机械转导驱动的类人增生性瘢痕形成小鼠模型

摘要

该协议将解释如何建立增生性瘢痕形成小鼠模型，该模型增加机械转导信号以模拟类似人类的瘢痕形成。该方法涉及增加小鼠愈合切口的机械张力，并使用专用设备创建可重复的过度疤痕组织，以进行详细的组织学和生物信息学分析。

摘要

增生性疤痕 （HTS） 是伤口愈合的异常过程，会导致过多的疤痕组织形成。在过去的十年中，我们已经证明机械转导——将机械刺激转化为细胞反应——会驱动纤维化疤痕的过度愈合。评估类人增生性疤痕的小鼠模型将是检查各种疗法及其减少疤痕和改善愈合的能力的重要工具。具体来说，我们的实验室开发了一种小鼠伤口模型，该模型可增加机械应变以促进类似人类的 HTS。该协议利用生物力学负载装置，由改良的 13 毫米腭扩张器制成，其手臂放置在切口的两侧并逐渐分开，以便在愈合过程中在伤口床上施加持续的张力。经过近二十年的使用，该模型在提高疗效和可重复性方面得到了显著的进步。使用小鼠 HTS 模型，可以诱导显着的真皮纤维化瘢痕，其组织学上与人类增生性瘢痕相当。这种小鼠模型为开发参与治疗 HTS 和机械转导相关疾病（如异物反应）的生物制剂提供了环境。

引言

伤口愈合是身体试图修复受损组织和重建皮肤屏障的过程，如果其止血、炎症、增殖和重塑过程不规则，则会导致非典型愈合¹。增生性瘢痕形成 （HTS） 是伤口愈合不规则的一个例子，其特征是细胞外基质和结缔组织在损伤部位过度沉积，导致形成扩大的瘢痕组织区域 ^1,2,3。身体上受到反复机械拉伸刺激的部位，例如关节周围或面部，更容易发生 HTS 和纤维化 4,5,6,7,8,9,10。我们和其他人已经证明，跨创面床的机械拉伸通过激活机械转导途径（将机械刺激转化为细胞反应）来促进 HTS 的形成 ^9,11。

HTS 不仅涉及复杂的生物过程，还给受影响的人带来了重大的社会、医疗和经济挑战。受影响的人可能会与自尊和抑郁作斗争，尤其是当疤痕位于面部和手部等可见区域时 1,9,10,12。科学评论文章表明，HTS 在美国的患病率在 32% 到 72% 之间变化^10,13。这些美学问题的严重性，尤其是在面部区域严重烧伤的情况下，为改善外观而进行的全面部移植病例的增加凸显了这些问题¹⁰。这些疤痕还可以通过限制运动 ^6,14 导致功能障碍，通常需要手术干预来切除疤痕并恢复活动能力¹⁰。HTS 治疗的费用可能很高，包括手术、治疗、物理治疗甚至长期护理的费用 ^1,10。仅在美国，每年治疗 HTS 的费用就超过 40 亿美元¹⁰。

考虑到 HTS 的普遍性和为解决其并发症而采取的极端措施，常规疗法（例如手术切除、皮质类固醇注射和激光疗法）仍然高度可变 1,2,15,16,17。虽然这些治疗在某些情况下可以缓解症状，但由于疤痕病理的复杂性，它们可能不够。个体之间的遗传差异和对驱动 HTS 的机制的不完全理解等因素导致治疗策略在临床上仍然不令人满意 18,19,20。HTS 疗法的未来似乎在于针对 HTS 细胞机制驱动因素的新创新方法，例如机械转导^11,21，我们已经广泛证明它可以驱动过度纤维化疤痕愈合 ^{5,6,7,8,11,21,22,23,24，25}. 具体来说，我们之前开发了一种小鼠模型，该模型可增加伤口机械应变以促进类似人类的 HTS⁹。然而，经过近二十年的使用，该模型已经显着进步，提高了疗效和可重复性。该协议将使研究人员能够最好地利用更新和优化的 HTS 小鼠模型来探索细胞群和过度疤痕背后的驱动因素。该方法的总体目标是为研究人员提供一种方案，旨在在小鼠中产生类似人类的增生性疤痕。

研究方案

所有实验均已获得亚利桑那大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准（控制编号：2021-0828）。该方案使用 15 周龄的 C57BL/6J 雄性小鼠，尽管它可以应用于其他年龄和品系 ^9,26。

1. 创建 HTS 生物力学负载装置

注意：将腭扩张器修改为 HTS 装置可以在实验前的任何时候进行。

1. 取未经修改的腭扩张器，根据 图 1A、B 的规格提交给创客空间核心或制造核心。
   注意：如果没有可用的创客空间或制造核心，请继续执行以下步骤。
2. 使用迷你通用弯曲器 （MUB） 弯线工具改变腭扩张器，以符合 图 1A、B 的规格。
3. 将设备平放在表面上，如图 1A1 所示。
4. 当设备与 MUB 平放时，将上臂向上弯曲 90°，下臂向下弯曲 90°，如图 1A2 所示。参见 图 1A3 了解设备平放在表面上时的外观，此时臂现在与设备主体完全平行。
5. 将每个臂沿虚线的轴线向后弯曲 90°，如图 1A4 所示。弯曲后的器件参见 图 1A5 。

2. 术后第 0 天脱毛和初始切口 （POD 0）

注意：手术前清洁和高压灭菌几套手术器械（例如，解剖剪刀、手术刀、Adson 镊子、针头驱动器）。准备消毒过的 5-0 缝合线以供使用，并准备好手术记号笔。

1. 用 70% 乙醇喷雾清洁作空间。
2. 将 35 °C 的加热垫组放在术前准备台上。在加热垫上贴上吸水垫。在前一个吸水垫上放置另一个吸水垫（以收集剃光的头发）。将麻醉锥（或锥）粘在吸收垫上。
   注意： [可选] 如果有台式排烟器，请将锥体放在工作区附近并打开抽吸装置。
3. 将小鼠置于具有 1-3% 异氟醚和 2 L/min 氧气流量的麻醉诱导室中，直到小鼠平静呼吸（2-3 分钟）。
4. 将每只小鼠的鼻子插入鼻锥开口，吸入由 1-3% 异氟醚和 2 L/min 氧气组成的麻醉剂。通过对脚趾捏没有反应来确认充分麻醉。将眼科润滑软膏涂抹在小鼠的眼睛上。
5. 使用电动剃须刀剃除该区域背上的毛发，如图 1C 所示。
6. 用戴手套的手指或棉签将脱毛膏涂抹在皮肤上，覆盖剃须区域。45 秒后，用纱布擦去糊状物，然后用酒精棉签擦去。用另一根酒精棉签擦拭背部以去除脱毛膏，留下无毛贴片（图 1C）。
   注意：使用适量的糊状物至关重要，及时去除糊状物，去除糊状物后擦拭鼠标，以防止脱毛膏灼伤皮肤。小鼠的皮肤很薄，使其容易受到快速化学灼伤的影响，这对小鼠的健康和实验质量都有不利影响。
7. 给鼠标贴上耳标以进行识别。
8. 去除毛发后，将鼠标放回笼子中，以防止过度接触异氟醚。监视鼠标。
9. 取下覆盖着头发的顶部吸收垫，以获得干净的术前鼓舞工作表面。
10. 设置单独的手术工作区。将 35 °C 的加热垫组放在手术台上。在加热垫上贴上吸水垫。将麻醉锥（或锥）粘在吸收垫上。
11. 将小鼠放入含有 2-4% 异氟醚和 2 L/min 氧气流量的麻醉诱导室中，直到小鼠平静呼吸（2-3 分钟）。
12. 将鼠标从感应室中取出，放在作面上。将每只小鼠的鼻子插入鼻锥开口，吸入由 1-3% 异氟醚和 2 L/min 氧气组成的麻醉剂。通过对脚趾捏没有反应来确认充分麻醉。将眼科润滑软膏涂抹在小鼠的眼睛上。
13. 使用 0.05 G 针头将 21 mg/kg 缓释丁丙诺啡皮下注射到肩部进行术后疼痛治疗。
14. 用三轮交替的碘/洗必泰磨砂膏和酒精棉签对小鼠的背部进行消毒。用手术记号笔和尺子在背中线上标记一条 2 cm 的线，在那里将进行全层切口，如图 1D 所示。
15. 使用手术刀或解剖剪刀（手术偏好）通过标记区域制作全层背中线切口。
    注意：小心不要切开下面的组织（例如肌肉），如图 1D 所示。
16. 以简单的中断模式使用 5-0 缝合线，通过将伤口一分为二来闭合切口，如图 1D 所示。至少使用 5 根均匀分布的缝合线。
17. 将 Telfa 纱布切成 3 厘米 x 1 厘米的小块。将其放在泡沫粘合剂敷料的中心，并将粘合剂敷料放在鼠标背上，使纱布覆盖切口，如图 1D 所示。将对半的敷料放在腹部并圆周包裹，直到它与背敷料相遇。
18. 敷料完成后，将小鼠放在单独的无菌笼中并监测它，直到它从麻醉剂中完全恢复。
19. 对所有小鼠重复该过程，无论实验组如何。在接下来的 4 天内让切口愈合，然后再进行下一步。

3. 放置 HTS 生物力学负载装置 （POD 4）

注意：手术前清洁和高压灭菌 HTS 设备和几套手术器械（例如，解剖剪刀、手术刀、Adson 镊子、针头驱动器、皮肤吻合器、皮肤缝合器）。准备消毒的 5-0 缝合线以供使用。[可选]如果有台式排烟器，请将锥体放在工作区附近并打开抽吸装置。

1. 按照步骤 2.1 和 2.2 中的说明准备手术区域。
2. 按照步骤 2.11-2.13 麻醉小鼠并提供镇痛。
3. 使用镊子或针头驱动器将工具左右靠在腹侧，将敷料与小鼠腹部分开。将工具留在包裹物和皮肤之间，以将敷料从皮肤上抬起，用剪刀剪掉敷料。
   注意：小心不要割伤小鼠皮肤、撕下敷料或干扰愈合切口。
4. 用酒精棉签清洁背部。检查切口是否有伤口裂开或感染迹象。
5. 确保 HTS 设备没有扩展/扩展，并且处于最缩小的形式，如图 1B 所示。用医用胶水轻轻涂抹设备的臂。
6. 用一只手使小鼠背部的皮肤在横向上略微拉紧。另一方面，将 HTS 设备放在鼠标背上，使切口与 HTS 设备的每个臂等距，从而使设备在切口上居中。确保 HTS 设备臂之间的皮肤均匀收紧。将设备固定到位，直到胶水干燥（~30 秒），如图 2A 所示。
   注意：保持皮肤均匀绷紧对于确保在使用设备的切口上施加相等的张力非常重要。在此过程中保持缝合线完好无损，因为放置装置的过程会增加皮肤的机械张力，从而可以重新打开愈合切口。缝合线一直保持原位，直到拉伸的第一天，以确保伤口保持闭合。
7. 如图所示，将四条缝合线固定在每只手臂周围并穿过 皮肤。缝合时，确保针头从皮肤流向切口。
   注意：由于刺穿皮肤所需的力，从设备的切口侧插入针头有时会将切口撕开。
8. 现在将三个皮肤钉放在手臂周围并穿过皮肤，将 HTS 设备固定在皮肤上，如图 2B 所示。
9. 按照步骤 2.17 和 2.18 包扎鼠标。
10. 对所有小鼠重复该过程，无论实验组如何。
    注意：所有小鼠都接受相同的准备;然而，它们被随机分配到每个实验组（例如，Control、STRETCH）中，以确保小鼠在实验设计中的无偏分布。具体来说，对照小鼠和伸展小鼠都会将该装置连接到它们的背部。对照小鼠的设备将保持不变，而伸展小鼠将进行下一步。

4. HTS 生物力学负载装置 （POD 5） 的初始拉伸

注意：手术前清洁和高压灭菌几套手术器械（例如，解剖剪刀、手术刀、Adson 镊子、针头驱动器）。[可选]如果有台式排烟器，请将锥体放在工作区附近并打开抽吸装置。

1. 通过耳标将每只鼠标随机分配到所需的组。对于对照小鼠，只需取下切口上的缝合线并更换伤口的敷料（步骤 1-6，然后是 8-9）。如果需要，在拉伸时取下设备，并用测量工具拍照以跟踪疤痕大小。
2. 准备手术区域，麻醉鼠标，然后通过执行步骤 3.1-3.4 去除敷料。
   注意：小心不要撕下敷料或干扰愈合切口。如果 HTS 装置的手臂已从皮肤上脱落，请轻轻粘合回原位，并根据脱落的大小添加皮肤钉或缝合线。
3. 用解剖剪刀或其他选择的方法从伤口上取下缝合线。
4. 将 HTS 设备密钥插入设备并转动以展开设备，直到皮肤绷紧但没有撕裂皮肤的风险，如图 2C 所示。
   注意： 这种最初的分散可能需要将钥匙转动大约 4-8 整圈，因为设备臂之间的皮肤可能会松动。
5. 通过执行步骤 2.17 和 2.18 为鼠标包扎。

5. 随后拉伸 HTS 生物力学加载装置（POD 7、9、11、13、15、17）

注意：手术前清洁和高压灭菌几套手术器械（例如，解剖剪刀、手术刀、Adson 镊子、针头驱动器）。[可选]如果有台式排烟器，请将锥体放在工作区附近并打开抽吸装置。

1. 对于对照小鼠，只需更换伤口的敷料（步骤 1-5，然后是步骤 13-14）。如果需要，在拉伸时取下设备，并用测量工具拍摄疤痕的照片，以跟踪疤痕的大小。
2. 按照步骤 3.1-3.4 准备手术区域，麻醉鼠标，并去除敷料。
   注意：如果 HTS 设备的手臂已从皮肤上脱落，请将其粘合到位，并根据脱落的大小添加皮肤钉或缝合线。
3. 将 HTS 设备钥匙插入设备并转动以展开设备，直到皮肤绷紧但没有撕裂皮肤的风险。
   注意：这可能需要大约 4 圈或 ~2 毫米的总分心。如果设备已达到最大伸展范围且无法进一步伸展，请执行步骤 5.4-5.7 以起飞并重新连接新设备。否则，通过执行步骤 2.17 和 2.18 包扎鼠标。
4. 如果设备已达到最大伸展范围，请用订书钉去除器或剪刀撬开订书钉的插脚，将设备从鼠标的背部取下。然后，拆下缝合线并小心地取下设备。
5. 用手术刀、酒精棉签和纸巾清洁设备。将设备浸泡在 70% 乙醇中 ~20 分钟以帮助清洁。然后，使用密钥将设备收缩为最薄的形式。
6. 按照步骤 3.5-3.8 重新连接 HTS 设备。
7. 按照步骤 2.17 和 2.18 包扎鼠标。

6. 收获 HTS 组织 （POD 19）

注：收获组织可以在过程中的任何时候进行。我们只在拉伸 4 天后就收获了组织以检查早期时间点;然而，在 POD 19 （菌株开始后 2 周） 收获组织最一致。手术前清洁并高压灭菌几套手术器械（例如，解剖剪刀、手术刀、Adson 镊子）。为了获得随着时间的推移疤痕的照片，可以在每个拉伸步骤之前取下设备以拍摄疤痕的照片，然后再重新应用设备并重新开始机械应变。[可选]如果有台式排烟器，请将锥体放在工作区附近并打开抽吸装置。当不再使用异氟醚气体时，可以关闭台式排烟器。

1. 按照步骤 3.1-3.4 准备手术区域，麻醉鼠标，并去除敷料。
2. 通过颈椎脱位处死小鼠。
   注意：注意不要拉扯鼠标的皮肤和撕裂鼠标的背部。
3. 使用解剖剪刀或皮肤钉去除器去除皮肤钉。切断缝合线。轻轻取下 HTS 装置，注意不要撕裂皮肤。
4. 使用手术刀或剪刀剪开 HTS 疤痕周围的皮肤。以所需的方式保留皮肤以进行组织学分析。
   注意：如果皮肤要用于转录组学或蛋白质分析（例如，qPCR、western blot、单细胞分析），请确保仅切除 HTS 瘢痕组织，以尽量减少周围健康组织的数量。这将确保分析仅捕获疤痕组织。
5. 用手术刀将 HTS 设备刮干净。将装置放入含有 70% 乙醇的烧杯中，以软化任何残留的粘合剂或组织。
   注：浸泡在 70% 乙醇中后，设备可能需要进一步擦拭、刮擦和清洁，然后再进行高压灭菌。

7. 测量平均疤痕宽度

注意：这是通过图像分析软件 ImageJ 完成的，信息记录在电子表格上。

1. 在 ImageJ 中打开图像。使用 多边形 工具追踪疤痕的边缘。单击 analyze | measure 以测量此区域。
   注意：疤痕可以通过其变色和缺乏毛囊来识别。
2. 使用 分割 工具测量疤痕从头到尾的长度。单击 analyze | measure 以测量此长度。
3. 使用 分割 工具测量 1 厘米的长度或图片中的任何其他标准化长度单位。单击 analyze | measure 以测量此长度。
4. 使用电子表格，获取 疤痕面积 （以像素为单位;px）并将其除以 疤痕的长度 （px 长度）。该结果给出了平均疤痕宽度（以像素为单位）。
5. 将该结果除以 测量的标准长度单位 （px 长度）。结果将是以实验使用的标准长度单位（例如，cm）为单位的平均疤痕宽度。

结果

为了清楚地证明 HTS 协议的有效使用并确定成功的“积极”结果，建立了如图 3A 所示的模型。在代表性研究中，有两组：无拉伸控制 （n = 6） 和机械拉伸 HTS 组 （n = 6），其中在整个切口上诱导类似人类水平的机械应变以产生 HTS，如图 3B、C 所示。在图 3A-C 给出的实验计划中，?...

讨论

HTS 小鼠模型是一种经济高效且高度可重复的方法，用于通过机械转导诱导 HTS 和开发潜在疗法。虽然有效使用该模型有一个初始学习曲线，但通过实践，任何研究人员都可以在没有手术培训的情况下执行该协议。使用该模型可以使研究人员更好地了解 HTS 的形成和机械转导在伤口愈合中的作用，这可能会带来患者伤口护理的切实改善。该协议随附的视频演示将理想地减少?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mL PYREX Griffin beaker	Milipore Signma	CLS1000100
Aesculap Exacta mini trimmer	Aesculap
AutoClip System	Fine Surgical Instruments	12020-00
BD brand isopropyl alcohol swabs	Fisher Scientific	13-680-63
Buprenorphine SR (0.5 mg/mL)	Buprenex, Indivior Inc.	12496-0757-1
C57/BL6 females (6–8 weeks old)	The Jackson Laboratory	000664
Covidien sterile gauze	Fisher Scientific	2187
Covidien TelfaTM non-adherent pads	Fisher Scientific, Covidien	1961
Dental surgical ruler	DoWell Dental Products	S1070
Depilatory cream (Nair Hair Remover Lotion)	Church&Dwight, CVS	339823
Ethanol 70% solution	Fisher Scientific	64-17-5
Excel	Microsoft Cooperation	Microsoft.com	software program
ImageJ	ImageJ, Wayne Rasband	imagej.net	software program
Inhalation anesthesia system	VetEquip	922130
Iris scissors 4½ in. stainless	McKesson	43-2-104
Isoflurane, USP	Dechra Veterinary Products	17033-094-25
Kaka industrial MUB-1	Kaka Industrial	173207	Only necessary if there is no maker space or fabrication shop available
Leone Rapid Palatal Expander- 13 mm	Great Lakes Dental Technologies	125-004	The key necessary to expand and cotnract the device will come with this product in the box
Liquid repellent drape 75 x 90 cm with adhesive hole 6 x 9 cm	Omnia S.p.A.	12.T4362
Medequip Depot Silk Black Braided Sutr 6-0 Rx	Medequip Depot D707N, Fisher Scientific	NCO835822
Needle holder 5 in. with serrated jaws	McKesson	43-2-842
Prism 9	GraphPad Holdings, LLC	graphpad.com	software program
Puralube ophthalmic ointment	Dechra, NDC	17033-211-38
R studio Desktop	RStudio PBC	rstudio.com	software program
Surgical skin marker	McKesson	19-1451_BX
Tegaderm, 3 M	VWR	56222-191	foam adhesive dressing
Thermo-peep heating pad	K&H, Amazon
Tissue forceps 4¾ in. stainless 1 x 2 teeth	Mckesson	43-2-775
Vetbond (3 M)	Saint Paul, MN	1469SB