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要約

このプロトコルでは、ヒト様の瘢痕化をシミュレートするための機械伝達シグナル伝達を増加させる肥大性瘢痕マウスモデルを確立する方法について説明します。この方法では、マウスの治癒切開部全体の機械的張力を高め、特殊なデバイスを使用して再現性のある過剰な瘢痕組織を作成し、詳細な組織学的およびバイオインフォマティクス分析を行います。

要約

肥厚性瘢痕化(HTS)は、過剰な瘢痕組織の形成をもたらす創傷治癒の異常なプロセスです。過去10年間で、私たちはメカノトランスダクション(機械的刺激を細胞応答に変換すること)が過剰な線維性瘢痕治癒を促進することを実証してきました。ヒト様肥厚性瘢痕を評価するマウスモデルは、さまざまな治療法とその瘢痕化を軽減し、治癒を改善する能力を調べるための不可欠なツールとなるでしょう。具体的には、当研究室では、ヒト様HTSを促進するために機械的負担を増加させるマウス創傷モデルを開発しました。このプロトコルは、修正された 13 mm 口蓋拡張器から作られた生体力学的負荷装置を利用しており、その腕は切開部の両側に配置され、治癒中に創傷床全体に連続的な張力を加えるために徐々に気を散らします。約20年の使用を通じて、このモデルは有効性と再現性を向上させるために大幅に進歩してきました。マウスHTSモデルを使用すると、顕著な真皮線維性瘢痕を組織学的にヒトの肥厚性瘢痕に匹敵するように誘導できます。このマウスモデルは、HTSの治療に関与する生物製剤や、異物反応などのメカノトランスダクション関連疾患を開発するための環境を提供します。

概要

創傷治癒は、体が損傷した組織を修復し、皮膚バリアを再構築しようとするプロセスであり、止血、炎症、増殖、およびリモデリングのプロセスが不規則である場合、非定型治癒をもたらす可能性があります1。肥厚性瘢痕化(HTS)は、不規則な創傷治癒の一例であり、損傷部位での細胞外マトリックスおよび結合組織の過剰な沈着を特徴とする結果、拡大した瘢痕組織領域1,2,3が形成される。関節の周りや顔など、機械的なストレッチ刺激を繰り返し受ける体の領域は、HTSや線維症を発症する傾向があります4,5,6,7,8,9,10。私たちと他の人々は、創傷床を横切る機械的伸張が、機械的刺激の細胞応答への変換である機械伝達経路の活性化を通じてHTS形成を促進することを示しました9,11。

HTSは、複雑な生物学的プロセスを伴うだけでなく、影響を受ける人々にとって重大な社会的、医学的、経済的課題ももたらします。影響を受けた個人は、特に傷跡が顔や手1,9,10,12のような目に見える領域にある場合、自尊心とうつ病に苦しむことができます。科学的なレビュー記事によると、HTSの有病率は米国で32%から72%の間で変動しています10,13。これらの審美的な懸念の深刻さは、特に顔面領域に深刻な火傷を負った場合、外観を改善するための完全な顔面移植の症例数の増加によって強調されています10。これらの瘢痕は、動きを制限することによって機能障害を引き起こすこともあり6,14、瘢痕を切除し可動性を回復するためには外科的介入がしばしば必要となる10。HTS治療の費用は、手術、治療、理学療法、さらには長期介護の費用など、かなりの額になる可能性があります1,10。米国だけでも、HTSの治療にかかる年間費用は40億ドルを超えています10。

HTSの蔓延性とその合併症に対処するために取られた極端な措置を考慮すると、従来の治療法(例えば、外科的切除、コルチコステロイド注射、およびレーザー治療)は依然として非常に変動しやすいままです1,2,15,16,17。これらの治療法は場合によっては緩和を提供できますが、瘢痕病理の複雑な性質のために不十分な場合があります。個人間の遺伝的差異やHTSを引き起こすメカニズムの不完全な理解などの要因により、治療戦略は臨床的に不十分なままである18,19,20。HTS療法の未来は、HTSの細胞機構ドライバーを標的とする新しい革新的なアプローチにあるようです。例えば、メカノトランスダクション11,21は、過剰な線維性瘢痕治癒を促進することが広く実証されています5,6,7,8,11,21,22,23,24。25.具体的には、創傷の機械的負担を増加させてヒト様HTSを促進するマウスモデルを以前に開発しました9。しかし、20年近く使用した後、モデルは有効性と再現性を向上させるために大幅に進歩しました。このプロトコルにより、研究者は更新および最適化されたHTSマウスモデルを最大限に活用して、過度の瘢痕化の背後にある細胞集団とドライバーを探索できます。この方法の全体的な目標は、マウスにヒトのような肥大性瘢痕を作り出すように設計されたプロトコルを研究者に提供することです。

プロトコル

すべての実験について、アリゾナ大学動物管理委員会(IACUC)の承認を得ました(管理番号:2021-0828)。このプロトコルは、15週齢のC57BL/6J雄マウスを使用しますが、他の年齢や系統にも適用できます9,26。

1. HTSバイオメカニカルローディングデバイスの作成

注:口蓋エキスパンダーのHTSデバイスへの変更は、実験の前の任意の時点で行うことができます。

  1. 未変更の口蓋エキスパンダーを取り、 図1A、Bに準拠した仕様でメイカースペースコアまたは製造コアに提示します。
    注: メイカースペースまたは製造用コアがない場合は、次の手順に進みます。
  2. ミニユニバーサルベンダー(MUB)ワイヤー曲げツールを使用して、 図1A、Bの仕様に準拠するように口蓋エキスパンダーを変更します。
  3. 図1Aに示すように、デバイスを表面に平らに置きます1。
  4. 図1Aに示すように、デバイスがMUBと平らになったら、アームを上腕で90°上に曲げ、下腕を2°下に曲げます。アームがデバイスの本体と完全に平行になった表面に平らに置いたときのデバイスの外観については、図1A3を参照してください。
  5. 図1Aに示すように、各アームを点線の軸に沿って90°ページに戻します。曲げた後のデバイスについては、図1A5を参照してください。

2. 術後0日目の脱毛と初期切開(POD 0)

注:手術前にいくつかの手術器具のセットを清掃し、オートクレーブ処理します(例:解剖はさみ、メス、アドソン鉗子、ニードルドライバー)。滅菌済みの5-0縫合糸を使用できるように準備し、サージカルマーカーを手元に用意します。

  1. 70%エタノールスプレーで手術スペースを清掃します。
  2. 35°Cにセットしたヒーティングパッドを術前準備テーブルの上に置きます。加熱パッドの上に吸収パッドをテープで留めます。前のパッドの上に別の吸収パッドを置きます(剃った髪を集めるため)。麻酔コーン(またはコーン)を吸収パッドにテープで固定します。
    注意: [オプション]ベンチトップヒューム抽出器が利用可能な場合は、コーンをワークスペースの近くに置き、吸引をオンにします。
  3. マウスが静かに呼吸するまで(2〜3分)、1〜3%イソフルランと2L / minの酸素流でマウスを麻酔導入チャンバーに入れます。
  4. 各マウスの鼻をノーズコーンの開口部に挿入し、1〜3%イソフルランと2 L /分の酸素で構成される麻酔を吸入できるようにします。つま先をつまんでも反応しないことで、適切な麻酔を確認します。マウスの目に眼科用潤滑軟膏を塗布します。
  5. 図1Cに示すように、電気カミソリを使用して、その領域の背側の毛を剃ります。
  6. 脱毛ペーストを手袋をはめた指または綿棒で皮膚に塗り、剃った部分を覆います。45秒後、ペーストをガーゼで拭き取り、次にアルコール綿棒で拭き取ります。別のアルコール綿棒で背側を拭いて脱毛ペーストを取り除き、無毛のパッチを残します(図1C)。
    注意: 適度な量のペーストを使用し、ペーストをすぐに取り除き、ペーストを取り除いた後にマウスを拭いて、脱毛ペーストによる皮膚の火傷を防ぐことが重要です。マウスの皮膚は薄いため、急速な化学火傷を負いやすく、マウスの健康と実験の質の両方に悪影響を与える可能性があります。
  7. 識別のためにマウスに耳標を付けます。
  8. 毛を取り除いたら、マウスをケージに戻して、イソフルランへの過度の曝露を防ぎます。マウスを監視します。
  9. 髪の毛で覆われた上部の吸収パッドを取り外して、手術前の叱咤激励作業面をきれいにします。
  10. 独立した外科作業エリアを設置します。35°Cにセットした加熱パッドを手術台の上に置きます。加熱パッドの上に吸収パッドをテープで留めます。麻酔コーン(またはコーン)を吸収パッドにテープで固定します。
  11. マウスが静かに呼吸するまで(2〜3分)、2〜4%のイソフルランと2L / minの酸素流でマウスを麻酔導入チャンバーに入れます。
  12. マウスを誘導チャンバーから取り出し、操作面に置きます。各マウスの鼻をノーズコーンの開口部に挿入し、1〜3%イソフルランと2 L /分の酸素で構成される麻酔を吸入できるようにします。つま先をつまんでも反応しないことで、適切な麻酔を確認します。マウスの目に眼科用潤滑軟膏を塗布します。
  13. 術後の痛みの治療のために、21 G針を使用して0.05 mg / kg徐放性ブプレノルフィンを肩に皮下注射します。.
  14. マウスの背部を、ヨウ素/クロルヘキシジンベースのスクラブとアルコールスワブを交互に3回繰り返して消毒します。手術用マーキングペンと定規を使用して、 図1Dに示すように、全層切開が行われる背側正中線に2cmの線をマークします。
  15. メスまたは解剖はさみ(外科的好み)を使用して、マークされた領域全体に全層の背側正中線を切開します。
    注意: 図1Dに示すように、下にある組織(筋肉など)を切断しないように注意してください。
  16. 単純な中断パターンで5-0縫合糸を使用し、 図1Dに示すように創傷を二等分して切開を閉じます。少なくとも5つの等間隔の縫合糸を使用してください。
  17. テルファのガーゼは3cm×1cmにカットします。それを発泡スチロール接着剤の包帯の中央に置き、 図1Dに示すように、ガーゼが切開部を覆うようにマウスの背に粘着性包帯を置きます。腹部に半分にした包帯を敷き、背側包帯と出会うまで円周方向に包みます。
  18. 包帯が完了したら、マウスを別の滅菌ケージに入れ、麻酔薬から完全に回復するまでマウスを監視します。
  19. 実験グループに関係なく、すべてのマウスでこの手順を繰り返します。次のステップの前に、次の4日間で切開を治します。

3. HTSバイオメカニカルローディングデバイス(POD 4)の配置

注:手術前に、HTSデバイスといくつかの手術器具のセット(解剖はさみ、メス、アドソン鉗子、ニードルドライバー、スキンステープラー、スキンステープルなど)を清掃してオートクレーブします。滅菌済みの5-0縫合糸を調製して使用します。[オプション]ベンチトップヒューム抽出器が利用可能な場合は、コーンをワークスペースの近くに置き、吸引をオンにします。

  1. ステップ 2.1 と 2.2 で説明したように、手術領域を準備します。
  2. マウスに麻酔をかけ、手順2.11-2.13に従って鎮痛剤を提供します。
  3. 鉗子またはニードルドライバーを使用して、ツールを腹側に対して左右に動かして、ドレッシングをマウスの腹部から分離します。ツールをラップと皮膚の間に残してドレッシングを皮膚から持ち上げ、はさみを使用してドレッシングを切り取ります。
    注意: マウスの皮膚を切ったり、ドレッシングをはがしたり、治癒切開を妨げたりしないように注意してください。
  4. アルコール綿棒で背部を清掃します。切開部に創傷の裂開や感染の兆候がないか調べます。
  5. 図1Bに示すように、HTSデバイスが拡張/拡張されておらず、最も縮小された形式になっていることを確認します。デバイスのアームを医療用接着剤で軽くコーティングします。
  6. 片手で、マウスの背側の皮膚を横方向にわずかにピンと張らせます。一方、切開部がHTSデバイスの各アームから等距離になるようにHTSデバイスをマウス背部に置き、それによってデバイスを切開部の中央に配置します。HTSデバイスのアーム間の皮膚が均一にぴんと張っていることを確認してください。 図2Aに示すように、接着剤が乾くまで(~30秒)、デバイスを所定の位置に保持します。
    注意: 皮膚を均一に張り詰めておくことは、デバイスで切開部に均等な張力がかかるようにするために重要です。このプロセス中に縫合糸をそのままにしておくと、デバイスを配置するプロセスによって皮膚に機械的な張力が加わり、治癒切開が再び開く可能性があります。縫合糸は、傷口が閉じたままであることを確認するために、ストレッチの初日まで所定の位置に留まります。
  7. 図2Bに示すように、各腕の周りと皮膚を通して4つの縫合糸を固定します。縫合中は、針が切開部に向かって皮膚から出ていることを確認してください。
    注意: デバイスの切開側から針を挿入すると、皮膚に穴を開けるために必要な力のために、切開部が裂けて開くことがあります。
  8. 次に、 図2Bに示すように、腕の周りと皮膚を通して3つの皮膚ステープルを配置し、HTSデバイスを皮膚に固定します。
  9. 手順2.17および2.18に従ってマウスに包帯を巻きます。
  10. 実験グループに関係なく、すべてのマウスでこの手順を繰り返します。
    注:すべてのマウスは同じ準備を受けます。ただし、実験計画におけるマウスの不偏分布を確保するために、各実験グループ(コントロール、ストレッチなど)にランダムに割り当てられます。具体的には、コントロールマウスとストレッチマウスの両方に、デバイスを背部に取り付けます。コントロールマウスのデバイスは手つかずのままですが、ストレッチマウスは次のステップを経ます。

4. HTSバイオメカニカルローディングデバイス(POD 5)の初期ストレッチ

注:手術前に、いくつかの手術器具のセット(解剖はさみ、メス、Adson鉗子、ニードルドライバーなど)を清掃してオートクレーブします。[オプション]ベンチトップヒューム抽出器が利用可能な場合は、コーンをワークスペースの近くに置き、吸引をオンにします。

  1. 耳タグを介して各マウスを目的のグループにランダムに割り当てます。対照マウスの場合は、切開部の縫合糸を取り外し、創傷の包帯を交換するだけです(ステップ1〜6、次に8〜9)。必要に応じて、ストレッチ時にデバイスを取り外し、傷跡のサイズを追跡するためのスケール用の測定器具で写真を撮ります。
  2. 手術部位を準備し、マウスに麻酔をかけ、手順3.1〜3.4を実行してドレッシングを取り外します。
    注意: ドレッシングをはがしたり、治癒切開を妨げたりしないように注意してください。HTSデバイスのアームが皮膚から外れた場合は、軽く接着して元の位置に戻し、剥離のサイズに応じて皮膚ステープルまたは縫合糸を追加します。
  3. 解剖ハサミまたは他の選択した方法で傷口から縫合糸を取り除きます。
  4. 図2Cに示すように、HTSデバイスキーをデバイスに挿入し、皮膚がぴんと張っているが皮膚が裂けるリスクがなくなるまで、回してデバイスを拡張します。
    注:この最初の気晴らしは、デバイスのアーム間の皮膚が緩んでいる可能性があるため、キーを約4〜8回回す必要があります。
  5. 手順2.17と2.18を実行してマウスに包帯を巻きます。

5. HTS生体力学的ローディングデバイス(POD 7、9、11、13、15、17)のその後のストレッチ

注:手術前に、いくつかの手術器具のセット(解剖はさみ、メス、Adson鉗子、ニードルドライバーなど)を清掃してオートクレーブします。[オプション]ベンチトップヒュームエクストラクターが利用可能な場合は、コーンをワークスペースの近くに置き、吸引をオンにします。

  1. 対照マウスの場合は、単に創傷の包帯を交換するだけです(ステップ1〜5、次にステップ13〜14)。必要に応じて、ストレッチ時にデバイスを取り外し、瘢痕のサイズを追跡するためのスケール用の測定器具で瘢痕の写真を撮ります。
  2. 手術部位を準備し、マウスに麻酔をかけ、手順3.1〜3.4に従ってドレッシングを取り外します。
    注意: HTSデバイスのアームが皮膚から外れた場合は、アームを所定の位置に接着し、剥離のサイズに応じて皮膚ステープルまたは縫合糸を追加します。
  3. HTSデバイスキーをデバイスに挿入し、皮膚がぴんと張っているが皮膚を引き裂くリスクがなくなるまで、デバイスを回して拡張します。
    注:これには約4回転、または~2mmの気を散らす必要があります。デバイスが最大延長に達し、これ以上延長できない場合は、手順 5.4 から 5.7 を実行して離陸し、新しいデバイスを再接続します。それ以外の場合は、手順2.17と2.18を実行してマウスに包帯を巻きます。
  4. デバイスが最大延長に達した場合は、ステープルリムーバーでステープルを取り外すか、ステープルの突起をこじ開けてハサミでマウスの背部からデバイスを取り外します。次に、縫合糸を取り外し、デバイスを慎重に取り外します。
  5. メス、アルコール綿棒、ペーパータオルでデバイスを清掃します。デバイスを70%エタノールに~20分間浸して、クリーニングを助けます。次に、キーを使用してデバイスを最も薄い形に収縮させます。
  6. 手順3.5〜3.8に従ってHTSデバイスを再接続します。
  7. 手順2.17および2.18に従ってマウスに包帯を巻きます。

6. HTS組織の採取(POD 19)

注:組織の採取は、プロセスのどの時点でも行うことができます。私たちは、初期の時点を調べるために、わずか4日間のストレッチ後に組織を採取しました。しかし、組織を最も一貫して採取するのはPOD 19(菌株開始から2週間後)です。手術前に、いくつかの手術器具のセット(解剖はさみ、メス、アドソン鉗子など)を清掃してオートクレーブします。経時的に傷跡の写真を撮るには、各ストレッチステップの前にデバイスを取り外して、デバイスを再度適用して機械的負担を再開する前に傷跡の写真を撮ることができます。[オプション]ベンチトップヒューム抽出器が利用可能な場合は、コーンをワークスペースの近くに置き、吸引をオンにします。ベンチトップヒューム抽出器は、イソフルランガスが使用されなくなったときにオフにすることができます。

  1. 手術部位を準備し、マウスに麻酔をかけ、手順3.1〜3.4に従ってドレッシングを取り外します。
  2. 頸部脱臼を介してマウスを犠牲にします。
    注意: 皮膚を引っ張ったり、マウスの背部を引き裂いたりしないように注意してください。
  3. 解剖ハサミまたは皮膚ステープルリムーバーを使用して、皮膚ステープルを取り除きます。縫合糸を切断します。皮膚を引き裂かないように注意しながら、HTSデバイスをそっと取り外します。
  4. メスまたはハサミを使用して、HTSの傷跡の周囲の皮膚を切ります。組織学的分析のために、希望の方法で皮膚を保存します。
    注:皮膚をトランスクリプトームまたはタンパク質分析(qPCR、ウェスタンブロット、シングルセル分析など)に使用する場合は、周囲の健康な組織の量を最小限に抑えるために、HTS瘢痕組織のみを切除してください。これにより、分析が瘢痕組織のみを捕捉することが保証されます。
  5. HTSデバイスをメスできれいにこすり落とします。70%エタノールを入れたビーカーにデバイスを置き、残っている接着剤や組織を柔らかくします。
    注:70%エタノールに浸した後、オートクレーブする前に、デバイスをさらに拭き取り、こすり落とし、クリーニングする必要がある場合があります。

7.平均瘢痕幅の測定

注:これは画像解析ソフトウェアImageJを使用して実現され、情報はスプレッドシートに記録されました。

  1. ImageJで画像を開きます。 ポリゴン ツールで傷跡のエッジをトレースします。 [分析] | [測定 ] をクリックして、この領域を測定します。
    注:瘢痕は、その変色と毛包の欠如によって識別できます。
  2. セグメントツールを使用して、傷跡の端から端までの長さを測定します。この長さを測定するには、[分析] | [測定] をクリックします。
  3. セグメントツールを使用して、写真内の1cmまたはその他の標準化された長さの単位の長さを測定します。この長さを測定するには、[分析] | [測定] をクリックします。
  4. スプレッドシートを使用して、 傷跡の面積 (ピクセル単位; px) を取得し、それを 傷跡の長さ (px の長さ) で割ります。その結果、平均傷跡の幅がピクセル単位で得られます。
  5. その結果を 、測定された長さの標準単位 (px length)で割ります。結果は、実験に使用された標準の長さ単位(cmなど)の単位での平均瘢痕幅になります。

結果

HTSプロトコルの効果的な使用を明確に示し、成功した「肯定的な」結果を特定するために、図3Aに示すようにモデルが確立されました。代表的な研究では、図3B、Cに示すように、図3B、Cに示すように、切開部全体に人間のようなレベルの機械的ひずみが誘発されるNo Stretch Control(n = 6)とMechanical Stretch HTSグループ...

ディスカッション

HTSマウスモデルは、メカノトランスダクションを介してHTSを誘導し、潜在的な治療法を開発するための費用対効果が高く再現性の高い方法です。モデルを効果的に使用するための初期学習曲線がありますが、プロトコルは、練習すれば、外科的トレーニングを受けなくても誰でも実行できます。このモデルを使用することで、研究者はHTSの形成と創傷治癒におけるメ...

開示事項

著者は、この記事の内容に関連する競合する利益やその他の対立はありません。

謝辞

この研究は、国立歯科・頭蓋顔面研究所(U24 DE026914)(G.C.G)およびPlastic Surgery Foundation Translational Research Grant(837107)(K.C.)が支援するCenter for Dental, Oral, and Craniofacial Tissue and Organ Regeneration Interdisciplinary Translational Project Awardsの支援を受けました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mL PYREX Griffin beakerMilipore SignmaCLS1000100
Aesculap Exacta mini trimmerAesculap
AutoClip SystemFine Surgical Instruments12020-00
BD brand isopropyl alcohol swabsFisher Scientific13-680-63
Buprenorphine SR (0.5 mg/mL)Buprenex, Indivior Inc.12496-0757-1
C57/BL6 females (6–8 weeks old)The Jackson Laboratory000664
Covidien sterile gauzeFisher Scientific2187
Covidien TelfaTM non-adherent padsFisher Scientific, Covidien1961
Dental surgical rulerDoWell Dental ProductsS1070
Depilatory cream (Nair Hair Remover Lotion)Church&Dwight, CVS339823
Ethanol 70% solutionFisher Scientific64-17-5
ExcelMicrosoft CooperationMicrosoft.comsoftware program 
ImageJImageJ, Wayne Rasbandimagej.netsoftware program 
Inhalation anesthesia systemVetEquip922130
Iris scissors 4½ in. stainlessMcKesson43-2-104
Isoflurane, USPDechra Veterinary Products17033-094-25
Kaka industrial MUB-1Kaka Industrial 173207Only necessary if there is no maker space or fabrication shop available 
Leone Rapid Palatal Expander- 13 mmGreat Lakes Dental Technologies125-004The key necessary to expand and cotnract the device will come with this product in the box
Liquid repellent drape 75 x 90 cm with adhesive hole 6 x 9 cmOmnia S.p.A.12.T4362
Medequip Depot Silk Black Braided Sutr 6-0 RxMedequip Depot D707N, Fisher ScientificNCO835822
Needle holder 5 in. with serrated jawsMcKesson43-2-842
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Puralube ophthalmic ointmentDechra, NDC17033-211-38
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Surgical skin markerMcKesson19-1451_BX
Tegaderm, 3 MVWR56222-191foam adhesive dressing 
Thermo-peep heating padK&H, Amazon
Tissue forceps 4¾ in. stainless 1 x 2 teethMckesson43-2-775
Vetbond (3 M)Saint Paul, MN1469SB

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