PyOKR: полуавтоматический метод количественной оценки способности отслеживания оптокинетических рефлексов

Резюме

Здесь мы опишем PyOKR, полуавтоматический метод количественного анализа, который напрямую измеряет движения глаз в результате зрительных реакций на движение двумерного изображения. Пользовательский интерфейс и алгоритм анализа на основе Python обеспечивают более высокую пропускную способность и более точные количественные измерения параметров отслеживания движения глаз по сравнению с предыдущими методами.

Аннотация

Изучение поведенческих реакций на визуальные стимулы является ключевым компонентом понимания функции зрительной системы. Одной из заметных реакций является оптокинетический рефлекс (OKR), высококонсервативное врожденное поведение, необходимое для стабилизации изображения на сетчатке. OKR обеспечивает надежное считывание возможностей отслеживания изображений и был тщательно изучен для понимания схем и функций зрительных систем у животных с различным генетическим происхождением. OKR состоит из двух фаз: медленной фазы слежения, когда глаз следует за стимулом к краю зрительной плоскости, и компенсаторной быстрой фазовой саккады, которая сбрасывает положение глаза на орбите. Предыдущие методы количественной оценки коэффициента усиления, хотя и надежны, трудоемки и могут быть субъективными или произвольными. Чтобы получить более быструю и воспроизводимую количественную оценку способности отслеживания движения глаз, мы разработали новую полуавтоматическую программу анализа PyOKR, которая позволяет количественно оценивать двумерное движение по отслеживанию движения глаз в ответ на любой направленный стимул, в дополнение к возможности адаптации к любому типу видеоокулграфического оборудования. Этот метод обеспечивает автоматическую фильтрацию, выбор медленных фаз отслеживания, моделирование вертикальных и горизонтальных векторов глаза, количественную оценку прироста движения глаз относительно скорости стимула и организацию полученных данных в удобную электронную таблицу для статистических и графических сравнений. Этот конвейер количественного и оптимизированного анализа, легко доступный через импорт PyPI, обеспечивает быстрое и прямое измерение реакций OKR, тем самым облегчая изучение визуальных поведенческих реакций.

Введение

Стабилизация изображения основана на точных глазодвигательных реакциях для компенсации глобального оптического потока, возникающего во время самостоятельного движения. Эта стабилизация обусловлена в первую очередь двумя двигательными реакциями: оптокинетическим рефлексом (OKR) и вестибуло-окулярным рефлексом (VOR)^1,2,3. Медленное глобальное движение по сетчатке индуцирует OKR, который вызывает рефлекторное вращение глаза в соответствующем направлении для стабилизации изображения ^1,2. Это движение, известное как медленная фаза, прерывается компенсаторными саккадами, известными как быстрая фаза, в которой глаз быстро перезагружается в противоположном направлении, чтобы обеспечить новую медленную фазу. Здесь мы определяем эти быстрофазные саккады как движения, отслеживающие взгляд (ETM). В то время как VOR полагается на вестибулярную систему для вызова движений глаз для компенсации движений головы³, OKR инициируется в сетчатке возбуждением ON и последующей передачей сигналов в вспомогательную оптическую систему (AOS) в среднем мозге ^4,5. Из-за своей прямой зависимости от цепей сетчатки, OKR часто используется для определения способности к визуальному отслеживанию как в исследовательских, так и в клинических условиях ^6,7.

OKR был широко изучен в качестве инструмента для оценки основных зрительных способностей ^2,6,8, развития DSGC ^9,10,11,12, глазодвигательных реакций¹³ и физиологических различий между генетическими фонами⁷. OKR оценивают у животных с фиксированной головой, которым предъявляли движущийся стимул¹⁴. Глазодвигательные реакции обычно фиксируются с помощью различных видеоинструментов, а движения, отслеживающие движение глаз, фиксируются в виде волн OKR в горизонтальном и вертикальном направлениях⁹. Для количественной оценки способности к отслеживанию были описаны два основных показателя: усиление отслеживания (скорость движения глаза относительно скорости стимула) и частота ETM (количество быстрых фазовых саккад за определенный период времени). Расчет усиления исторически использовался для непосредственного измерения угловой скорости глаза для оценки способности к слежению; Однако эти расчеты трудоемки и могут быть произвольно получены на основе методов видеоокулографии и последующей количественной оценки. Для более быстрой оценки OKR подсчет частоты ETM был использован в качестве альтернативного метода измерения остроты трекинга⁷. Несмотря на то, что это обеспечивает довольно точную оценку способности отслеживания, этот метод опирается на косвенную метрику для количественной оценки медленной фазовой реакции и вносит ряд погрешностей. К ним относятся смещение наблюдателя при определении саккады, зависимость от временных последовательных саккадических реакций в течение заданной эпохи и неспособность оценить величину медленной фазовой реакции.

Чтобы решить эти проблемы с помощью существующих подходов к оценке OKR и обеспечить высокую пропускную углубленную количественную оценку параметров OKR, мы разработали новый метод анализа для количественной оценки осциллограмм OKR. Наш подход использует доступную программную платформу на основе Python под названием «PyOKR». С помощью этого программного обеспечения можно изучать моделирование и количественную оценку медленных фазовых откликов OKR более глубоко и с повышенной параметризацией. Программное обеспечение обеспечивает доступную и воспроизводимую количественную оценку реакций на множество визуальных стимулов, а также двумерное визуальное отслеживание в ответ на горизонтальное и вертикальное движение.

протокол

Все эксперименты на животных, проведенные в Медицинской школе Университета Джона Хопкинса (JHUSOM), были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) при JHUSOM. Все эксперименты, проведенные в Калифорнийском университете в Сан-Франциско (UCSF), были проведены в соответствии с протоколами, утвержденными Программой институционального ухода за животными и их использования UCSF.

1. Сбор поведенческих данных

1. Записывайте движения глаз OKR с помощью выбранного метода видеоокулографии для генерации волновых данных (т. е. временного ряда угла взгляда глаза в сферических координатах).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные данные, собранные в JHUSOM, были получены с помощью операции по имплантации постыля головы и видеоокулографии, как описано ранее ^9,13 (Рисунок 1). Репрезентативные данные, собранные из UCSF, были получены с помощью операции по имплантации головного столба и метода видеоокулографии, как описано ранее на^{рисунке 10} (рис. 7).
   1. Обратите внимание на параметры стимула и записи: частоту кадров записи, скорость и направление стимула, а также промежутки времени между и после эпох стимулов. Для синусоидальных стимулов также обратите внимание на амплитуду и частоту волны стимула.
2. Экспорт собранных волновых данных в формате . CSV-файл, содержащий данные о горизонтальных и вертикальных волнах (по азимуту и углу места).
   1. Организация волновых данных в виде разделителей табуляцией . CSV-файл с двумя столбцами, содержащий горизонтальные данные (epxWave) и вертикальные данные (epyWave).

2. Установка аналитического программного обеспечения

1. Скачайте и установите Python.
   1. Для контроля графиков установите Spyder через Anaconda.
   2. Чтобы убедиться, что графики работают правильно в Spyder, перейдите в Инструменты > Настройки > Консоль Ipython > Графика > Графический бэкенд. Установите для параметра Встроенный значение Автоматически.
2. Создание новой среды Anaconda с помощью Python.
3. Установите PyOKR через PyPi с помощью pip install PyOKR для установки последней версии вместе с зависимостями пакета (Supplementary Coding File 1 и Supplementary Coding File 2)
4. Если используется компьютер с Windows, запустите OKR_win импорта PyOKR как o, а затем o.run().
5. Если используется компьютер Mac, запустите OKR_osx импорта PyOKR как o , а затем o.run().

3. Анализ волновых данных

1. Инициализация анализа и импорт файлов
   1. Запустите o.run() в .py скрипте, чтобы открыть пользовательский интерфейс.
   2. В разделе «Файл» используйте функцию «Открыть » или команду Ctrl+O [команда iOS] , чтобы открыть браузер, который позволит пользователю выбрать нужный файл wave.
   3. В разделе Файл используйте кнопку Экспорт папки или команду Ctrl+E , чтобы открыть браузер папок, который позволит выбрать выходную папку, в которую будут экспортированы окончательные анализы.
   4. Введите имя файла окончательного анализа в поле Выходной файл в рекомендуемом формате, например AnimalGenotype_AnimalNumber_Analysis.
   5. Задайте программу для отдельного животного с помощью команды Задать тему в разделе Файл или команды Ctrl+S , чтобы инициализировать набор данных для отдельного животного.
2. Определение параметров волнового файла
   1. Чтобы начать настройку параметров стимула, определите направленность в разделе Выбрать направление стимула , выбрав одно из четырех сторон света. Для синусоидальных стимулов выберите тот, который содержит (Горизонтальный) или (Вертикальный) соответственно, при этом кардинальное направление определяет начальное направление синусоидальной волны.
   2. Установите тип стимула в разделе Выберите тип стимула : Однонаправленный, Осцилляторный или Наклонный.
   3. После установки направленности импортируйте либо собственный набор данных о положении стимула (Import own stimulus vector data), либо автоматически сгенерируйте вектор на основе параметров (Generate stimulus vector from parameters). Если вы импортируете вектор стимула, перейдите к пункту 3.2.3.1, а затем перейдите к шагу 3.3. Если вы генерируете вектор стимула, перейдите к следующим шагам.
      1. Если вы импортируете собственные векторные данные, импортируйте значения расстояния до стимула (т.е. временной ряд, описывающий, как далеко стимул перемещается между каждым соседним кадром захвата) в том же формате, который описан в шаге 3.2.1. Кроме того, анализируйте весь набор данных как одну эпоху, а не разбивайте его на отдельные эпохи, так как функциональность для подмножества импортируемого значения стимула не была добавлена с версии PyOKR v1.1.2.
   4. В разделе Параметры стимула задайте параметры стимула, используемого для сбора данных.
      1. Установите продолжительность времени отсутствия стимула в начале (голова) и в конце (хвост) данного испытания с помощью функции «Орел и решка».
      2. Установите количество времени, в течение которого стимул отображается, количество времени отсутствия стимула после и общее количество эпох в рамках данного испытания с помощью Длины эпохи, Продолжительности после стимуляции и Числа эпох соответственно.
      3. Для однонаправленных и косых стимулов установите скорость стимула в градусах в секунду с помощью параметров «Горизонтальная скорость» и «Вертикальная скорость».
      4. Установите скорость съемки камеры сбора данных с помощью параметра Частота кадров захвата.
      5. Для синусоидальных стимулов сгенерируйте синусоидальную волну для моделирования колебательных стимулов с частотой и амплитудой.
   5. После параметризации создайте соответствующую модель на основе введенной выше информации о стимуле с помощью функции Создать вектор стимула из параметров.
   6. Выберите заданную эпоху для входного стимула с помощью функции Выбрать эпоху для сканирования файла всей волны.
3. Контролируемый выбор этапов отслеживания
   1. Чтобы определить области медленного отслеживания, автоматически выбирайте быстрые фазовые саккады с предварительной корректировкой , щелкнув «Неотфильтрованные данные » или «Отфильтрованные данные», которые пометят потенциальные саккады на основе максимальных изменений скорости.
   2. В разделе «Неотфильтрованные данные» убедитесь, что саккады выбраны точно с помощью синей точки. Если автоматический выбор неточен, вручную удалите точки с помощью левой кнопки мыши (ЛКМ) или добавьте точки с помощью правой кнопки мыши (ПКМ). Когда быстрые фазовые саккады выбраны правильно, сохраните точки с помощью средней кнопки мыши (MMB) и закройте график.
   3. Если требуется автоматическая фильтрация, установите пороговое значение Z-score и нажмите «Отфильтрованные данные », чтобы автоматически отфильтровать саккады. При необходимости используйте тот же ручной контроль, который описан в шаге 3.3.2, чтобы удалить любой шум.
   4. После правильного выбора саккады нажмите Point Adjustment , чтобы выбрать область для удаления. Измените верхнюю и нижнюю точки с помощью аналогичной схемы управления, описанной ранее в шаге 3.3.2. Редактирование верхних (зеленых) точек с помощью ЛКМ или ПКМ и редактирование нижних (красных) точек с помощью ЛКМ или Shift+ПКМ. Когда точки размещены правильно, используйте MMB для сохранения точек.
      ПРИМЕЧАНИЕ: при использовании Mac регулировка нижней и верхней точек осуществляется двумя отдельными кнопками и выполняется по той же схеме управления, которая описана в шаге 3.3.2.
4. Анализ фаз медленного отслеживания
   1. Задайте порядок полиномиальной модели с помощью инструмента Задать порядок полиномов , чтобы определить модель полинома, которая будет подогнана к отдельным медленным фазам.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для однонаправленных или косвенных стимулов значением по умолчанию является 1, так как линейность необходима для расчета усиления слежения. Для синусоидальных стимулов для моделирования кривой волны требуется более высокий порядок, по умолчанию 15.
   2. Чтобы проанализировать кривую, выберите Final Analysis (Окончательный анализ), чтобы создать модели медленной фазы (Рисунок 2) для выбранных медленных фаз (см. Рисунок 2A-D) и рассчитать расстояния, скорости и коэффициенты отслеживания, усредненные по эпохе (Рисунок 2E).
   3. Чтобы просмотреть двумерный (2D) или трехмерный (3D) график выбранных областей, выберите «Просмотреть 2D-график » или «Просмотреть 3D-график » соответственно.
   4. Выберите Добавить эпоху , чтобы сохранить собранные значения, созданные на шаге 3.4.2. Чтобы просмотреть все добавленные значения для данного животного, а также средние значения для собранных испытаний, выберите Просмотреть текущий набор данных.
   5. После добавления эпохи циклически просмотрите оставшуюся часть файла с помощью команды Выбрать эпоху, следуя шагам с 3.3.1 по 3.4.4.
   6. После того, как волновой файл будет полностью проанализирован, повторите этот процесс для всех остальных файлов для данного животного, открывая новые файлы, устанавливая соответствующие параметры и анализируя их соответствующим образом. Повторяя шаги 3.2.1-3.4.5 для каждого файла, сгенерируйте окончательный набор данных, содержащий все волновые данные для данного животного.
5. Окончательный экспорт данных
   1. После завершения анализа данных для данного животного со всеми указаниями или стимулами экспортируйте набор данных с помощью функции Экспорт данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исходный набор данных будет экспортирован на основе имени выходного файла и сохранен по пути, заданному выходной папкой , в виде CSV, содержащего данные об отдельных эпохах с общим средним значением для каждого параметра стимула.
   2. После экспорта отдельного животного повторно инициализируйте набор данных с помощью Ctrl+S, а затем повторите все предыдущие шаги для анализа нового животного.
   3. При необходимости реорганизуйте все выходные данные, собранные для нескольких животных, для упрощения анализа с помощью команды «Сортировать данные » на вкладке «Анализ ».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта функция компилирует и сортирует все средние значения для всех проанализированных файлов животных, хранящихся в выходной папке, чтобы упростить создание графиков и статистических сравнений. Сортировка зависит от именования файлов в версии 1.1.2. Используйте рекомендуемую схему именования, описанную в шаге 3.1.4 для каждого файла (например, WT_123_Analysis).

Результаты

Чтобы проверить описанный выше метод анализа, мы количественно оценили усиление слежения за OKR на волновых трассах, собранных у мышей дикого типа и условного нокаут-мутанта с известным дефицитом отслеживания. Кроме того, чтобы проверить более широкую применимость нашего метода анализ?...

Обсуждение

PyOKR дает несколько преимуществ для изучения зрительных реакций, отраженных в движениях глаз. К ним относятся точность, доступность и опции сбора данных, а также возможность включения параметризации и переменной скорости стимула.

Оценка усиления прямого отслеживания взг...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J  mice	Jackson Labs	664
Igor Pro	WaveMetrics	RRID: SCR_000325
MATLAB	MathWorks	RRID: SCR_001622
Optokinetic reflex recording chamber - JHUSOM	Custom-built	N/A	As described in Al-Khindi et al.(2022)9 and Kodama et al. (2016)13
Optokinetic reflex recording chamber - UCSF	Custom-built	N/A	As described in Harris and Dunn, 201510
Python	Python Software Foundation	RRID: SCR_008394
Tbx5 flox/+ mice	Gift from B. Bruneau	N/A	As described in Al-Khindi et al.(2022)9
Tg(Pcdh9-cre)NP276Gsat/Mmucd	MMRRC	MMRRC Stock # 036084-UCD; RRID: MMRRC_036084-UCD