分析パイプラインは、PyPIインポートを介して簡単にアクセスでき、OKR応答の迅速かつ直接的な測定を提供し、それによって視覚行動反応の研究を容易にします。

概要

手ぶれ補正は、自己運動中に発生する全体的な光学の流れを補正するために、正確な眼球運動反応に依存しています。この安定化は、主に視運動反射(OKR)と前庭眼反射(VOR)1,2,3の2つの運動反応によって駆動されます。網膜を横切るゆっくりとした全体的な動きはOKRを誘発し、OKRは対応する方向に反射的な眼の回転を誘発して画像を安定させます1,2。この動きは、遅相と呼ばれ、早速相と呼ばれる代償性サッカードによって中断され、目が反対方向に急速にリセットされ、新たな遅相が可能になります。ここでは、これらの高速位相のサッカードを視線追跡運動 (ETM) と定義します。VORが前庭系に依存して眼球運動を誘発し、頭部の動きを補うのに対し3、OKRはONの発火とそれに続く中脳の補助光学系(AOS)へのシグナル伝達によって網膜で開始されます4,5。網膜回路に直接依存しているため、OKRは、研究と臨床の両方の環境で視覚追跡能力を決定するために頻繁に使用されてきました6,7。

OKRは、基本的な視覚能力2,6,8、DSGC発達9,10,11,12、眼球運動反応13、および遺伝的背景間の生理学的違い7を評価するためのツールとして広く研究されてきました。OKRは、動刺激14を与えられた頭部固定動物で評価される。眼球運動反応は、典型的には、様々なビデオツールを用いて捕捉され、視線追跡運動は、水平方向および垂直方向のOKR波形として捕捉される9。トラッキング能力を定量化するために、トラッキングゲイン(刺激の速度に対する眼の速度)とETM周波数(特定の時間枠における高速位相サッカードの数)の2つの主要な指標が説明されています。ゲインの計算は、歴史的に、目の角速度を直接測定して追跡能力を推定するために使用されてきました。ただし、これらの計算は手間がかかり、ビデオ眼球撮影の収集方法とその後の定量化に基づいて任意に導き出すことができます。より迅速なOKR評価のために、ETM頻度のカウントは、追跡の鋭敏さを測定するための代替方法として使用されてきました7。これにより、トラッキング能力をかなり正確に推定できますが、この方法では、遅延位相応答を定量化するために間接的なメトリックに依存しており、多くのバイアスが生じます。これらには、サッカードの決定におけるオブザーバーバイアス、設定されたエポック全体で時間的に一貫したサッカード応答への依存、および遅い位相応答の大きさを評価できないことが含まれます。

現在のOKR評価アプローチでこれらの懸念に対処し、OKRパラメータの高スループットで詳細な定量化を可能にするために、OKR波形を定量化する新しい分析方法を開発しました。私たちのアプローチでは、「PyOKR」という名前のアクセス可能なPythonベースのソフトウェアプラットフォームを使用します。このソフトウェアを使用すると、OKRの遅い位相応答のモデリングと定量化を、より詳細に、より詳細に、より多くパラメータ化して研究することができます。このソフトウェアは、無数の視覚刺激に対する反応のアクセス可能で再現性のある定量的評価と、水平および垂直運動に応答する2次元の視覚的追跡を提供します。

プロトコル

ジョンズ・ホプキンス大学医学部(JHUSOM)で行われたすべての動物実験は、JHUSOMの動物管理・使用委員会(IACUC)によって承認されました。カリフォルニア大学サンフランシスコ校(UCSF)で行われたすべての実験は、UCSFのInstitutional Animal Care and Use Programによって承認されたプロトコルに従って行われました。

1. 行動データの収集

  1. 波のデータ (つまり、球面座標での目の視線角度の時系列) を生成するために選択したビデオ眼球撮影法を使用して OKR の眼球運動を記録します。
    注:JHUSOMで収集された代表的なデータは、前述の9,13(図1)のように、ヘッドポスト移植手術とビデオ眼鏡検査を使用して取得されました。UCSFから収集された代表的なデータは、前述の10(図7)で説明したように、ヘッドポスト移植手術とビデオ眼鏡法によって取得されました。
    1. 刺激と記録パラメータ(記録フレームレート、刺激の速度と方向、刺激エポック間と刺激エポック後の時間の長さ)をメモします。正弦波刺激の場合は、刺激波の振幅と周波数にも注意してください。
  2. 収集した wave データを .水平および垂直(方位角と仰角)の波データを含むCSVファイル。
    1. ウェーブ データをタブ区切りの .水平データ (epxWave) と垂直データ (epyWave) を含む 2 つの列を含む CSV ファイル。

2. 解析ソフトウェアのインストール

  1. Pythonをダウンロードしてインストールします。
    1. グラフの監視には、Anaconda経由でSpyderをインストールします。
    2. Spyderでグラフが正しく機能するようにするには、 Ipythonコンソール>グラフィック>グラフィックバックエンド>ツール>環境設定に移動します。 [Inline] を [Automatic] に設定します。
  2. Python を使用して新しい Anaconda 環境を作成します。
  3. pip install PyOKR を使用して PyPi 経由で PyOKR をインストールし、パッケージの依存関係 (補足コーディング ファイル 1 と補足コーディング ファイル 2) と共に最新バージョンをインストールします。
  4. Windows コンピューターを使用している場合は、 PyOKR インポート OKR_winから o として 実行し、次に o.run() として実行します。
  5. Mac コンピュータを使用している場合は、 PyOKR import OKR_osx から o として 実行し、 次に o.run() を実行します。

3. 波動データの分析

  1. 解析とファイルインポートの初期化
    1. .pyスクリプトで o.run() を実行して、ユーザーインターフェースを開きます。
    2. [ファイル]で、[開く]機能またはCtrl + O [iOSコマンド]コマンドを使用して、ユーザーが目的のウェーブファイルを選択できるブラウザを開きます。
    3. ファイルの下で、エクスポートフォルダボタンまたはコマンドCtrl+Eを使用してフォルダブラウザを開き、最終解析のエクスポート先となる出力フォルダを選択できます。
    4. [出力ファイル]の下に最終的な解析ファイル名をAnimalGenotype_AnimalNumber_Analysisなどの推奨形式で入力します。
    5. [ファイル]の下の[サブジェクトの設定]コマンドまたは[Ctrl]+[S]コマンドを使用して、個々の動物のデータセットを初期化し、個々の動物のプログラムを設定します。
  2. waveファイルパラメータの定義
    1. 刺激パラメータの設定を開始するには、[ Select stimulus direction ] で 4 つの基本方向のいずれかを選択して、指向性を定義します。正弦波刺激の場合、 それに応じて(水平) または (垂直) を含むものを選択し、基本方向が正弦波の初期方向を定義します。
    2. [Select stimulus type]で[Select stimulus type]で[Unidirectional]、[Oscillatory]、または[Oblique]のいずれかに設定します。
    3. 指向性を設定したら、自分の刺激位置データセットをインポートするか(自分の刺激ベクトルデータをインポート)、パラメータに基づいてベクトルを自動的に生成します(パラメータから刺激ベクトルを生成)。刺激ベクトルをインポートする場合は、3.2.3.1に進んでから、手順3.3にスキップします。スティミュラスベクトルを生成する場合は、次の手順に進みます。
      1. 独自のベクトルデータをインポートする場合は、ステップ3.2.1で説明したのと同じ形式で、刺激の距離値(つまり、刺激が隣接する各取得フレーム間を移動する距離を表す時系列)をインポートします。さらに、PyOKR v1.1.2 以降、インポートされた刺激値をサブセット化する機能は追加されていないため、データセット全体を個々のエポックに分割するのではなく、1 つのエポックとして分析します。
    4. 「Stimulus parameters」で、データ収集に使用するスティミュラスのパラメータを設定します。
      1. ヘッドとテールを使用して、特定の試行の開始時(ヘッド)と終了時(テール)で刺激を受けない時間の長さを設定します。
      2. 刺激が表示される時間、その後の無刺激時間、および特定の試行内の合計エポック数をそれぞれ [エポックの長さ]、[ 後刺激の長さ]、 および [エポック数] で設定します。
      3. 一方向刺激と斜め刺激の場合は、 Horizontal Speed と Vertical Speedを使用して刺激速度を度/秒で設定します。
      4. コレクションカメラのキャプチャレートを キャプチャフレームレートで設定します。
      5. 正弦波刺激の場合、 周波数 と 振幅を使用して振動刺激をモデル化するための正弦波を生成します。
    5. パラメータ化後、上記の入力された刺激情報から、 パラメータから刺激ベクトルを生成するを使用して適切なモデルを作成します。
    6. 入力された刺激の特定のエポックを選択し、[ エポックの選択 ]を使用して、全波ファイルをスキャンします。
  3. 追跡フェーズの監督付き選択
    1. トラッキングが遅い領域を特定するには、[Unfiltered Data] または [Filtered Data] をクリックして [Preliminary adjustment] で高速位相サッケードを自動的に選択します。これにより、最大速度の変化に基づいて潜在的なサッケードにラベルが付けられます。
    2. [フィルタリングされていないデータ] で、サッケードが青い点で正確に選択されていることを確認します。自動選択が正確でない場合は、マウスの左ボタン(LMB)でポイントを手動で削除するか、マウスの右ボタン(RMB)でポイントを追加します。高速位相サッケードが適切に選択されたら、マウスの中央ボタン(MMB)でポイントを保存し、グラフを閉じます。
    3. 自動フィルタリングが必要な場合は、 Zスコアしきい値 を設定し、[ フィルタリングされたデータ ]をクリックしてサッケードを自動的にフィルタリングします。必要に応じて、手順 3.3.2 で説明したのと同じ手動監視を使用して、ノイズを除去します。
    4. 適切なサッカードを選択した後、 Point Adjustment を押して、削除する領域を選択します。ステップ 3.3.2 で前述したのと同様の制御スキームを使用して、上部と下部のポイントを変更します。上(緑)のポイントを LMB または RMB で編集し、下(赤)のポイントを Shift+LMB または Shift+RMB で編集します。ポイントが正しく配置されている場合は、 MMB を使用してポイントを保存します。
      注:Macを使用している場合、下端と上端の調整は2つの別々のボタンにあり、手順3.3.2で説明されているのと同じ制御スキームに従います。
  4. スロートラッキングフェーズの解析
    1. Set Polynomial Order を使用して多項式モデルの順序を設定し、個々の低速フェーズに適合する多項式モデルを定義します。
      注:単方向または斜めの刺激の場合、トラッキングゲインを計算するには直線性が必要なため、デフォルト値は1です。正弦波刺激の場合、波の曲線をモデル化するには、既定値を 15 にすることで、より高い次数が必要です。
    2. トレースを解析するには、[最終解析]を選択して、選択した低速フェーズの低速フェーズモデル(図2)を生成し(図2A-Dを参照)、エポック全体で平均化された距離、速度、およびトラッキングゲインを計算します(図2E)。
    3. 選択した領域の 2 次元 (2D) または 3 次元 (3D) グラフを表示するには、それぞれ [2D グラフの表示 ] または [ 3D グラフの表示 ] を選択します。
    4. [ エポックの追加 ] を選択して、手順 3.4.2 で生成された収集された値を保存します。特定の動物に追加されたすべての値と、収集された試験の平均を表示するには、[ 現在のデータセットを表示] を選択します。
    5. エポックが追加されたら、ステップ 3.3.1 から 3.4.4 に従って、 Select epoch を使用してファイルの残りの部分を循環します。
    6. ウェーブ ファイルが完全に分析されたら、新しいファイルを開き、適切なパラメーターを設定し、それに応じて分析することで、特定の動物の他のすべてのファイルに対してこのプロセスを繰り返します。ファイルごとに手順 3.2.1 から 3.4.5 を繰り返して、特定の動物のすべてのウェーブ データを含む最終的なデータセットを生成します。
  5. データの最終エクスポート
    1. 特定の動物のデータ分析が完了したら、すべての方向または刺激を分析して、 データのエクスポートを使用してデータセットをエクスポートします。
      注:生のデータセットは、 出力ファイル名 に基づいてエクスポートされ、 出力フォルダ で設定されたパスに沿って、各刺激パラメータの合計平均を含む個々のエポックデータを含むCSVとして保存されます。
    2. 個々の動物をエクスポートした後、Ctrl + S キーでデータセットを再初期化し、前のすべての手順を繰り返して新しい動物を分析します。
    3. 必要に応じて、[解析] タブの [データの並べ替え] コマンドを使用して、複数の動物について収集されたすべての出力データを再編成し、解析を容易にします。
      注:この機能は、出力フォルダ内に保存されているすべての分析された動物ファイルのすべての平均値をコンパイルしてソートし、グラフの生成と統計的な比較を容易にします。ソートは、v1.1.2 以降のファイルの名前に依存します。各ファイルに対して、手順 3.1.4 で説明されている推奨命名スキーム ( WT_123_Analysis など) を使用します。

結果

上記の解析方法を検証するために、野生型マウスと既知のトラッキング欠損を持つ条件付きノックアウト変異体から収集された波動トレースのOKRトラッキングゲインを定量化しました。さらに、私たちの分析方法のより広範な適用性をテストするために、異なるビデオ眼球収集法を使用して取得した野生型マウスの別のコホートから得られたトレースを分析しました。サッケードの自動フィ?...

ディスカッション

PyOKRは、眼球運動に反映された視覚反応を研究するためにいくつかの利点を提供します。これには、精度、アクセシビリティ、データ収集オプション、パラメータ化や可変刺激速度を組み込む機能が含まれます。

ダイレクト・アイ・トラッキング・ゲイン評価は、眼球運動の正確な特性評価を提供し、従来の高速位相サッカード(ETM)の手動カウントよりも直接的な定量的?...

開示事項

著者には利益相反はありません。

謝辞

この研究は、R01 EY032095 (ALK)、VSTP Pre-doctoral Fellowship 5T32 EY7143-27 (JK)、F31 EY-033225 (SCH)、R01 EY035028 (FAD および ALK)、R01 EY-029772 (FAD) の支援を受けました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
C57BL/6J  miceJackson Labs664
Igor ProWaveMetricsRRID: SCR_000325
MATLABMathWorksRRID: SCR_001622
Optokinetic reflex recording chamber - JHUSOMCustom-builtN/AAs described in Al-Khindi et al.(2022)9 and Kodama et al. (2016)13 
Optokinetic reflex recording chamber - UCSFCustom-builtN/AAs described in Harris and Dunn, 201510
PythonPython Software FoundationRRID: SCR_008394
Tbx5 flox/+ miceGift from B. BruneauN/AAs described in Al-Khindi et al.(2022)9 
Tg(Pcdh9-cre)NP276Gsat/MmucdMMRRCMMRRC Stock # 036084-UCD; RRID: MMRRC_036084-UCD

参考文献

  1. Stahl, J. S. Using eye movements to assess brain function in mice. Vision Res. 44 (28), 3401-3410 (2004).
  2. Kretschmer, F., Tariq, M., Chatila, W., Wu, B., Badea, T. C. Comparison of optomotor and optokinetic reflexes in mice. J Neurophysiol. 118, 300-316 (2017).
  3. Bronstein, A. M., Patel, M., Arshad, Q. A brief review of the clinical anatomy of the vestibular-ocular connections - How much do we know. Eye. 29 (2), 163-170 (2015).
  4. Simpson, J. I. The accessory optic system. Ann Rev Neurosci. 7, 13-41 (1984).
  5. Hamilton, N. R., Scasny, A. J., Kolodkin, A. L. Development of the vertebrate retinal direction-selective circuit. Dev Biol. 477, 273-283 (2021).
  6. Dobson, V., Teller, D. Y. Visual acuity in human infants: a review and comparison of behavioral and electrophysiological studies. Vision Res. 18 (11), 1469-1483 (1978).
  7. Cahill, H., Nathans, J. The optokinetic reflex as a tool for quantitative analyses of nervous system function in mice: Application to genetic and drug-induced variation. PLoS One. 3 (4), e2055 (2008).
  8. Cameron, D. J., et al. The optokinetic response as a quantitative measure of visual acuity in zebrafish. J Vis Exp. (80), e50832 (2013).
  9. Al-Khindi, T., et al. The transcription factor Tbx5 regulates direction-selective retinal ganglion cell development and image stabilization. Curr Biol. 32 (19), 4286-4298 (2022).
  10. Harris, S. C., Dunn, F. A. Asymmetric retinal direction tuning predicts optokinetic eye movements across stimulus conditions. eLife. 12, 81780 (2015).
  11. Sun, L. O., et al. Functional assembly of accessory optic system circuitry critical for compensatory eye movements. Neuron. 86 (4), 971-984 (2015).
  12. Yonehara, K., et al. Congenital Nystagmus gene FRMD7 is necessary for establishing a neuronal circuit asymmetry for direction selectivity. Neuron. 89 (1), 177-193 (2016).
  13. Kodama, T., Du Lac, S. Adaptive acceleration of visually evoked smooth eye movements in mice. J Neurosci. 36 (25), 6836-6849 (2016).
  14. Stahl, J. S., Van Alphen, A. M., De Zeeuw, C. I. A comparison of video and magnetic search coil recordings of mouse eye movements. J Neurosci Methods. 99 (1-2), 101-110 (2000).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

OKR PyOKR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved