Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
* Эти авторы внесли равный вклад
Этот протокол объясняет, как создать гипертрофированную модель рубцевания мышей, которая увеличивает передачу сигналов механотрансдукции для моделирования рубцов, подобных человеческим. Этот метод включает в себя увеличение механического напряжения в заживающем разрезе у мыши и использование специализированного устройства для создания воспроизводимой, избыточной рубцовой ткани для детального гистологического и биоинформатического анализа.
Гипертрофическое рубцевание (ВТСП) – это аномальный процесс заживления раны, который приводит к чрезмерному образованию рубцовой ткани. За последнее десятилетие мы продемонстрировали, что механотрансдукция — преобразование механических стимулов в клеточные реакции — приводит к чрезмерному заживлению фиброзных рубцов. Мышиная модель для оценки гипертрофического рубцевания, подобного человеческому, будет важным инструментом для изучения различных терапевтических средств и их способности уменьшать рубцевание и улучшать заживление. В частности, наша лаборатория разработала модель раны мыши, которая увеличивает механическую нагрузку для развития человека. В этом протоколе используются биомеханические нагрузочные устройства, изготовленные из модифицированных небных расширителей диаметром 13 мм, руки которых расположены по обе стороны разреза и постепенно разводятся друг от друга, чтобы обеспечить непрерывное напряжение на раневом ложе во время заживления. За почти два десятилетия использования эта модель была значительно усовершенствована для повышения эффективности и воспроизводимости. Используя мышиную модель HTS, можно индуцировать значительные дермальные фиброзные рубцы, которые гистологически сопоставимы с гипертрофическими рубцами человека. Эта мышиная модель обеспечивает среду для разработки биологических препаратов, участвующих в лечении ВТСП и состояний, связанных с механотрансдукцией, таких как реакция на инородное тело.
Заживление ран, процесс, с помощью которого организм пытается восстановить поврежденные ткани и восстановить кожный барьер, может привести к атипичному заживлению, если процессы гемостаза, воспаления, пролиферации и ремоделирования являются нерегулярными. Гипертрофическое рубцевание (ВТСП) является примером нерегулярного заживления раны, характеризующегося чрезмерным отложением внеклеточного матрикса и соединительной ткани в месте повреждения, что приводит к образованию увеличенной площади рубцовой ткани 1,2,3. Области тела, которые подвергаются повторной механической стимуляции растяжения, такие как вокруг суставов или на лице, более склонны к развитию ВТС и фиброза 4,5,6,7,8,9,10. Мы и другие показали, что механическое растяжение через раневое ложе способствует образованию ВТСП за счет активации механотрансдукционных путей — преобразования механических стимулов в клеточные реакции 9,11.
ВТШ не только связана со сложными биологическими процессами, но и несет значительные социальные, медицинские и экономические проблемы для пострадавших людей. Пострадавшие люди могут бороться с самооценкой и депрессией, особенно когда шрамы находятся на видимых участках, таких как лицо и руки 1,9,10,12. В научных обзорных статьях указывается, что распространенность ВТСП колеблется от 32% до 72% в Соединенных Штатах10,13. Серьезность этих эстетических проблем, особенно в случаях серьезных ожоговых травм в области лица, подчеркивается растущим числом случаев полной трансплантации лица дляулучшения внешности. Эти рубцы также могут вызывать функциональные нарушения, ограничивая движения 6,14, и часто требуется хирургическое вмешательство для иссечения рубцов и восстановления подвижности10. Стоимость лечения HTS может быть существенной, включая расходы на хирургию, лечение, физиотерапию или даже долгосрочный уход 1,10. Только в Соединенных Штатах ежегодные затраты на лечение ВТСП превышают 4 миллиардадолларов10.
Учитывая распространенность ВТСП и крайние меры, принимаемые для устранения ее осложнений, традиционные методы лечения (например, хирургическое иссечение, инъекции кортикостероидов и лазерная терапия) остаются весьма вариабельными 1,2,15,16,17. Хотя эти методы лечения могут принести облегчение в некоторых случаях, они могут быть недостаточными из-за сложного характера патологии рубцов. Такие факторы, как генетические различия между людьми и неполное понимание механизмов, управляющих ВТС, приводят к тому, что терапевтические стратегии остаются клинически неудовлетворительными 18,19,20. Будущее ВТСП-терапии, по-видимому, заключается в новых инновационных подходах, нацеленных на клеточные механистические факторы ВТСП, таких как механотрансдукция11,21, которая, как мы широко продемонстрировали, способствует чрезмерному заживлению фиброзных рубцов 5,6,7,8,11,21,22,23,24.25. В частности, ранее мы разработали мышиную модель, которая увеличивает механическую нагрузку на рану для развития человекаподобного HTS9. Тем не менее, после почти двух десятилетий использования, модель была значительно усовершенствована для повышения эффективности и воспроизводимости. Этот протокол позволит исследователям наилучшим образом использовать обновленную и оптимизированную мышиную модель HTS для изучения клеточных популяций и движущих сил, вызывающих чрезмерное рубцевание. Общая цель этого метода состоит в том, чтобы предоставить исследователям протокол, предназначенный для создания гипертрофических рубцов у мышей, подобных человеческим.
Для всех экспериментов было получено одобрение Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Аризоны (контрольный номер: 2021-0828). В этом протоколе используются 15-недельные самцы мышей C57BL/6J, хотя он может быть применен к другим возрастам и штаммам 9,26.
1. Создание биомеханического загрузочного устройства HTS
Примечание: Модификация небных экспандеров в устройство HTS может произойти в любой момент до начала эксперимента.
2. Эпиляция и первичный разрез на 0 день после операции (POD 0)
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед операцией очистите и автоклавируйте несколько наборов хирургических инструментов (например, ножницы для препарирования, скальпель, щипцы Адсона, игольный драйвер). Подготовьте стерилизованные швы 5-0 к использованию и имейте под рукой хирургический маркер.
3. Размещение биомеханического загрузочного устройства HTS (POD 4)
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед операцией очистите и автоклавируйте устройства HTS и несколько наборов хирургических инструментов (например, ножницы для препарирования, скальпель, щипцы Адсона, игольный привод, степлер для кожи, скобки для кожи). Подготовьте стерилизованные 5-0 швов к применению. [Необязательный] Если имеется настольный вытяжной аппарат, поместите конус рядом с рабочим местом и включите всасывание.
4. Начальное растяжение биомеханического загрузочного устройства HTS (POD 5)
ПРИМЕЧАНИЕ: Очистите и автоклавируйте несколько наборов хирургических инструментов (например, ножницы для препарирования, скальпель, щипцы Адсона, игольный драйвер) перед операцией. [Необязательный] Если имеется настольный вытяжной аппарат, поместите конус рядом с рабочим местом и включите всасывание.
5. Последующее растяжение биомеханического загрузочного устройства ВТСП (POD 7, 9, 11, 13, 15, 17)
ПРИМЕЧАНИЕ: Очистите и автоклавируйте несколько наборов хирургических инструментов (например, ножницы для препарирования, скальпель, щипцы Адсона, игольный драйвер) перед операцией. [Необязательный] Если имеется настольный вытяжной аппарат, поместите конус рядом с рабочим местом и включите всасывание.
6. Забор ткани HTS (POD 19)
ПРИМЕЧАНИЕ: Забор ткани может происходить на любом этапе процесса. Мы собрали ткань всего за 4 дня растяжения, чтобы изучить ранние временные точки; тем не менее, ткань наиболее стабильно собирается в POD 19 (через 2 недели после начала штамма). Очистите и автоклавируйте несколько наборов хирургических инструментов (например, ножницы для вскрытия, скальпель, щипцы Адсона) перед операцией. Чтобы получить фотографии шрама с течением времени, устройство можно снимать перед каждым этапом растяжения, чтобы сфотографировать шрам перед повторным наложением устройства и повторным воздействием механической нагрузки. [Необязательный] Если имеется настольный вытяжной аппарат, поместите конус рядом с рабочим местом и включите всасывание. Настольный вытяжка может быть выключен, когда газ изофлуран больше не используется.
7. Измерение средней ширины рубца
ПРИМЕЧАНИЕ: Это было достигнуто с помощью программного обеспечения для анализа изображений ImageJ, и информация была записана в электронную таблицу.
Чтобы наглядно продемонстрировать эффективное использование протокола HTS и выявить успешные «положительные» результаты, модель была создана, как показано на рисунке 3A. В репрезентативном исследовании были две группы: группа без контроля растяжения (...
Мышиная модель HTS является экономически эффективным и высоковоспроизводимым методом индуцирования HTS с помощью механотрансдукции и разработки потенциальных методов лечения. Несмотря на то, что для эффективного использования модели существует начальная кривая обуч...
У авторов нет конкурирующих интересов или других конфликтов, связанных с содержанием данной статьи.
Эта работа была поддержана премией Центра стоматологической, оральной и черепно-лицевой регенерации тканей и органов в рамках междисциплинарного трансляционного проекта при поддержке Национального института стоматологических и черепно-лицевых исследований (U24 DE026914) (G.C.G.) и гранта на трансляционные исследования Фонда пластической хирургии (837107) (K.C.).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
100 mL PYREX Griffin beaker | Milipore Signma | CLS1000100 | |
Aesculap Exacta mini trimmer | Aesculap | ||
AutoClip System | Fine Surgical Instruments | 12020-00 | |
BD brand isopropyl alcohol swabs | Fisher Scientific | 13-680-63 | |
Buprenorphine SR (0.5 mg/mL) | Buprenex, Indivior Inc. | 12496-0757-1 | |
C57/BL6 females (6–8 weeks old) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
Covidien sterile gauze | Fisher Scientific | 2187 | |
Covidien TelfaTM non-adherent pads | Fisher Scientific, Covidien | 1961 | |
Dental surgical ruler | DoWell Dental Products | S1070 | |
Depilatory cream (Nair Hair Remover Lotion) | Church&Dwight, CVS | 339823 | |
Ethanol 70% solution | Fisher Scientific | 64-17-5 | |
Excel | Microsoft Cooperation | Microsoft.com | software program |
ImageJ | ImageJ, Wayne Rasband | imagej.net | software program |
Inhalation anesthesia system | VetEquip | 922130 | |
Iris scissors 4½ in. stainless | McKesson | 43-2-104 | |
Isoflurane, USP | Dechra Veterinary Products | 17033-094-25 | |
Kaka industrial MUB-1 | Kaka Industrial | 173207 | Only necessary if there is no maker space or fabrication shop available |
Leone Rapid Palatal Expander- 13 mm | Great Lakes Dental Technologies | 125-004 | The key necessary to expand and cotnract the device will come with this product in the box |
Liquid repellent drape 75 x 90 cm with adhesive hole 6 x 9 cm | Omnia S.p.A. | 12.T4362 | |
Medequip Depot Silk Black Braided Sutr 6-0 Rx | Medequip Depot D707N, Fisher Scientific | NCO835822 | |
Needle holder 5 in. with serrated jaws | McKesson | 43-2-842 | |
Prism 9 | GraphPad Holdings, LLC | graphpad.com | software program |
Puralube ophthalmic ointment | Dechra, NDC | 17033-211-38 | |
R studio Desktop | RStudio PBC | rstudio.com | software program |
Surgical skin marker | McKesson | 19-1451_BX | |
Tegaderm, 3 M | VWR | 56222-191 | foam adhesive dressing |
Thermo-peep heating pad | K&H, Amazon | ||
Tissue forceps 4¾ in. stainless 1 x 2 teeth | Mckesson | 43-2-775 | |
Vetbond (3 M) | Saint Paul, MN | 1469SB |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены