PyOKR: שיטה חצי-אוטומטית לכימות יכולת מעקב אחר רפלקסים אופטוקינטיים

James K. Kiraly; Scott C. Harris; Timour Al-Khindi; Felice A. Dunn; Alex L. Kolodkin

doi:10.3791/66779

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

אנו מתארים כאן את PyOKR, שיטת ניתוח כמותית חצי אוטומטית המודדת ישירות תנועות עיניים הנובעות מתגובות חזותיות לתנועת תמונה דו-ממדית. ממשק משתמש ואלגוריתם ניתוח מבוסס Python מאפשר תפוקה גבוהה יותר ומדידות כמותיות מדויקות יותר של פרמטרים למעקב אחר העיניים בהשוואה לשיטות קודמות.

Abstract

חקר תגובות התנהגותיות לגירויים חזותיים הוא מרכיב מרכזי בהבנת תפקוד מערכת הראייה. תגובה בולטת אחת היא רפלקס אופטוקינטי (OKR), התנהגות מולדת שמורה מאוד הנחוצה לייצוב התמונה על הרשתית. ה-OKR מספק קריאה חזקה של יכולת מעקב אחר תמונות ונחקר בהרחבה כדי להבין מעגלים ותפקוד של מערכות ראייה בבעלי חיים מרקעים גנטיים שונים. ה-OKR מורכב משני שלבים: שלב מעקב איטי כאשר העין עוקבת אחר גירוי לקצה מישור הראייה, וסקאדה פאזה מהירה מפצה המאפסת את מיקום העין במסלול. שיטות קודמות של מעקב אחר כימות רווחים, למרות שהן אמינות, הן עתירות עבודה ויכולות להיות סובייקטיביות או נגזרות שרירותיות. כדי להשיג כימות מהיר יותר וניתן לשחזור של יכולת מעקב עיניים, פיתחנו תוכנית ניתוח חצי-אוטומטית חדשנית, PyOKR, המאפשרת כימות של תנועת מעקב עיניים דו-ממדית בתגובה לכל גירוי כיווני, בנוסף להיותה ניתנת להתאמה לכל סוג של ציוד וידאו-אוקולוגרפיה. שיטה זו מספקת סינון אוטומטי, בחירת שלבי מעקב איטיים, מידול של וקטורי עין אנכיים ואופקיים, כימות של רווחי תנועת עיניים ביחס למהירות הגירוי, וארגון הנתונים המתקבלים לגיליון אלקטרוני שמיש לצורך השוואות סטטיסטיות וגרפיות. צינור ניתוח כמותי ויעיל זה, הנגיש בקלות באמצעות ייבוא PyPI, מספק מדידה מהירה וישירה של תגובות OKR, ובכך מקל על חקר תגובות התנהגותיות חזותיות.

Introduction

ייצוב תמונה מסתמך על תגובות אוקולומוטוריות מדויקות כדי לפצות על זרימה אופטית גלובלית המתרחשת במהלך תנועה עצמית. ייצוב זה מונע בעיקר על ידי שתי תגובות מוטוריות: רפלקס אופטוקינטי (OKR) ורפלקס ווסטיבולו-עיני (VOR)^1,2,3. תנועה גלובלית איטית על פני הרשתית גורמת ל-OKR, אשר מעורר סיבוב עיניים רפלקסיבי בכיוון המתאים כדי לייצב את התמונה ^1,2. תנועה זו, המכונה השלב האיטי, נקטעת על ידי סקאדות מפצות, הידועות בשם השלב המהיר, שבו העין מתאפסת במהירות בכיוון ההפוך כדי לאפשר פאזה איטית חדשה. כאן, אנו מגדירים סקאדות שלב מהיר אלה כתנועות מעקב עיניים (ETM). בעוד שה-VOR מסתמך על מערכת שיווי המשקל כדי לעורר תנועות עיניים כדי לפצות על תנועות ראש³, ה-OKR מופעל ברשתית על ידי ירי ON ואיתות עוקב למערכת האופטית האביזר (AOS) במוח התיכון ^4,5. בשל הסתמכותו הישירה על מעגלי רשתית, ה-OKR שימש לעתים קרובות לקביעת יכולת מעקב חזותית הן במחקר והן במסגרות קליניות ^6,7.

ה-OKR נחקר רבות ככלי להערכת יכולת ראייה בסיסית ^2,6,8, התפתחות DSGC ^9,10,11,12, תגובות אוקולומוטוריות¹³ והבדלים פיזיולוגיים בין רקע גנטי⁷. ה-OKR מוערך בחיות מקובעות ראש המוצגות עם גירוי נע¹⁴. תגובות אוקולומוטוריות נלכדות בדרך כלל באמצעות מגוון כלי וידאו, ותנועות מעקב עיניים נלכדות כצורות גל OKR בכיוונים אופקיים ואנכיים⁹. כדי לכמת את יכולת המעקב, תוארו שני מדדים עיקריים: רווח מעקב (מהירות העין ביחס למהירות הגירוי) ותדירות ETM (מספר סקאדות הפאזה המהירה על פני מסגרת זמן נתונה). חישוב הרווח שימש היסטורית למדידה ישירה של המהירות הזוויתית של העין כדי להעריך את יכולת המעקב; עם זאת, חישובים אלה הם עתירי עבודה וניתן לגזור אותם באופן שרירותי בהתבסס על שיטות איסוף וידאו-אוקוקולוגרפיה וכימות לאחר מכן. להערכת OKR מהירה יותר, ספירה של תדר ETM שימשה כשיטה חלופית למדידת חדות מעקב⁷. למרות שזה מספק הערכה מדויקת למדי של יכולת מעקב, שיטה זו מסתמכת על מדד עקיף כדי לכמת את תגובת הפאזה האיטית ומציגה מספר הטיות. אלה כוללים הטיית צופה בקביעת סקאדה, הסתמכות על תגובות סקאדיות עקביות זמנית לאורך תקופה קבועה, וחוסר יכולת להעריך את עוצמת תגובת הפאזה האיטית.

על מנת להתמודד עם חששות אלה עם גישות הערכת OKR הנוכחיות ולאפשר כימות מעמיק בתפוקה גבוהה של פרמטרים של OKR, פיתחנו שיטת ניתוח חדשה לכימות צורות גל OKR. הגישה שלנו משתמשת בפלטפורמת תוכנה נגישה מבוססת Python בשם "PyOKR". באמצעות תוכנה זו, מידול וכימות של תגובות פאזה איטית OKR ניתן ללמוד לעומק רב יותר עם פרמטרים מוגברת. התוכנה מספקת הערכות כמותיות נגישות וניתנות לשחזור של תגובות למספר עצום של גירויים חזותיים וגם מעקב חזותי דו מימדי בתגובה לתנועה אופקית ואנכית.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים שבוצעו בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'ונס הופקינס (JHUSOM) אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) ב- JHUSOM. כל הניסויים שבוצעו באוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו (UCSF) בוצעו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי התוכנית המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של UCSF.

1. איסוף נתונים התנהגותיים

הקלט תנועות עיניים OKR באמצעות שיטת וידאו-אוקוקולוגרפיה לפי בחירתך כדי להפיק נתוני גל (כלומר, סדרת זמן של זווית המבט של העין בקואורדינטות כדוריות).
הערה: נתונים מייצגים שנאספו ב- JHUSOM התקבלו באמצעות ניתוח השתלת עמוד ראש ווידאו-אוקולוגרפיה,^{כפי שתואר} קודם ^9,13 (איור 1). נתונים מייצגים שנאספו מ-UCSF התקבלו באמצעות ניתוח השתלת עמוד ראש ושיטת וידאו-אוקולוגרפיה, כפי שתואר קודם לכן¹⁰ (איור 7).
1. שימו לב לפרמטרים של גירוי והקלטה: קצב פריימים של הקלטה, מהירות וכיוון של גירוי, ואורכי זמן בין תקופות גירוי ואחריהן. עבור גירויים סינוסואידליים, שימו לב גם למשרעת ולתדירות של גל הגירוי.
ייצוא נתוני גל שנאספו כ- . קובץ CSV המכיל נתוני גל אופקיים ואנכיים (אזימוט וגובה).
1. ארגון נתוני גל כטאבים מופרדים . קובץ CSV עם שתי עמודות המכילות נתונים אופקיים (epxWave) ונתונים אנכיים (epyWave).

2. התקנת תוכנת ניתוח

הורד והתקן את Python.
1. לפיקוח על גרפים, התקן את ספיידר דרך אנקונדה.
2. כדי לוודא שהגרפים פועלים כראוי בספיידר, עבור אל כלים > העדפות > Ipython Console > גרפיקה > גרפיקה עורפית. הגדר בתוך השורה למצב אוטומטי.
צור סביבת אנקונדה חדשה עם Python.
התקן PyOKR באמצעות PyPi עם pip התקן PyOKR כדי להתקין את הגרסה החדשה ביותר יחד עם תלות חבילה (קובץ קידוד משלים 1 וקובץ קידוד משלים 2)
אם נעשה שימוש במחשב Windows, הפעל מ- PyOKR ייבוא OKR_win כ- o ולאחר מכן o.run().
אם נעשה שימוש במחשב Mac, הפעל מ- PyOKR ייבוא OKR_osx כ- o ולאחר מכן o.run().

3. ניתוח נתוני גל

אתחול ניתוח ויבוא קבצים
1. הפעל את o.run() בקובץ script של .py כדי לפתוח את ממשק המשתמש.
2. תחת קובץ, השתמש בפונקציה פתח או בפקודה Ctrl+O [פקודת iOS] כדי לפתוח דפדפן שיאפשר למשתמש לבחור את קובץ הגל הרצוי.
3. תחת קובץ, השתמש בלחצן יצא תיקיה או בפקודה Ctrl+E כדי לפתוח דפדפן תיקיות שיאפשר בחירה של תיקיית פלט שאליה ייוצאו ניתוחים סופיים.
4. הזן את שם קובץ הניתוח הסופי תחת קובץ הפלט בתבנית מומלצת, כגון AnimalGenotype_AnimalNumber_Analysis.
5. הגדר את התוכנית עבור בעל חיים בודד באמצעות הפקודה הגדר נושא תחת קובץ או הפקודה Ctrl+S כדי לאתחל את ערכת הנתונים עבור חיה בודדת.
הגדרת פרמטרים של קובץ גל
1. כדי להתחיל להגדיר פרמטרים של גירוי, הגדר כיווניות תחת בחר כיוון גירוי על-ידי בחירה באחד מארבעת הכיוונים הקרדינליים. עבור גירויים סינוסואידליים, בחר אחד המכיל (אופקי) או (אנכי) בהתאם, כאשר הכיוון הקרדינלי מגדיר את הכיוון ההתחלתי של הגל הסינוסואידלי.
2. הגדר את סוג הגירוי תחת בחר סוג גירוי כחד-כיווני, מתנודד או אלכסוני.
3. לאחר הגדרת הכיווניות, ייבא ערכת נתונים של מיקום גירוי משלך (ייבוא נתונים של וקטור גירוי משלו) או צור באופן אוטומטי וקטור המבוסס על פרמטרים (צור וקטור גירוי מפרמטרים). אם אתה מייבא וקטור גירוי, המשך עם 3.2.3.1 ולאחר מכן דלג לשלב 3.3. אם אתה יוצר וקטור גירוי, המשך בשלבים הבאים.
  1. אם אתה מייבא נתונים וקטוריים משלך, ייבא את ערכי המרחק של הגירוי (כלומר, סידרת זמן המתארת כמה רחוק נע הגירוי בין כל מסגרת רכישה סמוכה) באותה תבנית המתוארת בשלב 3.2.1. בנוסף, נתח את ערכת הנתונים כולה כתקופה אחת במקום לפצל אותה לתקופות בודדות, מכיוון שלא נוספה פונקציונליות להגדרת משנה של ערך גירוי מיובא החל מ- PyOKR v1.1.2.
4. תחת פרמטרים של גירוי, הגדר את הפרמטרים של הגירוי המשמש לאיסוף נתונים.
  1. הגדר את משך הזמן ללא גירוי בתחילתו (ראשו) וסופו (זנב) של ניסוי נתון עם ראש וזנב.
  2. הגדר את משך הזמן שבו מוצג גירוי, את משך הזמן ללא גירוי אחרי, ואת מספר התקופות הכולל בתוך ניסוי נתון עם אורך התקופה, אורך הגירוי שלאחר הגירוי ומספר התקופות, בהתאמה.
  3. עבור גירויים חד-כיווניים ואלכסוניים, הגדר מהירות גירוי במעלות לשנייה עם מהירות אופקית ומהירות אנכית.
  4. הגדר את קצב הלכידה של מצלמת האוסף באמצעות קצב פריימים לצילום.
  5. עבור גירויים סינוסואידליים, צור את הגל הסינוסואידלי למידול גירויים תנודתיים עם תדירות ומשרעת.
5. לאחר פרמטריזציה, בצע את המודל המתאים ממידע הגירוי שהוזן לעיל עם צור וקטור גירוי מפרמטרים.
6. בחר תקופה נתונה עבור הגירוי שהוזן באמצעות Select epoch כדי לסרוק את קובץ הגל הכולל.
בחירה מפוקחת של שלבי מעקב
1. כדי לזהות אזורים של מעקב איטי, בחר באופן אוטומטי סקאדות פאזה מהירות עם התאמה ראשונית על-ידי לחיצה על נתונים לא מסוננים או נתונים מסוננים, אשר יתייגו סקאדות פוטנציאליות בהתבסס על שינויי מהירות מרביים.
2. תחת נתונים לא מסוננים, ודא שסקאדות נבחרו במדויק עם נקודה כחולה. אם הבחירה האוטומטית אינה מדויקת, הסר נקודות באופן ידני באמצעות לחצן העכבר השמאלי (LMB) או הוסף נקודות באמצעות לחצן העכבר הימני (RMB). כאשר סקאדות פאזה מהירה נבחרות כראוי, שמור את הנקודות באמצעות לחצן העכבר האמצעי (MMB) וסגור את הגרף.
3. אם אתם מעוניינים בסינון אוטומטי, קבעו סף Z-Score ולחצו על 'נתונים מסוננים ' כדי לסנן סקאדות באופן אוטומטי. במידת הצורך, השתמש באותו פיקוח ידני כמתואר בשלב 3.3.2 כדי להסיר רעש.
4. לאחר בחירת סקאדה נכונה, לחצו על ' התאמת נקודה ' לבחירת האזור להסרה. שנה את הנקודות העליונות והתחתונות באמצעות ערכת בקרה דומה לזו שתוארה קודם לכן בשלב 3.3.2. ערוך נקודות עליונות (ירוקות) עם LMB או יואן וערוך נקודות תחתונות (אדומות) עם Shift+LMB או Shift+יואן. כאשר הנקודות ממוקמות כראוי, השתמש ב- MMB כדי לשמור את הנקודות.
  הערה: אם אתה משתמש ב-Mac, התאמת הנקודה התחתונה והעליונה נמצאות בשני לחצנים נפרדים ופועלות לפי אותה ערכת בקרה כמתואר בשלב 3.3.2.
ניתוח שלבי מעקב איטיים
1. הגדר את סדר המודל הפולינומי באמצעות הגדרת סדר פולינומי כדי להגדיר את מודל הפולינום שיותקן לפאזות איטיות בודדות.
  הערה: עבור גירויים חד-כיווניים או אלכסוניים, ערך ברירת המחדל הוא 1 מכיוון שלינאריות נחוצה לחישוב רווח מעקב. עבור גירויים סינוסואידליים, יש צורך בסדר גבוה יותר כדי למדל את עקומת הגל, עם ברירת מחדל של 15.
2. כדי לנתח את המעקב, בחרו 'ניתוח סופי' כדי ליצור את מודלי הפאזה האיטית (איור 2) עבור השלבים האיטיים שנבחרו (ראו איור 2A-D) ולחשב את המרחקים, המהירויות ורווחי המעקב הממוצעים לאורך התקופה (איור 2E).
3. להצגת הגרף הדו-ממדי (דו-ממדי) או התלת-ממדי (תלת-ממדי) של האזורים שנבחרו, בחרו 'הצג גרף דו-ממדי ' או 'הצג גרף תלת-ממדי ', בהתאמה.
4. בחר הוסף תקופה כדי לשמור את הערכים שנאספו שנוצרו בשלב 3.4.2. כדי להציג את כל הערכים המוספים עבור בעל חיים נתון וכן ממוצעים עבור ניסויים שנאספו, בחר הצג ערכת נתונים נוכחית.
5. לאחר הוספת תקופה, עבור בין שאר הקובץ באמצעות בחר תקופה, בצע את השלבים 3.3.1 עד 3.4.4.
6. לאחר ניתוח מלא של קובץ גל, חזור על תהליך זה עבור כל הקבצים האחרים עבור חיה נתונה על ידי פתיחת קבצים חדשים, הגדרת פרמטרים מתאימים וניתוחם בהתאם. על-ידי חזרה על שלבים 3.2.1-3.4.5 עבור כל קובץ, צור ערכת נתונים סופית המכילה את כל נתוני הגל עבור חיה נתונה.
ייצוא סופי של נתונים
1. לאחר השלמת ניתוח הנתונים עבור חיה נתונה, עם ניתוח כל הכיוונים או הגירויים, יצא את מערך הנתונים באמצעות ייצוא נתונים.
  הערה: ערכת הנתונים הגולמית תיוצא בהתבסס על שם קובץ הפלט ותשמר לאורך הנתיב שהוגדר על-ידי תיקיית הפלט כקובץ CSV המכיל נתוני תקופה בודדים עם הממוצע הכולל עבור כל פרמטר גירוי.
2. לאחר ייצוא בעל חיים בודד, אתחל מחדש את ערכת הנתונים באמצעות Ctrl+S ולאחר מכן חזור על כל השלבים הקודמים כדי לנתח חיה חדשה.
3. במידת הצורך, ארגן מחדש את כל נתוני הפלט שנאספו עבור בעלי חיים מרובים לצורך ניתוח קל יותר באמצעות הפקודה מיין נתונים בכרטיסיה ניתוח .
  הערה: פונקציה זו תבצע הידור ומיון של כל הערכים הממוצעים עבור כל קובצי בעלי החיים שנותחו המאוחסנים בתיקיית הפלט כדי לאפשר יצירה קלה יותר של גרפים והשוואות סטטיסטיות. המיון מסתמך על שמות הקבצים החל מגירסה v1.1.2. השתמש בסכימת מתן השמות המומלצת כמתואר בשלב 3.1.4 עבור כל קובץ (לדוגמה, WT_123_Analysis).

תוצאות

כדי לאמת את שיטת הניתוח שתוארה לעיל, כימתנו את רווח המעקב אחר OKR על עקבות גלים שנאספו מעכברי בר ומוטנט נוקאאוט מותנה עם ליקוי מעקב ידוע. בנוסף, כדי לבחון את הישימות הרחבה יותר של שיטת הניתוח שלנו, ניתחנו עקבות שנגזרו מקבוצה נפרדת של עכברי בר שנרכשו בשיטת איסוף וידאו-אוקוקולוגרפיה שונה. הסינ?...

Discussion

PyOKR מספק מספר יתרונות לחקר תגובות חזותיות המשתקפות בתנועות עיניים. אלה כוללים דיוק, נגישות ואפשרויות איסוף נתונים, בנוסף ליכולת לשלב פרמטרים ומהירויות גירוי משתנות.

הערכת רווח מעקב עיניים ישיר מספקת אפיון מדויק של תנועת עיניים שהוא מדד כמותי ישיר יותר מאשר ספירה ידנית מסור...

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי R01 EY032095 (ALK), מלגת קדם-דוקטורט VSTP 5T32 EY7143-27 (JK), F31 EY-033225 (SCH), R01 EY035028 (FAD ו- ALK) ו- R01 EY-029772 (FAD).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J mice	Jackson Labs	664
Igor Pro	WaveMetrics	RRID: SCR_000325
MATLAB	MathWorks	RRID: SCR_001622
Optokinetic reflex recording chamber - JHUSOM	Custom-built	N/A	As described in Al-Khindi et al.(2022)⁹ and Kodama et al. (2016)¹³
Optokinetic reflex recording chamber - UCSF	Custom-built	N/A	As described in Harris and Dunn, 2015¹⁰
Python	Python Software Foundation	RRID: SCR_008394
Tbx5 flox/+ mice	Gift from B. Bruneau	N/A	As described in Al-Khindi et al.(2022)⁹
Tg(Pcdh9-cre)NP276Gsat/Mmucd	MMRRC	MMRRC Stock # 036084-UCD; RRID: MMRRC_036084-UCD

References

Stahl, J. S. Using eye movements to assess brain function in mice. Vision Res. 44 (28), 3401-3410 (2004).
Kretschmer, F., Tariq, M., Chatila, W., Wu, B., Badea, T. C. Comparison of optomotor and optokinetic reflexes in mice. J Neurophysiol. 118, 300-316 (2017).
Bronstein, A. M., Patel, M., Arshad, Q. A brief review of the clinical anatomy of the vestibular-ocular connections - How much do we know. Eye. 29 (2), 163-170 (2015).
Simpson, J. I. The accessory optic system. Ann Rev Neurosci. 7, 13-41 (1984).
Hamilton, N. R., Scasny, A. J., Kolodkin, A. L. Development of the vertebrate retinal direction-selective circuit. Dev Biol. 477, 273-283 (2021).
Dobson, V., Teller, D. Y. Visual acuity in human infants: a review and comparison of behavioral and electrophysiological studies. Vision Res. 18 (11), 1469-1483 (1978).
Cahill, H., Nathans, J. The optokinetic reflex as a tool for quantitative analyses of nervous system function in mice: Application to genetic and drug-induced variation. PLoS One. 3 (4), e2055 (2008).
Cameron, D. J., et al. The optokinetic response as a quantitative measure of visual acuity in zebrafish. J Vis Exp. (80), e50832 (2013).
Al-Khindi, T., et al. The transcription factor Tbx5 regulates direction-selective retinal ganglion cell development and image stabilization. Curr Biol. 32 (19), 4286-4298 (2022).
Harris, S. C., Dunn, F. A. Asymmetric retinal direction tuning predicts optokinetic eye movements across stimulus conditions. eLife. 12, 81780 (2015).
Sun, L. O., et al. Functional assembly of accessory optic system circuitry critical for compensatory eye movements. Neuron. 86 (4), 971-984 (2015).
Yonehara, K., et al. Congenital Nystagmus gene FRMD7 is necessary for establishing a neuronal circuit asymmetry for direction selectivity. Neuron. 89 (1), 177-193 (2016).
Kodama, T., Du Lac, S. Adaptive acceleration of visually evoked smooth eye movements in mice. J Neurosci. 36 (25), 6836-6849 (2016).
Stahl, J. S., Van Alphen, A. M., De Zeeuw, C. I. A comparison of video and magnetic search coil recordings of mouse eye movements. J Neurosci Methods. 99 (1-2), 101-110 (2000).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

OKR PyOKR

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: