PyOKR: Optokinetic Reflex Tracking Ability를 정량화하기 위한 반자동 방법

요약

여기에서는 2차원 이미지 움직임에 대한 시각적 반응으로 인한 안구 움직임을 직접 측정하는 반자동 정량 분석 방법인 PyOKR에 대해 설명합니다. Python 기반 사용자 인터페이스 및 분석 알고리즘을 사용하면 이전 방법보다 더 높은 처리량과 더 정확한 정량 측정이 가능합니다.

초록

시각적 자극에 대한 행동 반응에 대한 연구는 시각 시스템 기능을 이해하는 데 중요한 구성 요소입니다. 한 가지 주목할 만한 반응은 망막의 이미지 안정화에 필요한 고도로 보존된 타고난 행동인 광동태 반사(OKR)입니다. OKR은 이미지 추적 능력에 대한 강력한 판독 기능을 제공하며 다양한 유전적 배경을 가진 동물의 시각 시스템 회로 및 기능을 이해하기 위해 광범위하게 연구되었습니다. OKR은 눈이 시각 평면의 가장자리로 자극을 따라가는 느린 추적 단계와 안와에서 눈의 위치를 재설정하는 보상적 빠른 위상 saccade의 두 단계로 구성됩니다. 이전의 게인 정량화 추적 방법은 신뢰할 수 있지만 노동 집약적이며 주관적이거나 임의로 파생될 수 있습니다. 시선 추적 능력의 보다 빠르고 재현 가능한 정량화를 얻기 위해 우리는 모든 유형의 비디오 안구 촬영 장비에 적용할 수 있을 뿐만 아니라 모든 방향 자극에 대한 반응으로 2차원 시선 추적 동작을 정량화할 수 있는 새로운 반자동 분석 프로그램인 PyOKR을 개발했습니다. 이 방법은 자동 필터링, 느린 추적 단계 선택, 수직 및 수평 눈 벡터의 모델링, 자극 속도에 상대적인 안구 움직임 이득의 정량화, 결과 데이터를 통계 및 그래픽 비교를 위해 사용 가능한 스프레드시트로 구성합니다. PyPI 가져오기를 통해 쉽게 액세스할 수 있는 이 정량적이고 간소화된 분석 파이프라인은 OKR 응답을 빠르고 직접 측정하여 시각적 행동 응답에 대한 연구를 용이하게 합니다.

서문

이미지 안정화는 자기 동작 중에 발생하는 전체 광학 흐름을 보상하기 위해 정확한 안구 운동 반응에 의존합니다. 이 안정화는 주로 두 가지 운동 반응, 즉 광동태 반사(OKR)와 전정-안구 반사(VOR)^1,2,3에 의해 주도됩니다. 망막을 가로지르는 느린 글로벌 모션은 OKR을 유도하여 해당 방향으로 반사적인 눈 회전을 유도하여 이미지를 안정화합니다 ^1,2. 느린 단계(slow phase)로 알려진 이 움직임은 빠른 단계(fast phase)로 알려진 보상 사케이드(compensatory saccades)에 의해 중단되며, 이 단계에서 눈은 반대 방향으로 빠르게 재설정되어 새로운 느린 단계를 허용합니다. 여기서는 이러한 빠른 단계의 saccades를 ETM(시선 추적 움직임)으로 정의합니다. VOR은 머리^{의 움직임3}을 보상하기 위해 안구의 움직임을 유도하기 위해 전정계에 의존하는 반면, OKR은 ON의 발화와 중뇌의 AOS(Accessory Optic System)에 대한 후속 신호에 의해 망막에서 시작된다(^4,5). OKR은 망막 회로에 직접적으로 의존하기 때문에 연구 및 임상 환경 모두에서 시각적 추적 능력을 결정하는 데 자주 사용되어 왔습니다 ^6,7.

OKR은 기초^{시각 능력}2,6,8, DSGC 발달 9,10,11,12, 안구 운동 반응¹³ 및 유전적 배경 간의 생리적 차이7를 평가하기 위한 도구로 광범위하게 연구되어 왔다. OKR은 움직이는 자극(¹⁴)이 제시된 머리가 고정된 동물에서 평가된다. 눈 운동 반응은 일반적으로 다양한 비디오 도구를 사용하여 캡처되며, 시선 추적 동작은 수평 및 수직 방향9에서 OKR 파형으로 캡처^됩니다. 추적 능력을 정량화하기 위해 두 가지 주요 메트릭, 즉 추적 게인(자극의 속도에 대한 눈의 속도)과 ETM 주파수(주어진 시간 프레임 동안 빠른 위상 saccades의 수)가 설명되었습니다. 이득 계산은 추적 능력을 추정하기 위해 눈의 각속도를 직접 측정하는 데 역사적으로 사용되었습니다. 그러나 이러한 계산은 노동 집약적이며 비디오 안구 촬영 수집 방법 및 후속 정량화를 기반으로 임의로 파생될 수 있습니다. 보다 신속한 OKR 평가를 위해 ETM 빈도 계수가 추적 시력을 측정하는 대체 방법으로 사용되었다⁷. 이는 추적 능력에 대한 상당히 정확한 추정치를 제공하지만, 이 방법은 간접 메트릭에 의존하여 느린 위상 응답을 정량화하고 많은 편향을 도입합니다. 여기에는 saccade determination의 관찰자 편향, 설정된 epoch 전반에 걸쳐 시간적으로 일관된 saccadic 응답에 대한 의존, 느린 위상 응답의 규모를 평가할 수 없는 무능력이 포함됩니다.

현재 OKR 평가 접근 방식으로 이러한 문제를 해결하고 OKR 매개변수의 높은 처리량의 심층 정량화를 가능하게 하기 위해 OKR 파형을 정량화하는 새로운 분석 방법을 개발했습니다. 우리의 접근 방식은 "PyOKR"이라는 액세스 가능한 Python 기반 소프트웨어 플랫폼을 사용합니다. 이 소프트웨어를 사용하면 OKR 느린 위상 응답의 모델링 및 정량화를 더 깊이 있고 더 많은 매개변수화로 연구할 수 있습니다. 이 소프트웨어는 무수한 시각적 자극에 대한 반응에 대한 접근 가능하고 재현 가능한 정량적 평가와 수평 및 수직 움직임에 대한 2차원 시각적 추적을 제공합니다.

프로토콜

존스 홉킨스 의과대학(JHUSOM)에서 수행된 모든 동물 실험은 JHUSOM의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. UCSF(University of California, San Francisco)에서 수행된 모든 실험은 UCSF Institutional Animal Care and Use Program에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다.

1. 행동 데이터 수집

1. 파동 데이터(즉, 구형 좌표에서 눈의 시선 각도의 시계열)를 생성하기 위해 선택한 비디오 안구 조영 방법을 사용하여 OKR 눈의 움직임을 기록합니다.
   참고: JHUSOM에서 수집된 대표 데이터는^{앞서 설명한} 바와 같이 헤드포스트 이식 수술 및 비디오 안구 조영술을 사용하여 획득^{되었습니다(}그림 1). UCSF에서 수집된 대표 데이터는 이전¹⁰에서 설명한 바와 같이 헤드포스트 이식 수술 및 비디오 안구 조영술 방법을 통해 획득되었습니다(그림 7).
   1. 자극 및 기록 매개변수: 기록 프레임 속도, 자극 속도 및 방향, 자극 에포크 사이와 이후의 시간 길이를 기록하십시오. 정현파 자극의 경우 자극파의 진폭과 주파수도 주목하십시오.
2. 수집된 웨이브 데이터를 . 수평 및 수직(방위각 및 고도) 파동 데이터를 포함하는 CSV 파일입니다.
   1. 웨이브 데이터를 탭으로 구분된 로 구성합니다. 수평 데이터(epxWave)와 수직 데이터(epyWave)를 포함하는 두 개의 열이 있는 CSV 파일입니다.

2. 분석 소프트웨어 설치

1. Python을 다운로드하여 설치합니다.
   1. 그래프 감시를 위해 Anaconda를 통해 Spyder를 설치하십시오.
   2. Spyder에서 그래프가 올바르게 작동하도록 하려면 도구 > 기본 설정 > Ipython 콘솔 > 그래픽 > 그래픽 백엔드로 이동합니다. 인라인을 자동으로 설정합니다.
2. Python을 사용하여 새로운 Anaconda 환경을 만듭니다.
3. pip install PyOKR을 사용하여 PyPi를 통해 PyOKR을 설치하여 패키지 종속성(추가 코딩 파일 1 및 추가 코딩 파일 2)과 함께 최신 버전을 설치합니다.
4. Windows 컴퓨터를 사용하는 경우 PyOKR import OKR_win에서 o 로 실행한 다음 o.run()을 실행합니다.
5. Mac 컴퓨터를 사용하는 경우 PyOKR import OKR_osx에서 o 로 실행한 다음 o.run()으로 실행합니다.

3. 파동 데이터 분석

1. 분석 및 파일 가져오기 초기화
   1. .py 스크립트에서 o.run() 을 실행하여 사용자 인터페이스를 엽니다.
   2. 파일에서 열기 함수 또는 Ctrl+O [iOS 명령] 명령을 사용하여 사용자가 원하는 웨이브 파일을 선택할 수 있는 브라우저를 엽니다.
   3. 파일에서 폴더 내보내기 버튼 또는 Ctrl+E 명령을 사용하여 최종 해석을 내보낼 출력 폴더를 선택할 수 있는 폴더 브라우저를 엽니다.
   4. 출력 파일 아래에 최종 해석 파일 이름을 권장 형식(예: AnimalGenotype_AnimalNumber_Analysis)으로 입력합니다.
   5. 파일에서 주제 설정 명령을 사용하거나 Ctrl+S 명령을 사용하여 개별 동물에 대한 데이터셋을 초기화하여 개별 동물에 대한 프로그램을 설정합니다.
2. 웨이브 파일 매개변수의 정의
   1. 자극 파라미터 설정을 시작하려면, 4개의 기본 방향 중 하나를 선택하여 Select stimulus direction (자극 방향 선택 )에서 방향성을 정의하십시오. 정현파 자극의 경우 ( Horizontal) 또는 (Vertical) 이 포함된 것을 선택하고 기본 방향이 정현파의 초기 방향을 정의합니다.
   2. Select stimulus type(자극 유형 선택)에서 stimulus type(자극 유형)을 Unidirectional(단방향), Oscillatory(진동) 또는 Oblique(경사)로 설정합니다.
   3. 방향성을 설정한 후 자신의 자극 위치 데이터셋을 가져오거나(자체 자극 벡터 데이터 가져오기) 매개변수를 기반으로 벡터를 자동으로 생성합니다(매개변수에서 자극 벡터 생성). 자극 벡터를 가져오는 경우 3.2.3.1을 진행한 다음 3.3단계로 건너뜁니다. 자극 벡터를 생성하는 경우 다음 단계를 진행합니다.
      1. 자신의 벡터 데이터를 가져오는 경우 자극의 거리 값(즉, 자극이 인접한 각 획득 프레임 사이에서 얼마나 멀리 이동하는지 설명하는 시계열)을 3.2.1단계에서 설명한 것과 동일한 형식으로 가져옵니다. 또한 PyOKR v1.1.2부터 가져온 자극 값을 하위 집합으로 설정하는 기능이 추가되지 않았으므로 전체 데이터셋을 개별 epoch로 분할하지 않고 하나의 epoch로 분석하십시오.
   4. Stimulus parameters(자극 매개변수)에서 데이터 수집에 사용되는 자극의 매개변수를 설정합니다.
      1. Head and Tail을 사용하여 주어진 시도의 시작(머리)과 끝(꼬리)에서 자극이 없는 시간을 설정합니다.
      2. 자극이 표시되는 시간, 자극이 표시된 후 자극이 없는 시간, 주어진 시행 내의 총 epoch 수를 각각 Length of epoch, Length of post-stimulus 및 Number of Epochs로 설정합니다.
      3. 단방향 및 경사 자극의 경우 Horizontal Speed 와 Vertical Speed를 사용하여 자극 속도를 초당 각도로 설정합니다.
      4. Capture frame rate(캡처 프레임 속도)를 사용하여 수집 카메라의 캡처 속도를 설정합니다.
      5. 정현파 자극의 경우, Frequency 및 Amplitude를 사용하여 진동 자극을 모델링하기 위한 정현파를 생성합니다.
   5. 파라미터화 후에는 Generate stimulus vector from parameters를 사용하여 위에 입력된 자극 정보로부터 적절한 모델을 만듭니다.
   6. Select epoch를 사용하여 입력된 자극에 대해 지정된 epoch를 선택하여 전체 웨이브 파일을 스캔합니다.
3. 추적 단계의 감독된 선택
   1. 저속 추적 영역을 식별하려면 필터링되지 않은 데이터(Unfiltered Data) 또는 필터링된 데이터(Filtered Data)를 클릭하여 예비 조정을 통해 고속 위상 saccades를 자동으로 선택합니다. 이 경우 최대 속도 변화를 기반으로 잠재적 saccades에 레이블이 지정됩니다.
   2. 필터링되지 않은 데이터(Unfiltered Data)에서 saccades가 파란색 점으로 정확하게 선택되었는지 확인합니다. 자동 선택이 정확하지 않은 경우 마우스 왼쪽 버튼(LMB)으로 수동으로 포인트를 제거하거나 마우스 오른쪽 버튼(RMB)으로 포인트를 추가합니다. 빠른 위상 saccades가 적절하게 선택되면 가운데 마우스 버튼(MMB)으로 포인트를 저장하고 그래프를 닫습니다.
   3. 자동 필터링이 필요한 경우 Z-Score 임계값 을 설정하고 필터링된 데이터를 클릭하여 saccades를 자동으로 필터링합니다. 필요한 경우 3.3.2단계에서 설명한 것과 동일한 수동 감독을 사용하여 소음을 제거하십시오.
   4. 적절한 saccade 선택 후 Point Adjustment 를 눌러 제거할 영역을 선택합니다. 이전에 3.3.2단계에서 설명한 것과 유사한 제어 체계를 통해 상단 및 하단 지점을 변경합니다. LMB 또는 RMB 로 상단(녹색) 점을 편집하고 Shift+LMB 또는 Shift+RMB로 하단(빨간색) 점을 편집합니다. 포인트가 제대로 배치되면 MMB 를 사용하여 포인트를 저장합니다.
      알림: Mac을 사용하는 경우 하단 및 상단 지점 조정은 두 개의 별도 버튼에 있으며 3.3.2단계에서 설명한 것과 동일한 제어 체계를 따릅니다.
4. 느린 추적 단계 분석
   1. Set Polynomial Order를 사용하여 다항식 모델의 순서를 설정하여 개별 느린 위상에 맞출 다항식 모델을 정의합니다.
      참고: 단방향 또는 경사 자극의 경우, 추적 게인을 계산하기 위해 선형성이 필요하기 때문에 기본값은 1입니다. 정현파 자극의 경우 파동의 곡선을 모델링하기 위해 더 높은 차수가 필요하며 기본값은 15입니다.
   2. 트레이스를 분석하려면 최종 분석을 선택하여 선택한 느린 위상에 대한 느린 위상 모델(그림 2)을 생성하고(그림 2A-D 참조) Epoch(그림 2E)에 걸쳐 평균화된 거리, 속도 및 추적 게인을 계산합니다.
   3. 선택한 영역의 2차원(2D) 또는 3차원(3D) 그래프를 보려면 각각 2D 그래프 보기 또는 3D 그래프 보기를 선택합니다.
   4. epoch 추가를 선택하여 3.4.2단계에서 생성된 수집된 값을 저장합니다. 지정된 동물에 대한 모든 추가 값과 수집된 시행의 평균을 보려면 현재 데이터 세트 보기를 선택합니다.
   5. Epoch를 추가한 후 3.3.1에서 3.4.4 단계에 따라 Select epoch를 사용하여 파일의 나머지 부분을 순환합니다.
   6. 웨이브 파일이 완전히 분석되면 새 파일을 열고, 적절한 매개변수를 설정하고, 그에 따라 분석하여 지정된 동물에 대한 다른 모든 파일에 대해 이 프로세스를 반복합니다. 각 파일에 대해 3.2.1-3.4.5 단계를 반복하여 지정된 동물에 대한 모든 웨이브 데이터를 포함하는 최종 데이터 세트를 생성합니다.
5. 데이터의 최종 내보내기
   1. 지정된 동물에 대한 데이터 분석이 완료되면 모든 방향 또는 자극이 분석되면 데이터 내보내기를 통해 데이터 세트를 내보냅니다.
      참고: 원시 데이터셋은 출력 파일 이름을 기반으로 내보내지고 출력 폴더 에서 설정한 경로를 따라 각 자극 매개변수에 대한 총 평균과 함께 개별 epoch 데이터를 포함하는 CSV로 저장됩니다.
   2. 개별 동물을 내보낸 후 Ctrl+S를 사용하여 데이터셋을 다시 초기화한 다음 이전 단계를 모두 반복하여 새 동물을 분석합니다.
   3. 필요한 경우 분석 탭에서 데이터 정렬 명령을 사용하여 더 쉽게 분석할 수 있도록 여러 동물에 대해 수집된 모든 출력 데이터를 재구성합니다.
      참고: 이 함수는 출력 폴더에 저장된 분석된 모든 동물 파일의 모든 평균 값을 컴파일하고 정렬하여 그래프 및 통계 비교를 더 쉽게 생성할 수 있도록 합니다. 정렬은 v1.1.2의 파일 이름에 의존합니다. 각 파일(예: WT_123_Analysis)에 대해 3.1.4단계에서 설명한 대로 권장되는 명명 체계를 사용합니다.

결과

위에서 설명한 분석 방법을 검증하기 위해 야생형 마우스와 알려진 추적 결함이 있는 조건부 녹아웃 돌연변이에서 수집된 웨이브 트레이스에 대한 OKR 추적 이득을 정량화했습니다. 또한, 분석 방법의 광범위한 적용 가능성을 테스트하기 위해 다른 비디오 안구 촬영 수집 방법을 사용하여 획득한 야생형 마우스의 별도 코호트에서 파생된 흔적을 분석했습니다. saccades의 자동 필터링은 OKR 데이터 ?...

토론

PyOKR은 눈의 움직임에 반영된 시각적 반응을 연구하는 데 몇 가지 이점을 제공합니다. 여기에는 정확성, 접근성 및 데이터 수집 옵션뿐만 아니라 매개변수화 및 다양한 자극 속도를 통합할 수 있는 기능이 포함됩니다.

직접 시선 추적 게인 평가는 ETM(Fast Phase Saccades)의 기존 수동 계산보다 더 직접적인 정량 메트릭인 안구 움직임의 정확한 특성화를 제공합니다. saccade counting은 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J  mice	Jackson Labs	664
Igor Pro	WaveMetrics	RRID: SCR_000325
MATLAB	MathWorks	RRID: SCR_001622
Optokinetic reflex recording chamber - JHUSOM	Custom-built	N/A	As described in Al-Khindi et al.(2022)9 and Kodama et al. (2016)13
Optokinetic reflex recording chamber - UCSF	Custom-built	N/A	As described in Harris and Dunn, 201510
Python	Python Software Foundation	RRID: SCR_008394
Tbx5 flox/+ mice	Gift from B. Bruneau	N/A	As described in Al-Khindi et al.(2022)9
Tg(Pcdh9-cre)NP276Gsat/Mmucd	MMRRC	MMRRC Stock # 036084-UCD; RRID: MMRRC_036084-UCD